功能基因序列分析-郭燕-2014.8.3.ppt

1、淺談功能基因分析,郭燕 濕地工程技術(shù)研究所 2014-08-03,匯報(bào)內(nèi)容,已知功能基因,1,2,背景介紹,3,未知功能基因,4,討論,一 背景介紹,微生物功能基因組學(xué)研究包括微生物基因組內(nèi)每個(gè)基因的作用或功能，以及基因的調(diào)節(jié)及表達(dá)，旨在從整個(gè)基因組及其全套蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、功能、機(jī)理的高度去了解微生物生命活動(dòng)的全貌。 在細(xì)菌基因組中，既有編碼在極端環(huán)境下起催化作用酶的基因，也有編碼分解化學(xué)污染物酶的基因，這些基因在真核細(xì)胞是不存在的。通過(guò)微生物功能基因組學(xué)研究，還能發(fā)現(xiàn)藥物靶位和疫苗抗原。微生物基因的功能及表達(dá)研究結(jié)果也能為研究復(fù)雜生物的基因功能提供參考。 由于微生物的種類繁多，功能基因組研

2、究的內(nèi)容較豐富。 已有75種(株)微生物的基因組完成測(cè)序，160多種(株)微生物的基因組測(cè)序正在進(jìn)行中。,二 已知功能基因的鑒定_以PQQ為例,PQQ是一種氧化還原酶的輔酶，廣泛分布于植物、動(dòng)物、微生物及周圍環(huán)境中，具有多種生物學(xué)功能。 早在20世紀(jì)60年代，科學(xué)界開始對(duì)PQQ展開研究：先后在醋酸桿不動(dòng)桿菌、熒光假單胞菌、歐文氏菌（Erwinia）等屬中發(fā)現(xiàn)GDH含有一種相同的輔酶。它熱穩(wěn)定性好，能與親核分子如氨基酸、巰基、氨等相互作用。 應(yīng)用光譜、質(zhì)譜等技術(shù)，研究發(fā)現(xiàn)蘋果酸脫氫酶、乙醇脫氫酶也有這種輔酶，晶體結(jié)構(gòu)分析表明，該輔基是一個(gè)含有三個(gè)羧酸基團(tuán)的醌類，確定其結(jié)構(gòu)式為 4,5-二氫-4,

3、5-二氧-1氫-吡咯并（2,3-f）喹啉-2,7,9-三羧酸，命名為“吡咯喹啉醌 ”簡(jiǎn)稱PQQ。,PQQ 只能在某些革蘭氏陰性菌中合成，具有生物學(xué)功能如下：, 刺激細(xì)胞生長(zhǎng) 刺激微生物細(xì)胞生長(zhǎng)：縮短菌體的遲緩期，類似菌體必需生長(zhǎng)因子，隨著濃度增長(zhǎng)，加快菌體生長(zhǎng)速度，提高菌體細(xì)胞產(chǎn)量；縮短菌體的遲緩期，不影響菌體細(xì)胞的生長(zhǎng)速度。 刺激植物細(xì)胞生長(zhǎng)：刺激花粉萌發(fā)，其模式與刺激微生物生長(zhǎng)的模式大致相同，即通過(guò)縮短生長(zhǎng)停滯期以達(dá)到刺激植物生長(zhǎng)的目的。,PQQ能夠促進(jìn)煙草種子萌發(fā)，提高脂肪酶活性和種子呼吸速率， 還能夠通過(guò)促進(jìn)生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素合成，促進(jìn)分子水平基因調(diào)控，從而提高植物細(xì)胞新陳代謝而發(fā)揮促

4、進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用。 在冬小麥花退化高峰的孕穗期和生長(zhǎng)代謝旺盛期，噴灑PQQ 可以提高葉片中葉綠素含量，加快植物的光合作用，提高谷丙轉(zhuǎn)氨酶和硝酸還原酶的活性，從而調(diào)節(jié)植株體內(nèi)生理代謝功能，有益于改善植株?duì)I養(yǎng)供給，減少穗部小花敗育，提高麥穗結(jié)實(shí)率。 2008 年，Choi 等報(bào)道了一種植物根際促生長(zhǎng)細(xì)菌 ( plant growth promoting rhizobacteria，PGPR) Pseudomonas fluorescens B16，該菌株為合成 PQQ的野生型菌株，協(xié)和培養(yǎng)該菌與植物可以增加西紅柿花數(shù)量、植株高度、果實(shí)數(shù)量和果實(shí)總重量，而所有不能合成 PQQ 的突變型菌株則沒有此作

5、用效果。因此，推測(cè) PQQ 是 PGPR 發(fā)揮作用的重要原因之一。,例子,刺激人體細(xì)胞生長(zhǎng)：Naito 等報(bào)道低濃度 PQQ ( 0.00330 M)顯著增強(qiáng)人成纖維細(xì)胞 DNA 的合成，并且顯著增加細(xì)胞密度，相比之下，PQQ 的刺激作用優(yōu)于成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和胰島素等生長(zhǎng)因子，與上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的作用相當(dāng)； 但當(dāng)PQQ濃度達(dá)到7501500 M 時(shí)，DNA 合成受到抑制引起細(xì)胞死亡。國(guó)內(nèi)（熊順華等）也先后報(bào)道了適量濃度的 PQQ對(duì)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元和海馬區(qū)神經(jīng)元的生長(zhǎng)速度有促進(jìn)作用，但 PQQ 的濃度過(guò)高會(huì)產(chǎn)生毒性。, PQQ 是動(dòng)物生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖必需的營(yíng)養(yǎng)因子,作為賴氨酰氧化酶的輔助因子：K

6、asahara 和 Kato 在前人研究基礎(chǔ)上，通過(guò)比對(duì)酵母、果蠅以及小鼠參與賴氨酸代謝通路的同源蛋白，間接地證明了小鼠體內(nèi)的賴胺酰氧化酶是以PQQ 作為輔助因子，建議將 PQQ 作為一種新的 B族維生素。 然而，F(xiàn)elton、Anthony 和 ucker分別發(fā)表文章否定了 Kasahara 和 Kato 得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。ucker 等認(rèn)為，從藥理與營(yíng)養(yǎng)學(xué)角度來(lái)分析，PQQ 定義為一種維生素的證據(jù)還不足，只能說(shuō)它是一種重要的生物因子。因?yàn)椴煌锓N對(duì)于維生素的需求存在較大差異，例如，維生素 C 是人類、靈長(zhǎng)類生物必需的，但是鼠卻不需要。因此，對(duì)人類來(lái)說(shuō) PQQ 是否是一種維生素，需要進(jìn)一步研究

7、證實(shí)。, PQQ 對(duì)自由基有清除作用，可以保護(hù)機(jī)體減少氧化損傷,在正常生理?xiàng)l件下，生物體保持一種自穩(wěn)態(tài)，自由基的產(chǎn)生和清除維持動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，自由基產(chǎn)生過(guò)少或過(guò)多都會(huì)對(duì)機(jī)體健康產(chǎn)生影響。PQQ 能夠在沒有谷胱甘肽 ( GSH)參與下直接清除過(guò)量的自由基。PQQ 清除自由基的效力是抗壞血酸的50100 倍。如下3個(gè)方面： 保護(hù)心臟免受氧化損傷：PQQ 能夠清除由缺氧再灌注產(chǎn)生的 ROS( reactive oxygen species）， 顯著降低心臟中乳酸脫氫酶的釋放，在黃素還原酶催化作用下，催化產(chǎn)物還能夠降低血紅蛋白過(guò)氧化狀態(tài)，消除缺氧再灌注對(duì)心肌的損傷。Tao 等報(bào)道，PQQ 能夠抑制H2O

8、2 誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞 OS 的產(chǎn)生、線粒體膜電位的降低，降低氧化應(yīng)激、抑制線粒體功能的失活和保護(hù)大鼠心肌細(xì)胞等作用。,防止眼晶狀體損傷及肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化：白內(nèi)障的發(fā)生與自由基水平升高有關(guān)。PQQ能夠提高晶狀體中 GSH 水平防止氧化應(yīng)激對(duì)晶狀體的損傷，保證晶狀體代謝的正常進(jìn)行，從而避免了因晶狀體蛋白變性而發(fā)生的混濁，緩解白內(nèi)障癥狀。同樣的原理，PQQ 可以通過(guò)提高肝臟中GSH 水平，從而抑制肝臟內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化發(fā)生，促進(jìn)膽綠素通過(guò)膽小管向膽囊分泌，減少其在肝臟中的停留。 抑制化學(xué)發(fā)光及炎癥產(chǎn)生：化學(xué)發(fā)光是突發(fā)性氧化作用，PQQ 通過(guò)抑制突發(fā)性氧化作用及誘發(fā) OS 的失活抑制化學(xué)發(fā)光的作用；PQQ

9、亦可抑制炎癥的產(chǎn)生，將鼠爪中注射角叉藻膠，可引起溫度升高及局部水腫等炎癥反應(yīng)。如果先在小鼠腹腔注射 PQQ，然后注射角叉藻膠，可明顯發(fā)現(xiàn)局部水腫受到抑制，功效則與消炎痛 ( indomethacin) 相當(dāng) 。,抗氧化，保護(hù)肝臟損傷：PQQ 對(duì)由某些肝細(xì)胞毒素造成的肝損傷具有保護(hù)作用，在大鼠實(shí)驗(yàn)中，如由硫代乙酰胺、四氯化碳、D半乳糖胺等造成的肝損傷通過(guò)使用 PQQ可顯著降低肝臟血清膽紅素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶的水平但不影響肝臟的重量。 即使肝損傷已發(fā)生，PQQ 的作用仍十分明顯，健康大鼠的血糖、血尿氮等血、尿常規(guī)生化指標(biāo)亦不受影響。330 M 的GSH 和21M 的維生素 E 的作用與3 M 濃度 PQ

10、Q 的對(duì)肝臟的保護(hù)效果相同。,PQQ 發(fā)揮抗氧化作用的其他功效：乙醛是乙醇代謝的有害中間產(chǎn)物，也是乙醇中毒的重要原因。PQQ 通過(guò)加快乙醛氧化的速度來(lái)降低乙醛的含量，進(jìn)而降低小鼠乙醇中毒的危險(xiǎn)。PQQ 在保護(hù)植物方面同樣有功效，在冷脅迫條件下，可以利用 PQQ 減緩過(guò)氧化物歧化酶( SOD) 、抗壞血酸過(guò)氧化物酶 ( AsAPOD)活性，促使 GSH 含量的下降，從而一定程度上減輕低溫脅迫對(duì)黃瓜幼苗的傷害。, 提供神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用,促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)因子生成：PQQ 能夠促進(jìn)許多細(xì)胞合成和分泌 NGF，并且胞內(nèi)的NGF mRNA 濃度提高，PQQ 在NGF 轉(zhuǎn)錄前發(fā)揮促合成的作用。 保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)免

11、受有害物質(zhì)損傷：PQQ 對(duì)由6-OHDA 誘導(dǎo)構(gòu)建的帕金森模型的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 SH-SY5Y 的具有神經(jīng)毒性修復(fù)作用。PQQ 在治療中風(fēng)方面亦具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，Jensen 等對(duì)7 日齡大鼠腦缺氧/缺血模型的研究報(bào)道，損傷前30min 腹腔注射PQQ，可以顯著減少腦梗死范圍，并且不產(chǎn)生神經(jīng)行為副作用。 PQQ 作為一種具有優(yōu)良性能的神經(jīng)保護(hù)藥物，在老年癡呆癥、治療帕金森癥、中風(fēng)等方面具有開發(fā)前景。,小結(jié),PQQ 在自然界中廣泛分布，它不僅參與氧化還原反應(yīng)，同時(shí)還具有多種生物學(xué)功能，已有證據(jù)表明 PQQ 在增強(qiáng)動(dòng)物免疫功能、提高繁殖力等方面發(fā)揮重要的作用。PQQ 作為一種具有多種生理功能

12、的生物活性物質(zhì)，在炎癥、溶血性貧血、傳輸神經(jīng)興奮失調(diào)、肝病和骨質(zhì)疏松癥等疾病的治療方面具有很大的潛力，因此具有良好的藥用開發(fā)前景。目前主要靠化學(xué)方法合成 PQQ，其步驟繁雜，收率低，副產(chǎn)物多，后續(xù)處理困難，且成本高，產(chǎn)量低，價(jià)格昂貴，因此闡明其生物合成機(jī)理、研究 PQQ 的生物合成、構(gòu)建高產(chǎn)菌株具有重要意義。 為提高 PQQ 產(chǎn)量，篩選和分離新型PQQ 產(chǎn)生菌株將成為該領(lǐng)域重點(diǎn)研究的方向之一。,報(bào)道已知微生物菌屬如Pseudomonas、Erwinia等屬的一些菌株具有合成PQQ的基因。 PQQ 、有機(jī)酸和解磷菌的解磷作用密切相關(guān)，P. fluorescens B16, the PQQ 操縱子

13、由11個(gè)基因組成, pqqA, -B, -C, -D,-E, -F, -H, -I, -J, -K, and pqqM.,微生物功能基因序列分析方法,分析方法已知基因,1 拼接序列SeqMan,2 翻譯蛋白MEGA,設(shè)計(jì)引物-PCR擴(kuò)增-測(cè)序,3 比對(duì)蛋白序列NCBI,4 下載模式菌株,Another直接以核苷酸序列比對(duì),5 比對(duì)建樹MEGA,利用 SSCP 技術(shù)分析甘藍(lán)型油菜 功能基因序列差異,李媛媛等利用 DNA 單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strand conformation polymorphism,SSCP)技術(shù), 對(duì) 10 對(duì)功能基因特異性引物進(jìn)行多態(tài)性分析, 每對(duì)引物均檢測(cè)到

14、 1 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。 結(jié)果表明, SSCP 標(biāo)記能夠真實(shí)代表原始功能基因，甘藍(lán)型油菜功能基因序列在不同材料間高度保守，其遺傳變異類型主要來(lái)源于 SNP。,SSCP 檢測(cè)與分析,PCR 產(chǎn)物最先在 1.5% (W/V)的瓊脂糖凝膠上檢測(cè), 擴(kuò)增帶型明顯, 沒有拖尾, 并且比較明亮，就被用于 SSCP 分析。電泳時(shí), 溫度控制在 4左右,電壓恒定在 500 V。電泳完成后, 銀染和顯色； 回收片段及再擴(kuò)增； 克隆片段的測(cè)序及其序列分析 SSCP 分析：采用 6% (W/V)的非變性聚丙稀酰胺凝膠電泳，對(duì)上述 10 對(duì)引物的變性 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 SSCP分析, 每對(duì)引物 PCR 產(chǎn)物所形成的單

15、鏈在甘藍(lán)型油菜 SI-1300 和 Eagle 間均檢測(cè)到 1 個(gè)清晰的多態(tài)性位點(diǎn)。,差異片段與原序列的比較分析,隨機(jī)挑選 10 個(gè)功能分子標(biāo)記在非變性膠上的差異擴(kuò)增產(chǎn)物, 進(jìn)行回收、克隆、測(cè)序, 并利用 NCBI網(wǎng)站提供的 bl2seq 軟件, 對(duì)目標(biāo)片段與原始設(shè)計(jì)引物的序列進(jìn)行比較。,測(cè)序序列與所對(duì)應(yīng)的基因原始序列之間相似程度平均高達(dá) 98%，差異堿基數(shù)平均僅為 2.3 個(gè)，即 SSCP 標(biāo)記對(duì)功能基因進(jìn)行了真實(shí)擴(kuò)增。,noue 和 Nishio對(duì) SCAR、CAPS 和PCR-RF-SSCP 技術(shù)在檢測(cè)多態(tài)性效率方面的系統(tǒng)研究表明, 9%的序列經(jīng) SCAR 檢測(cè)有多態(tài)性, 32%的序列經(jīng) CAPS 檢測(cè)有多態(tài)性, 而在經(jīng) CAPS 分析沒發(fā)現(xiàn)多態(tài)性的序列中, 又有 52%的序列經(jīng) SSCP 檢測(cè)表現(xiàn)多態(tài)性, 充分證明 SSCP 檢測(cè)技術(shù)的高效性。,鑒定未知基因的功能是一項(xiàng)復(fù)雜的工作,需要多種技術(shù)綜合應(yīng)用。 未知功能基因的鑒定方法可分為兩大類：高通量的初步鑒定技術(shù)；另一類