（優(yōu)質(zhì)醫(yī)學(xué)）Cre-loxP、CRISPR-Cas9技術(shù)與病毒載體在基因敲除中的聯(lián)用.ppt

1、Cre-loxP、CRISPR-Cas9技術(shù)與病毒載體在基因敲除中的聯(lián)用,2,Content,第一節(jié)、Cre-loxP技術(shù) 第二節(jié)、 CRISPR-Cas9技術(shù) 第三節(jié)、病毒工具簡(jiǎn)介 第四節(jié)、組合應(yīng)用示例,3,基因操作技術(shù)一覽,4,Cre蛋白于1981年從P1噬菌體中被發(fā)現(xiàn)，屬于Int酶超基因家族。 Cre重組酶基因編碼區(qū)序列全長(zhǎng)1029bp, 編碼343個(gè)氨基酸, 38kDa, 單體蛋白。 Cre重組酶不僅具有催化活性，而且與限制酶相似，能特異地在兩個(gè)loxP位點(diǎn)間發(fā)生基因重組。 Cre重組酶無(wú)需借助任何輔助因子，可作用于多種結(jié)構(gòu)的DNA底物，如線形、環(huán)狀甚至超螺旋DNA。,loxP位點(diǎn)，是

2、locus of X-over P1的縮寫(xiě)，來(lái)自P1噬菌體。間隔序列決定loxP的方向，如下所示：,1. Cre-loxP技術(shù)簡(jiǎn)介,13bp 8bp 13bp ATAACTTCGTATA-NNNTANNN-TATACGAAGTTAT,Cyclization recombinase,5,1.1 Cre-loxP技術(shù)基本原理,6,1.2 Cre-loxP技術(shù)應(yīng)用,7,與組織特異性啟動(dòng)子結(jié)合應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)Cre轉(zhuǎn)基因的空間控制,1.2 Cre-loxP技術(shù)應(yīng)用組織特異性應(yīng)用,8,與誘導(dǎo)性表達(dá)啟動(dòng)子結(jié)合應(yīng)用，對(duì)Cre轉(zhuǎn)基因的表達(dá)進(jìn)行控制,MerCreMer重組蛋白,1.2 Cre-loxP技術(shù)應(yīng)用可誘導(dǎo)性

3、應(yīng)用,9,1.3 Cre-loxP技術(shù)仍有不足之處,10,傳統(tǒng)的基因打靶技術(shù)主要依賴(lài)于基因同源重組，利用設(shè)計(jì)的同源臂替代靶基因片段，從而達(dá)到目的。 但是同源重組在細(xì)胞中的發(fā)生概率極低，而且步驟比較復(fù)雜、耗時(shí)間、費(fèi)用也比較高。,非同源末端連接（non homologous end joining, NHEJ）,2. CRISPR-Cas9技術(shù),11,均由自然界存在的核酸酶系統(tǒng)改造而來(lái) 均具有識(shí)別核酸堿基特異性的結(jié)構(gòu)域 作用機(jī)制：均通過(guò)在細(xì)胞基因組創(chuàng)造雙鏈斷裂缺口， 從而誘發(fā)細(xì)胞自身修復(fù)機(jī)制完成基因修飾,新3代基因組編輯工具,12,2.1 CRISPR-Cas9技術(shù)來(lái)源,13,N代表任意DNA堿基

4、,Guide RNA: crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通過(guò)堿基配對(duì)與 tracrRNA （trans-activating crRNA ）結(jié)合形成 tracrRNA/crRNA 復(fù)合物。通過(guò)人工設(shè)計(jì)這兩種 RNA，可以改造形成具有引導(dǎo)作用的sgRNA （short guide RNA ） Cas9: 復(fù)合物引導(dǎo)核酸酶 Cas9 蛋白在與 crRNA 配對(duì)的序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈 DNA。HNH結(jié)構(gòu)域剪切配對(duì)的部分， Ruvc結(jié)構(gòu)域剪切未配對(duì)的鏈。,DNA、RNA和蛋白質(zhì)聚合物,2.2 CRISPR-Cas9系統(tǒng)組成,14,1.靶基因分析：明確CDS外顯子部分； 2.sgRN

5、A位點(diǎn)設(shè)計(jì)：確定待敲除位點(diǎn)，對(duì)于蛋白編碼基因，如果該蛋白具有重要結(jié)構(gòu)功能域，可考慮將基因敲除位點(diǎn)設(shè)計(jì)在編碼該結(jié)構(gòu)域的外顯子；如果不能確定基因產(chǎn)物性質(zhì)，可選擇將待敲除位點(diǎn)放在起始密碼子ATG后的外顯子上。如果是microRNA，可以將待敲除位點(diǎn)設(shè)計(jì)在編碼成熟microRNA的外顯子或在編碼成熟microRNA的外顯子的5和3側(cè)翼序列。 3.Cas9載體構(gòu)建：根據(jù)sgRNA序列，設(shè)計(jì)引物，合成帶粘性末端的雙鏈片段。對(duì)表達(dá)載體先進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切，得到線性化載體，再把前面得到的雙鏈片段連接入表達(dá)載體。再進(jìn)行感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的鑒定； 4.Cas9載體活性檢測(cè)：轉(zhuǎn)染細(xì)胞，采用特異性片段擴(kuò)增

6、后進(jìn)行的T7E1酶切處理，進(jìn)行重組效率的檢測(cè)。,2.3 CRISPR-Cas9技術(shù)流程,15,1.CRISPR-Cas9系統(tǒng)的可用位點(diǎn)更多：理論上基因組中每8個(gè)堿基就能找到一個(gè)可用CRISPR-Cas9進(jìn)行編輯的位點(diǎn)，而TALEN和ZFN系統(tǒng)則在數(shù)百甚至上千個(gè)堿基中才能找到一個(gè)可用位點(diǎn)； 2.CRISPR-Cas9系統(tǒng)更具有可拓展性：例如可以通過(guò)對(duì)Cas9蛋白的修飾，讓它不切斷DNA雙鏈，而只是切開(kāi)單鏈，這樣可以大大降低切開(kāi)雙鏈后帶來(lái)的非同源末端連接造成的染色體變異風(fēng)險(xiǎn)；此外還可以將Cas9蛋白連接其他功能蛋白，從而在特定DNA序列上研究這些蛋白對(duì)細(xì)胞的影響； 3.CRISPR-Cas9系統(tǒng)的

7、使用極為方便，只需要簡(jiǎn)單的幾步就能完成，幾乎任何實(shí)驗(yàn)室都可以開(kāi)展工作，因此省時(shí)省力； 4.可同時(shí)對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行操作而ZFNs和TALEN兩項(xiàng)技術(shù)則難以實(shí)現(xiàn)這種效果。 5. 多種功能性蛋白都可以通過(guò)與Cas9蛋白融合，然后利用gRNA的靶向作用結(jié)合到dsDNA的任意位點(diǎn)，發(fā)揮人們預(yù)期的功能。,2.4 CRISPR-Cas9技術(shù)優(yōu)勢(shì),16,3. 病毒載體,17,3.1 病毒載體比較,18,3.1 病毒載體比較,19,組成型啟動(dòng)子-感染特性決定表達(dá)分布,3.2 病毒載體應(yīng)用,20,特異性啟動(dòng)子-空間和時(shí)間精細(xì)表達(dá),3.2 病毒載體應(yīng)用,21,4 組合應(yīng)用示例Cre-loxP與病毒工具結(jié)合,22,“條件性基因激活”模式,4.1 Cre-loxP與病毒工具結(jié)合應(yīng)用,23,4.1 Cre-loxP與病毒工具結(jié)合應(yīng)用,24,B,4.2 Cas9系統(tǒng)與病毒工具結(jié)合應(yīng)用,25,4.2 Cas9系統(tǒng)與病毒工具結(jié)合應(yīng)用,26,4.3 Cre-loxP、CRISPR-Cas9與病毒結(jié)合應(yīng)用,Cre-dependent Cas9 mice,27,思考