第五章 cDNA文庫的構建.ppt

1、第五章 cDNA文庫的構建和篩選,以mRNA為模板反轉錄出的DNA稱cDNA。,1. cDNA,mRNA,cDNA,3,3,5,5,反轉錄酶,引物,2. cDNA library,利用某種生物的總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體連接，轉入細菌細胞中進行保存和擴增，稱cDNA文庫。,cDNA文庫的特點,1. 基因特異性 來自結構基因，僅代表某種生物的一小部分遺傳信息，且只代表正在表達的基因的遺傳信息：2. 器官特異性 不同器官或組織的功能不一樣，因而有的結構基因的表達就具有器官特異性，故由不同器官提取的mRNA所組建的cDNA文庫也就不同。,3. 代謝或發(fā)育特異性 處于不同代謝階段（

2、或發(fā)育階段）的結構基因表達亦不相同。 4. 不均勻性 在同一個cDNA文庫中，不同類型的cDNA分子的數(shù)目是大不相同的，盡管它們都是由單拷貝基因轉錄而來的。 5. 各cDNA均可獲得表達,建立cDNA文庫的一般程序,1. mRNA的分離與純化載體DNA片段的制備。 2.雙鏈cDNA 的合成。 1）單鏈cDNA 的合成：反轉錄法 2）第二條cDNA 的合成：堿解或酶解（RNaseH） 法除去RNA分子 3. cDNA克隆載體的制備。 4. ds- cDNA與載體DNA 相連。 5. 重組cDNA分子的導入和克隆。,第一節(jié) 將RNA轉變成cDNA,一、mRNA的分離純化 總RNA的提取 RNA不穩(wěn)

3、定：核糖環(huán)上的2OH促使對 磷酸二酯鍵的親水性攻擊。 異硫氰酸胍法：異硫氰酸胍可裂解細胞，使RNA與蛋白質分離，將RNA釋放到溶液中。加入苯酚、氯仿，可促使RNA進入水相，離心后可形成水相層和有機層，這樣RNA與仍留在有機相中的蛋白質和DNA分離開。水相層（無色）為RNA，有機層（黃色）為DNA和蛋白質。,RNA酶的降解,RNA分子不穩(wěn)定,RNA易遭降解,RNA分子結構,RNA抽提,2、mRNA的分離純化,mRNA只占總RNA的1%-5%。 原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴，將mRNA從總RNA中分離純化。 方法： 寡聚（dT）-纖維素柱層析法。,mRNA純化,二、cDNA合成,cD

4、NA的合成包括第一鏈和第二鏈cDNA的合成。 第一鏈cDNA的合成是以mRNA為模板，反轉錄為cDNA，有反轉錄酶催化，該酶合成DNA時需要引物引導，常用引物是oligo dT。 第二鏈合成是以第一鏈為模板，由DNA聚合酶催化。,cDNA的第一鏈合成,反轉錄：以RNA為模板，合成DNA。與通常轉錄過程中遺傳信息流從DNA到RNA的方向相反。 禽類成髓細胞瘤病毒（AMV)的反轉錄酶 一類能引起鳥類等動物白血病、肉瘤以及其它腫瘤的病毒。 其反轉錄酶由一個亞基和一個亞基組成，有二種酶活力。 1）RNA指導的DNA聚合酶活力。 2）RNaseH酶活力，水解RNADNA雜種分子中的RNA，可沿35和53

5、兩個方向起外切酶作用。,莫洛尼氏鼠白血病病毒（MMLV)的反轉錄酶,此酶是一條單一的多肽鏈，有RNA聚合酶的活性，RNaseH的活性減弱。,引物,1、Oligo dT引物 2、隨機引物（六聚體寡核苷酸） 這種非特異性引物可沿著mRNA多個位點結合 3、特異性引物。,反轉錄酶,mRNA,cDNA,3,5,5,AAAAAAA,TTTTTTT,在總的RNA中可作為具有mRNA的特異引物,文庫不能完全包含基因編碼序列,產(chǎn)生一個大的具有特定序列的 cDNA文庫,cDNA產(chǎn)物可能是小的，不具有多聚腺苷的模板也被可利用,可產(chǎn)生大量特定基因的cDNA文庫,產(chǎn)生的cDNA文庫應用范圍有限,第一鏈合成過程,mRN

6、A,cDNA,3,3,5,5,反轉錄酶,引物,mRNA,cDNA第一鏈,3,3,5,5,引物,cDNA第一鏈,3,5,引物,或RNaseH,堿,第二鏈合成,剩下的cDNA單鏈的3末端可能形成一個彎回來的雙鏈發(fā)卡結構（機理不明），可成為合成第二條cDNA鏈的引物。用DNA聚合酶合成第二鏈DNA。,cDNA第一鏈,5,cDNA第二鏈合成,DNA聚合酶,cDNA第一鏈,cDNA第二鏈,5,3,用核酸酶S1可以切掉發(fā)卡結構（但這會導致cDNA中有用的序列被切掉）。,核酸酶S1,cDNA第一鏈,cDNA第二鏈,5,3,cDNA第一鏈,cDNA第二鏈,5,3,5,3,cDNA 合成,缺點：合成效率低;1%

7、 mRNA能合成cDNA。,改進,RNase H酶能識別mRNA-cDNA雜交分子中的mRNA，并將其降解成許多小片斷。 小片斷正好成為DNA聚合酶的引物，用來合成岡崎片斷。 DNA聚合酶I能除去引物并修補后再使用DNA連接酶連成一整條DNA鏈。,mRNA,cDNA,3,5,反轉錄酶,引物,mRNA,cDNA第一鏈,3,5,引物,mRNA,cDNA第一鏈,3,5,mRNA,mRNA,DNA 聚合酶,DNA 聚合酶,cDNA第二鏈,cDNA第一鏈,3,RNaseH,DNA ligase,去引物,cDNA末端修飾,借助末端轉移酶給載體和雙鏈cDNA的3端分別加上幾個C或G，成為粘性末端。 在雙鏈c

8、DNA末端接上人工接頭，即可與載體連接，轉入受體菌。,接上人工接頭,粘性末端,CCC,CCC,末端轉移酶,加人工接頭,三、cDNA克隆載體,如果用功能測定來篩選目的基因，可用質粒載體來構建cDNA的表達文庫。 如果通過分子雜交或抗體篩選目的基因，可用噬菌體載體構建cDNA文庫。 噬菌體載體 Zap cDNA 載體,ZapcDNA 載體,優(yōu)點： 1、高的轉染效率 2、可在體內(nèi)用M13輔助噬菌體將其變?yōu)檎婧松锏馁|粒表達載體。,含有一個真核啟動子,ZapcDNA載體的噬菌粒營救,第二節(jié) cDNA文庫的篩選,表達分析 核酸原位雜交 1、已知氨基酸序列的相關簡并密碼子探針； 2、純化蛋白質的相應抗體探

9、針； 3、差異表達的扣除cDNA探針。,一、簡并寡核苷酸探針,簡并探針：是指代表編碼單個氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。為了增加特異性,可以參考密碼子使用表,根據(jù)不同生物的堿基使用偏好,減少簡并性。 在探針庫中，只有一種與目的基因完全互補。 一般為17個核苷酸，序列相同，堿基組成不同。 雜交時借助一定濃度氯化四甲銨控制解鏈溫度（Tm)。,操作過程,簡并探針的假陽性,由于探針庫中只有一種是與目的基因完全互補的，其它的探針有可能與不相關的片斷雜交，產(chǎn)生假陽性信號。 方法： 1、制備“猜測體探針” 2、PCR猜測體技術,解決方法：,1）制備“猜測體探針” 一種人工合成的用于分離克隆基因的

10、低簡并性的寡核苷酸探針，其核苷酸序列是根據(jù)特定物種當中某種已知蛋白質的密碼子使用頻率，同時又采納了根據(jù)猜測最可能在目的基因中出現(xiàn)的密碼子資料，選擇含有密碼子簡并程度最低的蛋白質區(qū)段進行合成。 較長的唯一的寡核苷酸序列，它能夠大范圍的卻不能夠完全的同靶序列互補。,2）PCR猜測體技術,步驟： 1、根據(jù)末端32個氨基酸序列，設計PCR簡并引物； 2、以cDNA為模板；對目的基因特異性擴增； 3、產(chǎn)物連接到載體上克隆，用唯一猜測體探針雜交 ，選擇陽性克隆； 4、分離的克隆中部為32氨基酸序列，兩側為引物序列； 5、用這段插入序列為探針，篩選噬菌體cDNA文庫。,根據(jù)末端32個氨基酸序列，設計PCR簡

11、并引物，以cDNA為模板，進行擴增,用猜測探針雜交篩選陽性克隆,PCR-猜測體探針,二、抗體探針,利用免疫學的原理，檢測克隆基因的表達產(chǎn)物。,抗體鑒別陽性克隆,用專門設計的表達載體，將真核基因編碼的蛋白質在大腸桿菌中實現(xiàn)表達，通過免疫化學法進行檢測。,三、差示雜交,需要兩種不同的細胞群體（目的基因正常表達、目的基因不表達），分別制備兩種不同mRNA提取物，以兩種總mRNA探針（或以相應的cDNA作探針)平行雜交，對有表達目的基因的細胞總mRNA構建的克隆文庫進行篩選。,差別雜交的局限性： 1.雜交靈敏度低，對于低峰度的mRNA尤為明顯。 2.工作量大，重復性差，兩套平行濾膜之間的DNA保有量有

12、差別，導致雜交信號不一致。,四、扣除雜交,原理：去除普遍共同存在的、或是非誘發(fā)產(chǎn)生的cDNA序列，從而使欲分離的目的基因的序列得到有效的富集。,羥基磷灰石柱,結合單鏈DNA-RNA或DNA-DNA雙鏈，不結合單鏈DNA,操作：,從表達A蛋白和不表達A蛋白的組織細胞中分別提取和分離總mRNA。 將表達A蛋白的總mRNA合成cDNA第一鏈；作為探針群同不表達A蛋白的總mRNA雜交成cDNA-mRNA雙鏈。 不能雜交的cDNA即為特異表達的A基因的cDNA單鏈。 用羥磷灰石柱收集單鏈cDNA，合成為雙鏈DNA進行擴增、克隆、測序。,A,A,A組織,B組織,總mRNA（A）,總mRNA（B）,含蛋白A

13、的mRNA,不含蛋白A的mRNA,總cDNA第一鏈,A,雜交,內(nèi)含蛋白A 的cDNA,羥磷灰石柱,過柱,吸收RNA-DNA,羥磷灰石柱,B,A,PCR,cDNA文庫,分離缺失突變的目的基因,第三節(jié) cDNA表達文庫的功能篩選,一、蛋白質活性分析 1、真核的表達文庫組成混合池，轉染動物細胞，鑒定目的基因的功能，篩選出目的基因的克隆重組體。 2、功能性探針篩選噬菌體表達文庫。 3、定向克隆cDNA庫，體外轉錄mRNA, 再將其注導入適當?shù)募闹骷毎?，分析表達蛋白質功能。,二、酵母雙雜交系統(tǒng),又叫相互作用陷阱，有效的分離能與已知的靶蛋白相互作用的蛋白質的編碼基因。 應用范圍： 鑒定新的蛋白與蛋白相互作

14、用； 鑒定蛋白級聯(lián)底物 ； 鑒定突變對蛋白與蛋白結合的影響； 在已知的相互作用中鑒定干擾蛋白質。,基本原理：,許多真核生物的轉錄激活因子都是由兩個結構上可以分開的、功能上相互獨立的結構域組成； 應用重組DNA技術，可以將來自同一個轉錄因子的、或者兩種不同轉錄因子的結構域分開，分開的兩種結構域在體內(nèi)重新組裝成具有功能的轉錄因子，從而激活UAS（上游激活序列）下游啟動子調(diào)節(jié)的報告基因的表達。,例：,釀酒酵母的半乳糖苷酶基因（lacZ)的轉錄激活因子GAL4，在N端1147位氨基酸區(qū)段有一個DNA結合域（DNA-BD）；在C端768881位氨基酸區(qū)段有一個轉錄激活域（AD），DNA-BD能識別上游激

15、活序列（USA)并與之結合；AD通過同轉錄機制中的其它成份之間的結合作用啟動USA下游基因進行轉錄。 用DNA重組技術將它們分開，即使在同一個寄主中表達，它們不能激活lacZ基因進行轉錄。,組成元件,1. 用于篩選的報告基因lacZ（寄主基因組內(nèi)）； 2. pGBT9(DNA-BD載體)：插入了BD和 誘 餌基因； 3. pGAD424(AD載體)：插入AD基因和待測的靶蛋白 基因。 外源基因都按正確的取向和讀碼結構插入在載體的MCS內(nèi)，表達的靶蛋白和誘餌蛋白分別會同BD和AD之間產(chǎn)生融合作用，形成雜種蛋白質。,寄主菌株：剔除掉GAL4基因的釀酒酵母,酵母雙雜交文庫篩選策略,優(yōu)點：,快速獲得相

16、互作用蛋白的基因； 只需單一步驟的質粒構建； 在體內(nèi)鑒定蛋白的相互作用； 弱小的，暫時的相互作用也能鑒定； 能在整個時間段積聚弱小的相互作用信號。,缺點：,(1) 雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細胞核內(nèi),而許多蛋白間的相互作用依賴于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等,這些反應在細胞核內(nèi)無法進行。 (2) 容易出現(xiàn)“假陽性”。 通常由以下原因造成: prey蛋白的非特異性結合； 無需與誘餌蛋白結合就能誘導報告基因的轉錄。,三、cDNA噬菌體展示,將編碼特異蛋白的基因序列插入噬菌體基因組，并使之與噬菌體外殼蛋白編碼基因相融合。重組噬菌體侵染宿主細菌后，復制形成大量帶有雜合外殼蛋白的噬菌體顆粒，

17、直接用于捕獲靶蛋白庫中與外源蛋白質相互作用的蛋白質。,PIII,基因型,表達型,實驗策略,構建一個含靶蛋白的噬菌粒載體 M13助噬菌體 供體大腸桿菌（寄主細胞）,篩選方法,被展示的多肽或蛋白可以保持相對獨立的空間結構和生物活性，以利于靶分子的識別和結合，此叫“多肽文庫”。 將靶蛋白分子固定于固相上，與“肽庫”經(jīng)過一定時間孵育后，洗去未結合的游離噬菌體，然后洗脫與靶分子結合吸附的噬菌體，收集并感染宿主細胞后經(jīng)繁殖擴增，進行下一輪洗脫。 經(jīng)過3輪5輪的“吸附-洗脫-擴增”后，與靶分子特異結合的噬菌體得到高度富集。,常用的免疫抗體,優(yōu)點,淘選的高效率使得在極低的存在水平下，可挑選到高親和力噬菌體；

18、所挑選到的噬菌體可在微量存在的情況下，通過感染細菌得到富集； 展示的多肽或蛋白質與其包含在噬菌體內(nèi)部的基因密碼的連接，使得結合肽或蛋白質的序列分析既快速又簡便。,第四節(jié) 用克隆cDNA作為反應物,一、RNA印跡 二、RNase 保護實驗 三、核連綴轉錄分析,二、RNase 保護實驗,RNA酶保護試驗(RPA) 是一種利用反義RNA探針與基因表達產(chǎn)物進行液液雜交，對RNA進行定性定量分析的有效方法 向待測RNA溶液中加入過量的反義RNA探針，互補的部分形成RNARNA雜交分子經(jīng)RNase選擇性水解去除未形成雜交雙鏈的單鏈測定未被RNase水解的RNA探針的長度及含量，即可對待測RNA進行定量和定性析 RPA靈敏度極高，由于用RNase水解RNARNA雜交反應中，由單鏈RNA產(chǎn)生的假帶少。,反義RNA探針的制備,反義RNA:與mRNA互補的RNA分子, 也包括與其它RNA互補的RNA分子。 將外源DNA片段插入載體，載體在MCS兩側帶有啟動子，在RNA聚合酶作用下可以進行RNA轉錄，添加-32P-CTP，則DNA兩條鏈中的一條為模板轉錄生成RNA。所合成mRNA均摻入同