《克隆抗體的制備》PPT課件.ppt

1、抗體制備,多克隆抗制備 單克隆抗制備,動(dòng)物產(chǎn)生抗體的機(jī)理,抗原（非自己的物質(zhì)）免疫動(dòng)物 激活免疫B細(xì)胞 轉(zhuǎn)化成漿細(xì)胞 分泌特異性的抗體,單克隆抗體制備原理,-,-,-,-,-,單克隆抗體雜交瘤技術(shù)基本流程,單克隆抗體的制備步驟,1.免疫原的制備 ： 完全抗原：病毒、細(xì)菌、真菌等微生物和蛋白質(zhì)等分子量大于5000Da生物物質(zhì) 半抗原：多糖、藥物、激素、肽類(lèi)等分子量小于5000 Da 物質(zhì) 半抗原需與BSA、OA等載體交聯(lián)后成完全抗原才能刺激動(dòng)物產(chǎn)生可應(yīng)用的高效價(jià)的抗體,2.免疫動(dòng)物,選擇體重1820g BALB/C 雌性小鼠，用制備抗原免疫。50100ug抗原/只與等體積福氏完全佐劑混合，充分乳

2、化后，經(jīng)背腹部皮下多點(diǎn)注射0.5ml每只，間隔3周，取與一免等量抗原和等體積的福氏不完全佐劑充分乳化后，第二次皮下多點(diǎn)注射0.5ml每只，過(guò)3周后用加倍劑量的抗原進(jìn)行腹腔注射，3天后取脾細(xì)胞進(jìn)行融合。 一只兔子每次的免疫劑量：細(xì)胞抗原不低于1x107 ；可溶性抗原100ug1mg；合成抗原為2mg（半抗原約為20200ug），選用皮內(nèi)、皮下、肌肉、靜脈、或淋巴結(jié)內(nèi)途徑進(jìn)行免疫，一般抗原免疫34次，合成抗原免疫6次以上，兩次免疫間隔時(shí)間3周,3.細(xì)胞融合,取上述免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞（SP2/0）按5-10：1的比例，在無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中混勻，1500rpm離心5min，

3、去除培養(yǎng)基，用50% PEG（Sigma）作為融合劑，在37下水浴下加入0.5-0.7ml，使其融合2min，用無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止融合后1500rpm離心5min，沉淀用HAT培養(yǎng)基懸浮，分裝到96孔含有飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞板中，37，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)。,4.雜交瘤細(xì)胞及陽(yáng)性孔的篩選,細(xì)胞培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)5天后，用HAT培養(yǎng)基換液一次，第10天用HT培養(yǎng)基換液，等到融合細(xì)胞覆蓋孔底10%-50%時(shí)，常規(guī)間接ELISA方法篩選陽(yáng)性孔，共獲50多個(gè)對(duì)上述抗原有反應(yīng)的陽(yáng)性孔。,5.陽(yáng)性孔的特異性檢測(cè)及特異性陽(yáng)性孔的克隆,陽(yáng)性孔的特異性鑒定采用間接ELISA方法，用包被液稀釋成

4、110ug/mL的抗原100ul/孔包被ELISA板，4過(guò)夜，使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗滌三次后用110的脫脂奶粉或13 BSA或36牛血清封閉30-60min;加入陽(yáng)性孔培養(yǎng)上清100ul/孔，37 12 小時(shí)；PBST洗滌三次后加入按說(shuō)明書(shū)稀釋10000倍的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗鼠IgG二抗（Sigma公司）100ul/孔，37 12小時(shí)，PBST洗滌四次后，用OPD-H2O2底物顯色，2mol/L H2SO4終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀讀取OD492的值，以與陰性O(shè)D值比值大于2.1為陽(yáng)性。獲分別對(duì)上述抗原有特異性反應(yīng)的陽(yáng)性孔。篩選出的特異性陽(yáng)性孔用常規(guī)的有限稀釋法克隆，獲對(duì)上述抗原有特

5、異性反應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞株。細(xì)胞株進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)，用于制備單抗腹水和液氮凍存。,陽(yáng)性孔的檢測(cè),雜交瘤細(xì)胞的凍存,雜交瘤細(xì)胞通常用含有8-10%的二甲亞砜和20小牛血清的培養(yǎng)基凍存于液氮中，在液氮中細(xì)胞可以保存多年，在-80中可以作3-6個(gè)月短期保存。凍存細(xì)胞需要緩慢降溫，復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)需快速升溫，這樣可以確保細(xì)胞有較高的存活率。,6.單克隆抗體腹水制備及純化,取8周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷（Sigma），7-10天后腹腔注入5-10105個(gè)雜交瘤細(xì)胞，注射后7-10天可見(jiàn)小鼠腹部明顯膨大，采取腹水，2000rpm離心3min，收集上清液，即為單克隆抗體腹水。取1倍體積腹

6、水加2倍體積0.06M PH4.8醋酸緩沖液稀釋?zhuān)有了幔?0ul/ml腹水），室溫下邊加邊攪拌，4澄清1小時(shí)，12000rpm離心20min，收集上清，再用50%飽和硫酸銨沉淀免疫球蛋白，4放置2小時(shí)，3000rpm離心20min，沉淀用2倍體積的PBS溶液溶解，在4流動(dòng)透析24小時(shí)后即獲純化的腹水抗體，-70保存。,7.單克隆抗體的亞類(lèi)鑒定和腹水效價(jià)測(cè)定,將單抗腹水與Sigma公司的標(biāo)準(zhǔn)抗BALB/C 小鼠IgA, IgG1,IgG2a, IgG2b、IgG3,IgM抗體，作雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。 ELISA方法 用常規(guī)間接ELISA方法檢測(cè)單抗腹水效價(jià)，腹水效價(jià)在105107之間的可用于實(shí)際

7、應(yīng)用。,單克隆抗體和多克隆抗體的比較,免疫技術(shù),原理：抗體與抗原表位的特異性結(jié)合反應(yīng)，并利用酶與底物的顯色反應(yīng)、金顆粒、同位素、熒光素來(lái)間接顯示,常見(jiàn)的幾種免疫技術(shù),酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA） 1971年Engvall和Perlman 第一次建立了 ELISA檢測(cè)方法，使對(duì)抗原和抗體的檢測(cè)和定量可以通過(guò)簡(jiǎn)單的顏色反應(yīng)實(shí)現(xiàn)（Engvall Hema et al., 2003）。與單純的PCR檢測(cè)相比，它能提高檢測(cè)的特異性，減小污染的可能，而且省卻了提取RNA的步驟，降低了檢測(cè)的成本，是一種快速有效的方法。與ELISA檢測(cè)相比，可以直接從病汁液中捕獲病毒粒子，起到了濃縮和純化病毒的作用，又利用PCR技術(shù)放大了檢測(cè)的靈敏度。Jacobi等比較了ELISA和IC-RT-PCR對(duì)