血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)測(cè)定(賴(lài)氏法)

1、授課對(duì)象：06級(jí)檢驗(yàn)1-5班 課 時(shí)：2學(xué)時(shí)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）測(cè)定（賴(lài)氏法）目 標(biāo)：1.掌握賴(lài)氏法測(cè)血清ALT的原理及注意事項(xiàng) 2.掌握試劑的配制熟練地制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 3.規(guī)范地進(jìn)行ALT測(cè)定 4.了解血清ALT測(cè)定的臨床意義實(shí)驗(yàn)用品：配制試劑用的各種器皿（燒杯、容量瓶、電爐、分析天平等）、37水浴箱、 721型風(fēng)光光度計(jì)、坐標(biāo)紙等 原理：丙氨酸和-酮戊二酸在血ALT的作用下生成丙酮酸及谷氨酸，在酶反應(yīng)達(dá)到規(guī)定時(shí)間時(shí)，加入2.4-二硝基苯肼-鹽酸溶液以終止反應(yīng)。生成的丙酮酸與入2.4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸入2.4二硝基苯腙，苯腙在堿性條件下顯紅棕色。根據(jù)顯色之深淺，求得血清中丙

2、氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活力。試劑：1. 0.1molPH7.4磷酸鹽緩沖液 稱(chēng)取磷酸氫二鈉（Na2HPO4 AR）11.928g,磷酸二氫鉀（KH2PO4 AR）2.176g，加少量蒸餾水溶解并稀釋至1000mL。2. ALP基質(zhì)液 稱(chēng)取DL丙氨酸CHCH（NH）COOH1.79g，-酮戊二酸COOH（COCOOH）29.2mg于燒杯中，加入0.1mol/L PH7.4磷酸鹽緩沖液80mL,煮沸溶解后待冷，用摩爾NaOH溶液調(diào)節(jié)PH至7.4（約加入0.5ml），再用0.1mol/LPH7.4磷酸鹽緩沖液稀釋至100mL,混勻，加氯仿數(shù)滴，置冰箱保存數(shù)周。31mmol/L2.4-二硝基苯肼溶液 稱(chēng)取2.

3、4-二硝基苯肼（NO）CHNHNH AR19.8mg，用10mol/L HC110mL溶解，然后加蒸餾水至100mL，置棕色瓶?jī)?nèi)，冰箱保存。40.4mol/L NaOH溶液。52mmol/L丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液 精確稱(chēng)取丙酮酸鈉CHCOCOONa AR22.0mg于100mL容量瓶中，加0.1mol/L PH7.4磷酸鹽緩沖液至刻度。此液應(yīng)新鮮配制，不得久放。操作：血清ALT測(cè)定步驟（賴(lài)氏法）加入物（mL）RB血清0.10.1ALP基質(zhì)液0.5混勻，置37oC水浴30min2.4-二硝基苯肼0.50.5ALP基質(zhì)液0.5混勻，置37oC水浴20min0.4mol/L NaOH5.05.0將上述兩管混勻

4、，10min后，用蒸餾水調(diào)零，=505nm比色讀取各管吸光度值，用測(cè)定管A-對(duì)照管A，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得ALT活力單位。血清ALT測(cè)定步驟（賴(lài)氏法）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：加入物（ml）0123452mmol/L丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液00.050.100.150.200.25ALP基質(zhì)液0.50.450.400.350.300.250.1mol pH7.4磷酸鹽緩沖液0.10.10.10.10.10.1混勻，置37oC水浴30min2.4-二硝基苯肼溶液0.50.50.50.50.50.5混勻，置37oC水浴20min0.4mol/L NaOH5.05.05.05.05.05.0相當(dāng)于ALT單位028579715020

5、0混勻，10min后，用蒸餾水調(diào)零，=505nm比色讀取各管吸光度值，將各管之系光度減去0號(hào)管吸光度值后，以吸光度為縱坐標(biāo)，各管相應(yīng)的ALT單位為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果報(bào)告：被檢者血清ALTU35U 報(bào)告者 年月日臨床意義：1賴(lài)氏法的酶活力單位是用卡門(mén)法所測(cè)出的酶活力單位相當(dāng)于用本法所生成的丙酮酸量的相關(guān)系數(shù)套用卡門(mén)單位而來(lái)，卡門(mén)單位的定義：在規(guī)定表件下（血清1ml，反應(yīng)液總量3ml，在25oC下作用1min，用內(nèi)徑1cm 的比色杯），測(cè)定340nm波長(zhǎng)處吸光度減少值（A），每減少0.001為一個(gè)酶活力單位。2血清對(duì)照管吸光度基本相同，因此同一批標(biāo)本只做23個(gè)血清對(duì)照管求其平均即可。亦可以空白管替代對(duì)照管。但脂血、溶血和黃疸血清應(yīng)單獨(dú)做對(duì)照管。3. 測(cè)定結(jié)果超過(guò)200卡門(mén)單位時(shí)，應(yīng)將血清稀釋后在進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。4. 酶測(cè)定中，溫度、時(shí)間對(duì)酶的活力影響很大，故應(yīng)控制好測(cè)定時(shí)的溫度（要求準(zhǔn)確到370.5oC），并準(zhǔn)確掌握保溫時(shí)間。5. 配制底物液時(shí)，如改用改L型丙氨酸，則應(yīng)按上法減半量用（因ALT只作用與L-型丙氨酸）。6. 丙酮酸鈉的純度，對(duì)曲線有明顯影響，純度低曲線斜率就低，使查得的酶活力單位顯著增高。故應(yīng)選擇外觀潔白、干燥的丙酮酸鈉使用。7. 丙酮酸的顯色受溫度影響，故應(yīng)于季節(jié)變化時(shí)及底物成份之批號(hào)更換時(shí)重新制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。8于-酮戊二酸也能與2.4