9組織培養(yǎng)第九章植物脫毒技術(shù).ppt

1、第九章 植物脫毒技術(shù)宜職院08.9,目的與要求 了解脫毒意義，學(xué)習(xí)植物莖尖脫毒原理及其操作程序，了解其他組織脫毒方法及應(yīng)用，掌握植物理化脫毒方法。學(xué)習(xí)植物脫毒苗的鑒定方法，掌握各方法的鑒定原理，了解植物脫毒苗的保存和繁殖方法。 具備植物莖尖脫毒技術(shù)基礎(chǔ)，具有指示植物鑒定脫毒苗的基本能力，有脫毒苗保存的認知。,全世界已發(fā)現(xiàn)植物病毒有近788種。 病毒的危害： 組織和細胞病變 新陳代謝等生理機能受到干擾 外觀表現(xiàn)不正常狀態(tài) 由于危害可通過營養(yǎng)體傳給后代，病毒對寄主植物可造成毀滅性危害，導(dǎo)致大幅度減產(chǎn)，甚至全株死亡。世界作物生產(chǎn)中，病毒危害程度僅次于真菌。,危害一些植物的病毒數(shù)目,所謂脫毒就是采用一

2、定的方法除去植物體內(nèi)病毒的技術(shù)。 無病毒苗：指不含該種植物的主要危害病毒，即經(jīng)檢測主要病毒在植物體內(nèi)的存在表現(xiàn)陰性反應(yīng)的苗木。,應(yīng)用植物脫毒技術(shù)意義 植物脫毒技術(shù)可使植物恢復(fù)原來優(yōu)良特性，生長勢增強，明顯提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)，產(chǎn)量的提高幅度最高可達300%。 植物脫毒技術(shù)不僅脫除了病毒，還可以去除多種真菌、細菌及線蟲病害，使種性得以恢復(fù)，植株生長健壯，減少肥料和農(nóng)藥施用量，降低生產(chǎn)成本，保護了環(huán)境,第一節(jié) 脫毒方法,一、莖尖培養(yǎng)脫毒（一）通過莖尖培養(yǎng)脫毒的原理 1、病毒在植物體內(nèi)的分布 病毒濃度不同，離尖端越遠病毒濃度越高。莖尖或根尖，離體培養(yǎng)便可獲得無病毒再生植株。 2、莖尖大小與脫毒 莖尖外

3、植體的大小與脫毒效果成反比。莖尖分生組織不能合成自身需要的生長素，但下部葉原基能提供，因而帶葉原基的莖尖生長快，成苗率高。但莖尖越大，脫毒效果差。,（二）莖尖脫毒方法1、取樣與消毒 可直接選定的植株上取頂芽進行消毒接種。采頂芽與側(cè)芽消毒接種 。 消毒方法是：剪取頂芽梢段3、5厘米，剝?nèi)ゴ笕~片，用自來水沖洗干凈，在75%酒精中浸泡30秒左右，用1%-3次氯酸鈉或5%-7%的漂白粉溶液消毒10-20分，最后用無菌水沖洗材料4-5次。,酒精擦拭手,外植體消毒,浸泡5min,器械消毒,酒精燈灼燒,酒精擦拭培養(yǎng)皿,2、莖尖剝離和接種 將已消毒的芽放在帶濾紙的培養(yǎng)皿上器械固定解剖鏡下剝?nèi)ビ兹~切下帶1-2個

4、葉原基的生長點（0.3-0.5mm）切下的莖尖轉(zhuǎn)至培養(yǎng)基上（頂部向上）。,酒精擦拭,旋轉(zhuǎn)灼燒,顯微鏡下獲取莖尖,接種,蓋好瓶塞,脫毒馬鈴薯試管苗,3培養(yǎng) 25+2 ，1500-5000LX，10-16h 一般光照培養(yǎng)比暗培養(yǎng)效果好。其間應(yīng)更換新鮮培養(yǎng)基。提高培養(yǎng)基中BA的濃度可形成大量從生芽。4生根誘導(dǎo) 誘導(dǎo)生根的方法是將2-3cm高的無根苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)1-2個月可生根。,（三）培養(yǎng)基與培養(yǎng)方式 1、培養(yǎng)基：MS， White , Morel等 2、培養(yǎng)方式：一般采用半固體培養(yǎng)基。（四）影響莖尖脫毒效果的因素（莖尖脫毒技術(shù)的關(guān)鍵） 植物種類、病毒種類、剝離莖尖的大小（0.3-0.5m

5、m帶1-3個葉原基）、培養(yǎng)基營養(yǎng),用于脫毒的適宜莖尖大小,二、熱處理脫毒 脫毒原理 即熱處理脫毒，一些病毒對熱不穩(wěn)定，在高于常溫的溫度下（35-40度）即鈍化失活。 1、溫湯浸漬處理脫毒法 材料置于50左右熱水中浸漬幾十分鐘到數(shù)小時。 特點：簡單易行，成本低，但易使材料受傷。適用：甘蔗、木本植物和休眠器官的處理。 2、熱空氣處理脫毒法 將植物用3540的熱空氣處理24周或更長時間。特點：損傷較小，操作簡便，須嚴格控制溫度時間適用：多數(shù)植物,3、熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒 目前常采用將熱處理和莖尖分生組織培養(yǎng)結(jié)合起來的方法脫毒。 特點：既可縮短熱處理時間，提高植株成活率，又可剝離較大的莖尖，提高莖尖

6、培養(yǎng)的成活率和脫毒率。 適用：大多數(shù)植物，并可除去一般培養(yǎng)難以去除的紡錘塊莖類病毒,三、其他組織培養(yǎng)脫毒方法（一）愈傷組織培養(yǎng)脫毒 將感染病毒的組織離體培養(yǎng)獲得愈傷組織，再誘導(dǎo)愈傷組織分化成苗，從而獲得無病害毒植株的方法，即愈傷組織培養(yǎng)脫毒法。 部分愈傷組織細胞不帶病毒可能有以下兩方面的原因：一是愈傷組織細胞分裂增殖速度快，而病毒復(fù)制速度較慢，趕不上細胞的繁殖；二是愈傷組織發(fā)生了抗病毒突變。,（二）珠心胚培養(yǎng)脫毒 柑橘類種子為多胚種子，除具有合子胚外還有珠心胚，種子一般不帶病毒，因此珠心胚植株不易帶病毒。（三）微尖嫁接脫毒 指在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)實生砧木，嫁接無病毒莖尖（0.14-1.0mm,帶

7、3-4個葉原基），以培養(yǎng)脫毒苗的技術(shù)。脫毒程序：無菌砧木培養(yǎng)莖尖準(zhǔn)備嫁接嫁接苗培養(yǎng)移植。,第二節(jié) 脫毒苗鑒定一、直接檢查法 直接觀察待側(cè)植株生長狀態(tài)是否異常，莖葉上有無特定病毒引起的可見癥狀，從而可判斷病毒是否存在。二、指示植物法 將一些對病毒反映敏感，癥狀特征顯著的植物作為指示植物，用以檢驗待測植物體內(nèi)特定病毒的存在。即指示植物法。 特點：條件簡單，操作方便，經(jīng)濟而有效，只能測出病毒的相對感染力。,一些常見病毒病引起的可見病癥,指示植物法,幾種馬鈴薯病毒的指示植物及表現(xiàn)癥狀,（一）草本植物鑒定 1、汁葉涂抹法 被鑒定植物取13克幼葉加10毫升水及少量磷酸緩沖液-研碎過濾-加金鋼砂作麾擦劑-汁

8、液在葉面上涂抹23次接種 2、小葉嫁接法 指示植物作砧木，被鑒定植物小葉作接穗，常用劈接法。 （二）木本指示植物鑒定 1、直接在指示植物上嫁接待檢植株的芽片 2、雙重芽嫁接 3、雙芽嫁接法,部分病毒的木本指示植物及相應(yīng)癥狀,三、抗血清鑒定法特異性高，測定速度快，幾小時甚至幾分鐘就可以完成。植物病毒鑒定中最有用方法之一。（一）原理 刺激抗體產(chǎn)生蛋白質(zhì)抗原?？乖c抗體間能發(fā)生高度專一性的血清學(xué)反應(yīng)（免疫反應(yīng)）（二）方法1、葉綠體凝集法 2、塊莖沉淀法3、環(huán)形接口法4、酶聯(lián)免疫法：用梅標(biāo)記抗原或抗體的微量測定法?，F(xiàn)在靈敏度較高和常使用的方法。,四、分子生物學(xué)鑒定1、雙鏈RNA法 通過提取純純化待測植

9、物RNA，并對其進行電泳分析，可確定dsRNA存在，從而判斷待檢植物是否帶病毒。2、互補DNA（c DNA）檢測法 也叫DNA分子雜交法,五、電鏡檢測法 運用電子顯微鏡可直接檢測待檢植物體內(nèi)有無病毒粒體存在，并根據(jù)所觀察病毒的形態(tài)等對病毒種類進行鑒定。是較為先進的方法，但需一定的設(shè)備和技術(shù)。,第三節(jié) 無病毒苗的保存和繁殖 通過不同脫毒方法所獲得的脫毒植株，經(jīng)鑒定確系無特頂病毒者，既是無病毒原種。 無病毒植株并不是有額外的抗病性，它們有可能很快又被重新感染。所以一旦培育得到無病毒苗，就應(yīng)很好保存，這些原原種或原種材料保管得好可以保存利用510年。,一、無病毒苗的保存 （一）隔離保存 通常無病毒苗

10、應(yīng)種植在隔蟲網(wǎng)內(nèi)，使用300目，即網(wǎng)眼為0.40.5mm大小的網(wǎng)紗，也可用盆栽缽。栽培用的土壤也應(yīng)進行消毒，周圍環(huán)境也要整潔，并及時噴施農(nóng)藥防治蟲害，以保證植物材料在與病毒嚴密隔離的條件下栽培。另一種更便宜的方法，是把由莖尖得到的并已經(jīng)過脫毒檢驗的植物通過離體培養(yǎng)進行繁殖和保存。,（二）長期保存 1、低溫保存 將無病毒苗原種的器官或幼小植株接種到培養(yǎng)基上，低溫下離體保存，是長期保存無病毒苗及其他優(yōu)良種質(zhì)的方法。只需半年或一年更換培養(yǎng)基，也叫最小生長法。 2、冷凍保存（超低溫保存） 用液氮（-196）保存植物材料的方法。常用冷凍保護劑為DMSO（5-8%）、甘油、脯氨酸（10%）、各種可溶性糖、聚乙二醇等。（見十二章）,二、無病毒苗的繁殖 （一）無病毒苗的繁殖方法 1、嫁接繁殖 2、扦插繁殖 3、壓條繁殖 4、匍匐莖繁殖 5、微型薯塊繁殖,（二）無病毒苗繁育生產(chǎn)體系 我國農(nóng)作物無病毒苗繁育生產(chǎn)體系歸結(jié)為以下模式： 國家級（或省級）脫毒中心無病毒苗繁育基地?zé)o病毒苗栽培示范基地作物無病毒化生產(chǎn),三、無病毒苗的利用 無病毒苗在生產(chǎn)中的利用也要防止病毒的再感染。 生產(chǎn)場所應(yīng)隔離病毒感染途徑，做好土壤消毒或防蚜等工作。在此種植區(qū)及種植規(guī)模小的地方，要較長時間才