蛋白質相互作用技術研究的幾種技術

1、蛋白質相互作用研究技術,匯報人: 布沙熱木.阿布力孜 瑪伊熱.努熱艾合買提 夏尤普.玉蘇甫 阿布力米提.莫明,酵母雙雜交 谷胱苷肽-S-轉移酶沉淀試驗(GST-pull down） 免疫共沉淀 雙分子熒光互補技術(BIFC) 生物發(fā)光共振能量轉移（）技術,常用蛋白質相互作用的研究技術,一、細菌雙雜交系統(tǒng),Two-hybrid system 是90年代初發(fā)展起來的新方法，可用于分離能與已知靶蛋白質（target protein）相互作用的基因。 基本原理： 真核生物的轉錄因子大多是由兩個結構上分開、功能上獨立的結構域組成的,如GAL4 （酵母轉錄激活蛋白Gal4的基因）。這兩個結構域各具功能，互

2、不影響。但一個完整的激活特定基因表達的激活因子必須同時含有這兩個結構域，否則無法完成激活功能。,酵母激活因子 GAL4：N端：147個氨基酸組成的DNA結合域(BD)， C端：113個氨基酸組成的轉錄激活域(AD)。GAL4分子的DNA結合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)結合，而轉錄激活域則能激活UAS下游的基因進行轉錄。 組成部分：（1）與BD融合的蛋白表達載體，被表達的蛋白稱誘餌蛋白（bait）；（2）與AD融合的蛋白表達載體，被其表達的蛋白稱靶蛋白（prey）；（3）帶由一個或多個報告基因的宿主菌株。,BD,A,COOH,AD,B,

3、NH2,COOH,共轉化,+,BD,A,AD,Gal4,Gal4,Promoter,Reporter,NH2,Gal4,Gal4,B,酵母雙雜交基本過程,舉 例,二、谷胱苷肽-S-轉移酶沉淀試驗(GST-pull down）原理,GST-融合蛋白,GST,X,Y,谷胱甘肽-瓊脂糖球珠,細胞裂解物,tube,4下孵育2h,GST,X,Y,+,GST pull down實驗流程,（1） Glutathione 瓊脂糖珠預處理。 （2） GST融合蛋白掛柱：取適量GST-融合蛋白與10l已經處理過的beads置于1.5ml離心管中， 4, 搖床孵育過夜。 （3） 孵育過夜的蛋白質與beads的混合液

4、于4,500g離心5min，上清收集，觀察融合蛋白是否飽和地掛在beads上，用1ml冰冷的細胞裂解緩沖液洗三次beads。 （4） 將菌體用溶菌酶處理，之后破碎細菌壁，最大轉速4離心20min,收集上清液。 （5） 將細胞裂解液上清加入beads中，混勻，4，搖床3h。 （6） 3h后，用冰冷的細胞裂解緩沖液洗三次。 （7） 加15l 2SDS上樣緩沖液，煮沸5min. （8） SDS-PAGE,Western Blot或質譜儀分析。,免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法。是確定兩種蛋白質在完整細胞內

5、生理性相互作用的有效方法。 當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內存在的許多蛋白質蛋白質間的相互作用被保留了下來。當用預先固化在argarose beads上的蛋白質A的抗體免疫沉淀A蛋白，那么與A蛋白在體內結合的蛋白質B也能一起沉淀下來。再通過蛋白變性分離，對B蛋白進行檢測，進而證明兩者間的相互作用。,三、免疫共沉淀原理,三、免疫共沉淀原理,免疫共沉淀實驗流程,（1）將菌體用溶菌酶處理，冰上裂解30min,之后破碎細菌壁，最大轉速4離心30min,收集上清液。冰上裂解30min, （2） 取少量裂解液以備Western blot分析，剩余裂解液加1g相應的抗體加入到細菌裂解液，4C緩慢搖晃

6、孵育過夜。 （3） 取10l protein A 瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3 次，每次3,000 rpm離心3 min。 （4） 將預處理過的10l protein A 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細胞裂解液中4C緩慢搖晃孵育2-4h，使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連。 （5） 免疫沉淀反應后，在4C 以3,000 rpm 速度離心3 min，將瓊脂糖珠離心至管底。將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗34次。最后加入15l的2SDS 上樣緩沖液，沸水煮5分鐘。 （6） SDS-PAGE, Western blotting或質譜儀分析.,四、雙分子熒光互補技術( bimole

7、cularfluorescence complementation , BIFC),BiFC技術是將熒光蛋白（GFP、YFP、CFP）分割成兩個不具有熒光活性的分子片段，再分別與目標蛋白連接。如果兩個目標蛋白因為有相互作用而接近，就使得熒光蛋白的兩個分子片段在空間上相互靠近，重新形成活性的熒光基因而發(fā)出熒光。在熒光顯微鏡下，就能直接觀察到兩目標蛋白是否具有相互作用，對研究蛋白質相互作用有重要意義。,BIFC的優(yōu)勢,在最接近活細胞生理狀態(tài)的條件下觀察到其相互作用的蛋白發(fā)生的時間、位置、強弱、所形成蛋白復合物的穩(wěn)定性，以及細胞信號分子對其相互作用的影響等。,五、生物發(fā)光共振能量轉移（）技術,技術是近年來出現(xiàn)的一種新的檢測蛋白質蛋白質相互作用的技術。是建立在非輻射能量轉移的基礎上，在一個發(fā)光或熒光供體發(fā)光酶（lux）和一個熒光受體（如綠色熒光蛋白G）之間會發(fā)生能量轉移。供體發(fā)光酶在相應底物存在時發(fā)射光波。能量受體是熒光蛋白，在一定波長范圍內吸收光波，并在一定的波長范圍內發(fā)射光波。 將兩個目的蛋白分別和供體和受體形成融合蛋白，兩個目的蛋白之間距離足夠近并發(fā)生相互作用，即可檢測到信號。,蛋白質