生物芯片的研究與開(kāi)發(fā)

1、生物芯片的研究與開(kāi)發(fā)1. 分子印章法 DNA芯片原位合成技術(shù) :結(jié)合組合化學(xué)合成與軟光刻微印刷技術(shù)的原理，采用成熟的寡核苷酸固相合成工藝，在預(yù)先制作的彈性印章上實(shí)現(xiàn)空間尋址的核酸原位合成：將不同的寡核苷酸（或多肽）合成試劑涂抹在凹凸不平的印章表面并將其壓印到基片特定位點(diǎn)進(jìn)而進(jìn)行偶聯(lián)固定。開(kāi)發(fā)出高密度基因芯片設(shè)計(jì)軟件，并成功制備位點(diǎn)尺寸為 30微米的高寬比（大于 25）分子印章；建立了一套用于高密度基因芯片制備裝置， 并成功將軟光刻原位合成應(yīng)用到 DNA芯片和肽核酸芯片的制備中。合2成偶聯(lián)效率大于97%，25個(gè)堿基的寡核苷酸正確率大于 70%。制備出 65536/cm陣列的寡核酸芯片，雜交結(jié)果表

2、明該芯片能夠有效區(qū)分單堿基錯(cuò)配序列。獲得美國(guó)專利項(xiàng)，中國(guó)專利 2 項(xiàng)，并有 5 項(xiàng)中國(guó)專利處于二審中。在 Laingmur，中國(guó)科學(xué)等雜志上發(fā)表論文 16篇。該技術(shù)已通過(guò)江蘇省科學(xué)技術(shù)廳鑒定。如能建立分子印章法批量化生產(chǎn)的寡核苷酸微陣列芯片的原位合成試生產(chǎn)線，制備出高質(zhì)量、標(biāo)準(zhǔn)化、低成本的寡核苷酸微陣列芯片來(lái)檢測(cè)與分析基因表達(dá)譜、圖 1 基于軟光刻技術(shù)的高密度基因芯片制備裝置。自行研制的用于高密度基因芯片制備的實(shí)驗(yàn)裝置（左圖） ；表面親水處理的 PDMS分子印章的電鏡照片和全貌圖（右圖）基因突變體、免疫反應(yīng)、受體結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、藥物分子等非核酸類的分子識(shí)別 / 結(jié)合領(lǐng)域， 其應(yīng)用將遍及生物、

3、 醫(yī)學(xué)的各領(lǐng)域， 如基因組研究、 SNP檢測(cè)、STR檢測(cè)、腫瘤研究、藥理學(xué)研究、藥物靶標(biāo)研究、藥物毒性研究、病原體研究、醫(yī)學(xué)診斷、病理學(xué)組織研究、微生物與發(fā)酵研究等該芯片技術(shù)獲得了中國(guó)發(fā)明專利和美國(guó)專利，并被Nature Biotechnology推薦。2. 管蓋基因芯片及其檢測(cè)系統(tǒng) ：管蓋基因芯片是將基因探針固定在特制的管蓋內(nèi)表面，與內(nèi)置雜交貯液池的Eppendorf 管一起構(gòu)建的基因檢測(cè)器件。在一個(gè)全封閉的管內(nèi)，完成基因擴(kuò)增，1 / 7熒光標(biāo)記，芯片雜交及檢等一系列生物化學(xué)操作，實(shí)現(xiàn)多基因高通量并行檢測(cè)。用于管蓋基因芯片的檢測(cè)分析系統(tǒng)， 它包括光學(xué)檢測(cè)平臺(tái)、 圖像采集系統(tǒng)、 圖像分析系統(tǒng)及

4、結(jié)果報(bào)告系統(tǒng)。 光學(xué)檢測(cè)平臺(tái)利用尼康顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)， 通過(guò)電荷耦合器件 (CCD)的進(jìn)行圖像采集。 管蓋基因芯片雜交后， 經(jīng)過(guò)熒光信號(hào)被 CCD捕獲，經(jīng)通用串行總線（ USB）傳遞給計(jì)算機(jī)。圖像經(jīng)過(guò)旋轉(zhuǎn)、去噪聲點(diǎn)、圖像分色、圖 2. 左圖及中圖為管蓋芯片實(shí)物，右圖為用熒光顯微鏡檢測(cè)的針對(duì)多種呼吸道病毒檢測(cè)的雜交結(jié)果。雜交信號(hào)判定、有效性判定及結(jié)果輸出。我們運(yùn)用該系統(tǒng)，對(duì)于呼吸道十種病毒進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該系統(tǒng)能夠準(zhǔn)確檢測(cè)病毒的雜交信號(hào)并給出檢測(cè)結(jié)果。基于管蓋型基因芯片的呼吸道病毒檢測(cè)芯片成功地檢測(cè)了國(guó)家生物制品檢定所提供的SARS標(biāo)準(zhǔn)品，并在華大基因中心檢測(cè)了30 多個(gè)SARS樣本，

5、取得了滿意的結(jié)果。 該成果已通過(guò)了江蘇省科技廳組織的科研成果鑒定。圖 3 管蓋芯片檢測(cè)儀3. 病毒及微生物收集器及一體化檢測(cè)儀 ：病毒及微生物收集器是能夠?qū)諝庵械奈⒘炕瘜W(xué)物質(zhì)和病原體（包括病毒）2 / 7進(jìn)行高效、快速富集和濃縮的新裝置。 利用病毒顆粒在粘性表面的黏附作用和容易洗脫的特點(diǎn)，基于鼻腔結(jié)構(gòu)和鼻黏膜機(jī)理的氣體吸附腔 , 通過(guò)抽氣泵，將空氣中的病毒顆粒吸入吸附腔，粘附在黏膜表面，然后用蠕動(dòng)泵將洗脫液注入腔內(nèi)，通過(guò)超聲震蕩器， 將黏膜和病毒等一起洗脫， 儲(chǔ)于 2ml 的標(biāo)準(zhǔn)凍存管中。 收集管中的洗脫液可收集并集中檢測(cè)。 洗脫液中加入了病毒滅活劑， 保證儀器的安全使用。該裝置的采氣速率為

6、 3 升/ 分。采氣時(shí)間為 1、10 或 30 分鐘。病毒收集在小于0.5ml 的溶液中。通過(guò)分散在空氣中的滅活甲肝病毒和標(biāo)記蛋白粉末試驗(yàn)，病毒顆粒的收集效率在 90%以上。經(jīng)檢索，在國(guó)際上尚沒(méi)有有效收集和檢測(cè)病毒的裝置?；谠摮晒膰?guó)內(nèi)發(fā)明專利已批準(zhǔn)， 并已申報(bào)美國(guó)專利。 目前，該儀器把收集和毛細(xì)管檢測(cè)相集成， 開(kāi)發(fā)出可以對(duì)各種場(chǎng)所里空氣中微小物質(zhì)進(jìn)行收集、 濃縮并可進(jìn)行 有針 對(duì)性 的實(shí)時(shí) 檢 測(cè) 。 該 系統(tǒng)已獲 2004 年 國(guó)家重 點(diǎn)新產(chǎn)品編號(hào)2004ED105009。病毒和微生物收集檢測(cè)器， 可用于空氣傳播的病原學(xué)研究、 空氣消毒劑效果研究、 疫點(diǎn)空氣消毒效果評(píng)價(jià)、 流行期疫點(diǎn)空氣

7、監(jiān)測(cè)和環(huán)境中微生物污染的監(jiān)測(cè)， 對(duì)控制疾病的流行具有重要意義 . 適用于大專院校、 研究機(jī)構(gòu)、醫(yī)院、疾病預(yù)防和控制中心及環(huán)境監(jiān)測(cè)單位， 以及人口密集的地方空氣中病原體以及其它生物物質(zhì)的檢測(cè)，防止生物恐怖等領(lǐng)域，具有較大的應(yīng)用市場(chǎng)。3 / 74. 基于抗體微陣列的細(xì)胞免疫芯片及其一體化檢測(cè)儀：該技術(shù)通過(guò)把細(xì)胞表面抗體制備成微陣列芯片，利用細(xì)胞表面所含有的抗原和對(duì)應(yīng)的抗體之間的特異性反應(yīng)， 捕獲相關(guān)的細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞表面的抗原組合 35。該芯片可以高通量檢測(cè)組織、 體液中特定細(xì)胞的表面抗原譜的特點(diǎn)。 我們研制的細(xì)胞免疫芯片一體化檢測(cè)儀， 由恒溫孵育部分、 清洗部分和檢測(cè)部分組成， 可以將樣本與芯片的

8、孵育、清洗、檢測(cè)、結(jié)果輸出等自動(dòng)完成，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確率。該檢測(cè)儀可以用于進(jìn)行疾病的診斷、 預(yù)后效果判斷、環(huán)境質(zhì)量的監(jiān)測(cè)等方面。研制了白血病的免疫分型芯片，有助于臨床分型、判斷預(yù)后、指導(dǎo)治療。目前免疫分型是白血病臨床治療及基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究的一個(gè)重要手段。 白血病的免疫分型現(xiàn)在仍以流式細(xì)胞術(shù)（ FCM）方法為主，目前一次最多能檢測(cè)到6 種抗原。我們研制的細(xì)胞免疫芯片檢測(cè)技術(shù)， 一次可以檢測(cè)數(shù)十種細(xì)胞表面抗原， 而且無(wú)需標(biāo)記。圖 6 細(xì)胞芯片檢測(cè)儀5. 基于凝膠基因芯片的 SNP檢測(cè)平臺(tái)：將丙稀酰胺修飾的核酸與丙稀酰胺單體、 過(guò)硫酸胺等混合后點(diǎn)樣于丙稀酰胺修飾的玻片上， 然后置于真空， 在引發(fā)劑汽化

9、的氛圍下促其發(fā)生聚合反應(yīng)形成凝膠并固定于玻片上。 通過(guò)該方法， 不僅可以固定合成的、 修飾有丙稀酰胺的寡核苷酸及其類似物， 還可以固定修飾了丙稀酰胺的 PCR產(chǎn)物。這種在凝膠內(nèi)三維的固定量比平面的固定量成指數(shù)級(jí)的提高。 雜交后，用電泳替代傳統(tǒng)的清洗方法 , 可以更好地提高信噪比和有效地區(qū)分完全匹配的序列和錯(cuò)配的序列。以上方法我們用于疾病相關(guān)的功能 SNP的檢測(cè)上，由于凝膠的固定量大 , 可通過(guò)多重 PCR 一次固定多個(gè)位點(diǎn)的 PCR產(chǎn)物。每一位點(diǎn)用一對(duì)分別標(biāo)記 Cy3和 Cy5的寡核苷酸探針與芯片雜交，用電泳方法區(qū)分單堿基錯(cuò)配，通過(guò)掃描結(jié)果呈現(xiàn)的、黃、綠三種顏色很容易將每一位點(diǎn)的 SNP分型

10、, 使得 SNP的檢測(cè)更加真實(shí)可靠、簡(jiǎn)便、低廉。隨著人類基因組計(jì)劃測(cè)序任務(wù)的完成， SNP的研究成為后基因組計(jì)劃中重要的組4 / 7成部分，特別是與人類的生命代謝、疾病相關(guān)的 SNP，國(guó)內(nèi)外眾多的研究所、醫(yī)學(xué)院，乃至大的制藥企業(yè)都投入大量的財(cái)力、人力從事該領(lǐng)域的研究。我們的SNP檢測(cè)平臺(tái)由于可靠、簡(jiǎn)便、低廉的優(yōu)勢(shì)，在眾多的 SNP檢測(cè)方法中更具競(jìng)爭(zhēng)力。目前已經(jīng)為江蘇省人民醫(yī)院、 南京中大醫(yī)院、 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院等多家單位提供服務(wù)，均得到滿意的結(jié)果。6. 硅烷化寡核酸探針 :DNA的固定在傳感器、 DNA固相擴(kuò)增（ PCR）、核酸鍵合、基因芯片及蛋白質(zhì)芯片等生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域中被廣泛使用。 因

11、此，合成短片段寡核酸的修飾具有廣泛的市場(chǎng)。 目前核酸的修飾主要采用進(jìn)口的亞磷酸酰胺試劑， 按照普通DNA合成的方法固相合成。 該試劑我國(guó)目前尚不能生產(chǎn)， 需要進(jìn)口，且價(jià)格昂貴；由于亞磷酸酰胺試劑的反應(yīng)活性高， 很容易與水等親核試劑發(fā)生反應(yīng)而失活， 在儲(chǔ)存、運(yùn)輸和使用上十分不便， 試劑浪費(fèi)嚴(yán)重。 硅烷化寡核酸探針是通過(guò)硅烷化試劑合成的修飾寡核酸， 其價(jià)格低廉。 硅烷化試劑是一種種類繁多、 相對(duì)活潑的化學(xué)試劑。例如氨基硅烷、巰基硅烷、丙烯酰胺基硅烷等等，其國(guó)產(chǎn)價(jià)格大多在50 元/500 毫升左右。硅烷化寡核酸探針具有傳統(tǒng)修飾寡核酸的性質(zhì)：產(chǎn)品為無(wú)色粉末，極易溶于水； 在 20下能穩(wěn)定一年； 產(chǎn)品在

12、碳酸鹽等緩沖溶液等中溶解點(diǎn)樣于醛基等修飾的玻璃載片上能得到有效的固定； 固定的核酸與能夠有效的與互補(bǔ)序列雜交。 該技術(shù)已獲 2005 年國(guó)家新產(chǎn)品編號(hào) 2005ED105019，核酸探針已廣泛 DNA芯片制備，固相 PCR以及各種檢測(cè)核酸， 蛋白質(zhì)分子的及傳感器的制備。隨著基因芯片技術(shù)的不斷成熟及其應(yīng)用領(lǐng)域的不斷拓廣， 核酸探針的市場(chǎng)需求量將進(jìn)一步增加。 市場(chǎng)將涉及對(duì)疾病， 病原體以及其它生物物質(zhì)的診斷與檢測(cè)及分子生物學(xué)相關(guān)的大專院校、 研究機(jī)構(gòu)、 醫(yī)院、疾病預(yù)防和控制中心及環(huán)境監(jiān)測(cè)等單位，具有較大的市場(chǎng)。7. 基因甲基化定量檢測(cè)技術(shù)：本成果采用 Q-MSP結(jié)合 MSP及實(shí)定量 PCR技術(shù)，同

13、時(shí)具有 MSP的特異性和靈敏性以及實(shí)時(shí) PCR的快速和抗污染等特性， 可對(duì)微量 DNA的甲基化進(jìn)行精確定量分析。我們利用該技術(shù)對(duì) 30 例骨肉瘤組織及相應(yīng)的正常組織的 5 個(gè)基因進(jìn)行定量甲基化分析。 結(jié)果說(shuō)明， 異常甲基化水平與腫瘤的病理分期密切相關(guān)， 它可以5 / 7作為一個(gè)有用的分子標(biāo)記來(lái)協(xié)助判斷腫瘤的發(fā)生程度及預(yù)后效果。 本研究的結(jié)果撰寫的文章已被美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)主辦的權(quán)威雜志 CANCER接收。8.PCR共聚焦生物芯片掃描儀：本成果是將基因?qū)崟r(shí)定量擴(kuò)增技術(shù)與基因芯片技術(shù)進(jìn)行有機(jī)融合，將探針固定在芯片上，通過(guò)基因擴(kuò)增的同時(shí)水解探針原理來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，實(shí)現(xiàn)基于基因芯片的基因定量檢測(cè)。該儀器設(shè)計(jì)了高

14、精度的溫度循環(huán)控制系統(tǒng)和基因芯片的熒光多次掃描技術(shù)為一體， 通過(guò)軟件的控制， 實(shí)現(xiàn)對(duì)基因芯片的在片擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)圖 7 PCR 共聚焦生物芯片掃描儀的監(jiān)測(cè)，計(jì)算出熒光的增減變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)待測(cè)基因與標(biāo)準(zhǔn)參照體系的對(duì)比，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找實(shí)測(cè)樣品對(duì)應(yīng)的檢測(cè)探針的熒光強(qiáng)度變化過(guò)程確定待測(cè)樣品的相對(duì)基因含量。 該成果的多基因同時(shí)定量檢測(cè)能夠在醫(yī)學(xué)、食品及生物安全等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。9. 中藥材（石斛）鑒定特異性 gDNA探針的篩選與應(yīng)用本成果以名貴中藥材石斛為實(shí)驗(yàn)材料， 探索了在全基因組內(nèi)篩選種特異性探針，并建立了多種特異性探針進(jìn)行中藥鑒定的 gDNA芯片新方法，對(duì)石斛樣本進(jìn)行了準(zhǔn)確鑒定。本研究成果是將抑制性差減雜交與基于尼龍膜微陣列雜交相結(jié)合篩選種特異探針。即先用抑制性差減雜交獲得兩個(gè)品種之間的 gDNA差異片段，然后用這些 gDNA差異片段與由所有研究品種的 gDNA制備成的微陣列雜交篩選到某一個(gè)品種的特異性 gDNA片段。研究證明了建立的種特異性 gDNA探針的篩選方法是可行和高效的。該研究成果發(fā)表在核酸研究和生物化學(xué)和生物物理學(xué)方法雜志上。用從 5 種石斛中篩選到的 14 個(gè)種質(zhì)特異性探針點(diǎn)樣制備成微陣6 / 7列成功地對(duì) 5 種常見(jiàn)的石斛品種其中包括 中國(guó)藥典收錄的 3 種石斛進(jìn)行了鑒定。建立了 DNA微陣列鑒別不同的商品石斛