臨床基因診斷進(jìn)展_陳鳴.ppt

1、臨床分子生物學(xué)診斷進(jìn)展,陳鳴 教授 主任醫(yī)師 第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,OUTLINE,測(cè)序技術(shù) 乙肝病毒耐藥突變檢測(cè) 預(yù)測(cè)某些疾病的遺傳風(fēng)險(xiǎn)程度 腫瘤化療藥物敏感試驗(yàn),生物芯片技術(shù) 固相芯片 液相芯片,基因組和分子檢測(cè)： 生物芯片技術(shù),DNA 芯片,cDNA芯片,Oligo芯片,信息 生物芯片,多肽芯片,生物 芯片,微流體芯片,功能 生物芯片,芯片實(shí)驗(yàn)室,組織芯片,蛋白芯片,抗體芯片,蛋白質(zhì)芯片,SAGE/CAGE,epigenetics芯片,質(zhì)粒microarray,微株array,基因組 genetics,轉(zhuǎn)錄組 mRNA,Introduction,“S

2、cience”: Foder提出基因芯片概念 1991 第一張基因芯片：美國(guó)Affymetrix公司 1992 第一張以玻璃為載體的基因芯片： Stanford大學(xué)PBrown實(shí)驗(yàn)室，1995 “Science”: Schena 基因表達(dá)譜的研究，1995 第一張實(shí)用型基因芯片：Affymetrix 1996 中國(guó)科學(xué)界第一次專項(xiàng)討論：第80次“香山科學(xué)會(huì)議”上， 1997年9月 1998年度自然科學(xué)領(lǐng)域十大進(jìn)展之一 美國(guó)正式啟動(dòng)基因芯片計(jì)劃：1998 “生物芯片技術(shù)”正式列入國(guó)家“863”計(jì)劃 ：1999,Sample DNA,Each spot contains known DNA,Bio

3、chip,Complementary DNA hybridize,Signal appears,Biochip Based on Hybridization,7,我國(guó)殘疾人口有8296萬(wàn)，其中耳聾殘疾人群占2004萬(wàn)，占24%，累及2.6億家庭人口。,耳聾人群,2006年第二次全國(guó)殘疾人抽樣調(diào)查數(shù)據(jù),8,耳 聾 的 致 病 因 素,9,中國(guó)人群遺傳性耳聾的特點(diǎn),遺傳性耳聾突變位點(diǎn)具有明顯的種族差異 中國(guó)人群大部分遺傳性耳聾由4個(gè)基因的突變所引起：GJB2、 GJB3、 SLC26A4（PDS）、mtDNA 12s rRNA等 中國(guó)人群的耳聾突變熱點(diǎn)： GJB2：35 del G，176 del

4、 16，235 del G，299 del AT SLC26A4（PDS）：IVS7-2 AG，2168 AG GJB3：538CT 線粒體：12S rRNA：1555 AG，1494 CT,10,基因型與臨床表型的對(duì)應(yīng)關(guān)系,線粒體基因 C1494T、A1555G突變： 氨基糖甙類藥物敏感性耳聾 GJB2基因： 先天性重度以上感音神經(jīng)性耳聾 PDS基因： 大前庭導(dǎo)水管綜合征（EVAS）一種內(nèi)耳畸形，先天或后天重度以上感音神經(jīng)性耳聾 GJB3： 后天高頻感音神經(jīng)性耳聾,11,遺傳性耳聾的遺傳特點(diǎn),父母均為健康攜帶者,12,耳聾基因檢測(cè)的價(jià)值,盡量避免兩個(gè)同一基因純合突變的聾人結(jié)婚！,針對(duì)聾人群體

5、：,13,耳聾基因檢測(cè)的價(jià)值,基因檢測(cè)可指導(dǎo)聾人的婚配，避免婚后再生聾兒！,針對(duì)聾人群體：,14,現(xiàn)有位點(diǎn)可覆蓋中國(guó)人群中 98%GJB2, 80%PDS, 90%藥物性耳聾患者,遺傳性耳聾檢測(cè)試劑盒包括的基因位點(diǎn),晶芯遺傳性耳聾基因檢測(cè)試劑盒,標(biāo)本采集 3管EDTA抗凝的紫頭管（最好空腹）,16,遺傳性耳聾檢測(cè)芯片的檢測(cè)結(jié)果,235 雜合,1555均質(zhì),IVS 雜合,2168和IVS復(fù)合雜合,2168 純合,Wild Type,Control,可對(duì)四個(gè)基因9個(gè)位點(diǎn)的基因型進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)，報(bào)告野生、雜合突變或純合突變等三種結(jié)果,QC BC PC,PC NC QC,35W IC35 538W,35

6、M ICG3 538M,176W 1494W PC,176M 1494M BC,235W 1555W 2168W,235M 1555M 2168M,299W ICmt IVSW,299M IC21 IVSM,ICG2 BC ICIVS,檢測(cè)意義,GJB2基因 先天性耳聾基因：當(dāng)GJB2基因發(fā)生突變時(shí)，患者出生即表現(xiàn)出耳聾癥狀 檢測(cè)意義：為耳聾患者確診病因；指導(dǎo)生育有聾兒的家庭再次生育；篩查有耳聾家族史的家庭成員的基因突變情況；等,線粒體12s rRNA基因 藥毒性耳聾致病基因：當(dāng)該基因發(fā)生突變時(shí)，患者聽力正常，但當(dāng)使用氨基糖甙類藥物時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致重度耳聾的發(fā)生 檢測(cè)意義：通過(guò)檢測(cè)此基因，可以明確

7、被檢者該基因突變情況，指導(dǎo)患者用藥 ；明確患者家庭中該疾病的遺傳性,19,GJB3基因 后天性耳聾基因：當(dāng)GJB3基因發(fā)生突變時(shí)，患者青少年時(shí)期聽力正常，當(dāng)發(fā)育至青壯年期間（2030歲）時(shí)，聽力逐漸下降，直至發(fā)生重度耳聾 檢測(cè)意義：通過(guò)檢測(cè)此基因，可以為聽力下降的患者明確病因；指導(dǎo)生育有聾病患者的家庭再次生育；篩查有耳聾家族史的家庭成員的基因突變情況,SLC26A4（PDS）基因 大前庭導(dǎo)水管綜合征致病基因：當(dāng)PDS基因發(fā)生突變時(shí)，患者出生時(shí)耳蝸發(fā)生畸變，但不發(fā)生耳聾癥狀，當(dāng)患者患感冒、頭部受打擊時(shí)，聽力逐漸下降，直至發(fā)生重度耳聾 檢測(cè)意義：通過(guò)檢測(cè)此基因，可以為聽力下降的患者明確病因；指導(dǎo)患

8、者生活習(xí)慣，指導(dǎo)生育有聾病患者的家庭再次生育；篩查有耳聾家族史的家庭成員的基因突變情況,實(shí)例介紹1,22,樣本由杭州惠耳聽力提供,實(shí)例介紹2,23,樣本由中國(guó)聾康中心提供,實(shí)例介紹3,24,父親：野生型； 聾兒,母親：野生型； 聾兒,孩子： 野生型； 聽力正常,樣本由大坪醫(yī)院提供,Luminex 200TM多功能流式點(diǎn)陣儀,液態(tài)芯片是基于Luminex200TM（美國(guó)Luminex公司）的是一個(gè)多功能生物芯片平臺(tái)，既能檢測(cè)蛋白、又能檢測(cè)核酸的高通量技術(shù)平臺(tái) 通常用于免疫分析、核酸分析、受體和配體分析等臨床檢測(cè)和科學(xué)研究 LuminexTM有機(jī)地整合了編碼微球、激光技術(shù)、應(yīng)用流體學(xué)、最新的高速數(shù)

9、字信號(hào)和計(jì)算機(jī)運(yùn)用法則，具有很高的檢測(cè)特異性和靈敏度,Luminex200TM,Luminex xMAP Technology - 1,Luminex xMAP Technology - 2,Luminex xMAP Technology - 2,42,6,33,18,52,58,16,HPV DNA分型檢測(cè)液芯操作配套設(shè)備,30-40min,2.5hr,15min,采樣刷、細(xì)胞保存液、冰箱,離心機(jī)（10000rpm）、TIP頭（大、中、小）、EP管、水浴鍋、金屬加熱器、移液器（1000l、200l）、手套、口罩,PCR儀（非熒光）、TIP頭（大、中、小）、PCR管、PCR實(shí)驗(yàn)室,流式熒光儀（

10、 Luminex200TM）、電腦,PCR儀（非熒光）、TIP頭（大、中、?。?、PCR管,液芯HPV DNA分型產(chǎn)品三大優(yōu)勢(shì),激光分析，數(shù)字結(jié)果 無(wú)需洗滌，減少污染 液相雜交，重復(fù)性好,液相雜交，效率高、重復(fù)性好,固態(tài)芯片產(chǎn)品：膜條式反向雜交，基質(zhì)不均一，溫控困難，重復(fù)性差,液芯產(chǎn)品：液相雜交，反應(yīng)徹底，溫控嚴(yán)格，重復(fù)性好,Solid-Phase Kinetics,Solution-Phase Kinetics,已獲SFDA藥證的項(xiàng)目,HPV分型（高危、低危型，同時(shí)檢測(cè)26種壓型） 腫瘤標(biāo)志物（13種） 自身免疫性疾病的診斷標(biāo)記物,OUTLINE,測(cè)序技術(shù) 乙肝病毒耐藥突變檢測(cè) 預(yù)測(cè)某些疾病的

11、遺傳風(fēng)險(xiǎn)程度 腫瘤化療藥物敏感試驗(yàn),生物芯片技術(shù) 固相芯片 液相芯片,人類基因組計(jì)劃The Human Genome Project,1985: 提出對(duì)整個(gè)人類基因組DNA測(cè)序 1990: 國(guó)際合作項(xiàng)目，歷時(shí)13年 花費(fèi)： $3 Billion,人類基因組計(jì)劃The Human Genome Project,人類基因組計(jì)劃The Human Genome Project,Now we run our products on gel,雙脫氧熒光測(cè)序方法,vs.,電泳和數(shù)據(jù)的產(chǎn)生:,全自動(dòng)測(cè)序方法 Automated Sequencing,測(cè)序技術(shù)的飛躍,2003年，“HGP”獲得首張人類全基因組

12、圖譜，花費(fèi)了30億美元和13年的時(shí)間 Craig Venter開發(fā)出一種快速追蹤測(cè)序方法，并于2007年9月完成Venter自身全基因組的測(cè)定工作，花費(fèi)了大約1億美元,Bad boy of Science,測(cè)序技術(shù)的飛躍,2008.4.17Nature雜志上， 454測(cè)序新技術(shù)：美國(guó)454 Life Sciences公司，花了150萬(wàn)美元，4個(gè)月 Illumina genome analyzer Applied Biosystems SOLiD sequencer,454 sequencing： Emulsion PCR (emPCR),Mix DNA Library & capture be

13、ads (limited dilution),Create “Water-in-oil” emulsion,+ PCR Reagents,+ Emulsion Oil,Perform emulsion PCR,Adapter carrying library DNA,A,B,Micro-reactors,Adapter complement,Load beads into PicoTiter Plate,Load Enzyme Beads,2020/10/8,50,測(cè)序技術(shù)的飛躍,Helicos公司開發(fā)的HeliScope Sequencer “單分子測(cè)序” 不需要PCR擴(kuò)增 成本最低 目標(biāo)：

14、10萬(wàn)美元，3個(gè)工作日左右 一個(gè)重要的里程碑 在聯(lián)系個(gè)人化基因組和個(gè)人化治療方面 破解生命密碼并找到缺陷基因 對(duì)于各種遺傳疾病、癌癥、肥胖等具有難以估量的意義,測(cè)序技術(shù)在臨床上的應(yīng)用,肝炎病毒變異、分型的檢測(cè)（HBV ） 預(yù)測(cè)某些疾病的遺傳風(fēng)險(xiǎn)程度（乳腺癌、結(jié)腸癌） 個(gè)體化用藥指導(dǎo) （腫瘤化療用藥指導(dǎo)）,肝炎病毒變異、分型的檢測(cè)（HBV ）,核苷類藥物,干擾素,耐藥突變點(diǎn)檢測(cè),LAM,ADV,ETV,C基因區(qū)變異,與肝臟疾病的嚴(yán)重程度有關(guān) 與抗病毒治療的效應(yīng) 與肝癌栓塞治療的效應(yīng),HBV基因分型,可在耐藥臨床表現(xiàn)發(fā)生前14個(gè)月檢測(cè)出突變株 適時(shí)調(diào)整用藥方案,了解病毒在體內(nèi)存在的狀態(tài) 判斷肝癌發(fā)

15、生的風(fēng)險(xiǎn)率,存在著天然耐藥株,HBV DNA 陽(yáng)性,乳腺癌( breast cancer),發(fā)生于乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤 是女性常見的腫瘤之一,約占全身惡性腫瘤的7 % - 10% 全世界每年新發(fā)乳腺癌約150 萬(wàn)例,死亡約57 萬(wàn)例,Genetics,BRCA-1 BRCA-2 P53, Rb-1 Her-2/neu, c-erB2, c-myc,BRCA1、BRCA2基因突變與乳腺癌,通過(guò)對(duì)有乳腺癌家族史婦女的BRCA1和BRCA2基因突變的檢測(cè)顯示,此類人群中約有10%為BRCA1和BRCA2基因突變的攜帶者。BRCA1和BRCA2基因突變的攜帶者到70歲時(shí),發(fā)生乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)累計(jì)達(dá)到

16、80%-85% ,一生中發(fā)生乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)可高達(dá)90% BRCA1和BRCA2基因突變的檢測(cè)是對(duì)于有乳腺癌家族史人群進(jìn)行乳腺癌篩查和早期診斷的有效方法,What can YOU do?,1.一側(cè)乳腺癌 2.乳腺腫塊 3.有家族史 4.腫瘤標(biāo)記物,每個(gè)人是不同的 大多數(shù)病人的治療方案是相同的 醫(yī)藥費(fèi): 數(shù)以萬(wàn)計(jì)的錢花在沒(méi)有療效的藥物治療 死亡/病重: 2.2 億嚴(yán)重的病例和超過(guò)100萬(wàn)的死亡例數(shù),最大的挑戰(zhàn): 藥物個(gè)體反應(yīng)的差異,相同藥物，相同藥效？,相同臨床表現(xiàn) 相同實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果 相同疾病 (?),相同藥物.,不同的療效,?,不同的遺傳背景,可能的原因: 藥物-藥物的相互作用. 藥物代謝 藥物靶點(diǎn)的易感性 Or.,SNP,SNP,SNP: 單核苷酸多態(tài)性 （Single Nucleotide Polymorphisms）,每個(gè)個(gè)體 99.9% 相同的序列 0.1% 不同的序列,決定了對(duì)疾病的易感性和對(duì)藥物的敏感度,人群 A,人群 B,藥物對(duì)大部分病人有效,藥物對(duì)大部分 病人無(wú)效,使用該藥物,選擇另外的藥物,SNP 和藥物療效評(píng)價(jià),藥物對(duì)大部分 病人毒性增加,降低用藥劑量,國(guó)際成熟的腫瘤靶向用藥的分子檢測(cè),腫瘤分子分型檢測(cè)的四大方面,非小細(xì)胞性肺癌：易瑞沙、特羅凱 EGFR基因型選