細胞凋亡作用機理PPT參考課件.ppt

1、細胞衰老與細胞凋亡,1,衰老和死亡是生命的基本現(xiàn)象，生命要不斷的更新，種族要不斷的繁衍。 而這種過程就是在生與死的矛盾中進行的。至少從細胞水平來看，死亡是不可避免的。 衰老過程發(fā)生在生物界的整體水平、種群水平、個體水平、細胞水平以及分子水平等不同的層次。,2,衰老是細胞的一種重要的生命活動。,Hayflick界限,第1節(jié) 細胞衰老 （CELL AGING, CELL SENESCENCE）,細胞衰老的研究,3,成人早衰癥 （Werner氏綜合癥）,嬰幼兒早衰癥 （Hayflick-Guilford綜合癥 ）,4,決定細胞衰老的因素在細胞內(nèi)部， 而不在外部環(huán)境。,決定細胞衰老的表達是細胞核而 不

2、是細胞質(zhì)。 （長壽基因和衰老基因）,細胞在體內(nèi)條件下的衰老,5,衰老細胞結(jié)構(gòu)的變化,細胞核：,核膜的內(nèi)折，染色質(zhì)固縮化,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)：,有序排列被破壞，彌散于核周胞質(zhì)中 糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)解體，減少。,線粒體：,數(shù)目減少，體積增大;有時可看到嵴。,致密體：,積累增多（是由溶酶體或線粒體轉(zhuǎn)化）,膜系統(tǒng)的變化：,凝膠相或固相，通透性和流動性降低 細胞間間隙連接減少 組成間隙連接的膜內(nèi)顆粒聚集體變小,6,皮膚干燥、發(fā)皺,頭發(fā)變白,老人斑,吸收能力下降,細胞水分減少，體積減小,細胞內(nèi)的酶活性降低,細胞內(nèi)色素(脂褐素)的累積,細胞膜通透性功能改變,無力,細胞內(nèi)呼吸速度減慢,衰老癥狀與原因分析,7,就生物個體而言，在其

3、整個的生長發(fā)育過程中也不斷地發(fā)生細胞選擇性地死亡，這對保證機體的生存，保持機體對內(nèi)外環(huán)境變化的適應(yīng)能力，維持其正常的發(fā)育均具有重要意義。此種細胞死亡稱為編程性細胞死亡（programmed cell death，PCD），也稱細胞凋亡（apoptosis）。,編程性細胞死亡,8,細胞凋亡（apoptosis）,由基因控制的自主性有序死亡，亦稱程序性死亡(programmed cell death,PCD) Apo-ptosis來源于希臘語，from fall;細胞的死亡猶如秋天樹葉的凋落 1965年Kerr,J.F.R.對大鼠肝臟門靜脈結(jié)扎后肝細胞溶酶體的觀察(J Pathol. Bacter

4、iol. 90:419,1965) 1972年澳大利亞Kerr和Curry提出,9,10,* 線蟲(C.elegant)中的細胞程序性死亡,線蟲: 成體 959 個細胞, 但在發(fā)育過程中有131個細胞會注定發(fā)生PCD PCD發(fā)生時間:1h 左右 參與線蟲PCD的基因，目前已知的有14個,凋亡的回顧,11,(programmed cell death, PCD),經(jīng)典凋亡模型,12,PCD已經(jīng)提出20多年了，但是發(fā)現(xiàn)其生物學(xué)上的重大意義還是近年的事。PCD和遺傳、進化、發(fā)育、病理及至腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及其放療、化療等均有密切的關(guān)系。 年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎分別授予了英國科學(xué)家悉尼布雷內(nèi)、美國科學(xué)家

5、羅伯特霍維茨和英國科學(xué)家約翰蘇爾斯頓，以表彰他們發(fā)現(xiàn)了在器官發(fā)育和“程序性細胞死亡”過程中的基因規(guī)則。,13,Sydney Brenner 1/3 of the prize United Kingdom The Molecular Sciences Institute Berkeley, CA, USA b. 1927(in Union of South Africa),H. Robert Horvit 1/3 of the prize USA Massachusetts Institute of Technology (MIT) Cambridge, MA, USA b. 1947,John

6、 E. Sulston United Kingdom The Wellcome Trust Sanger Institute Cambridge, United Kingdom b. 1942,THE 2002 NOBEL PRIZE WINNER,14,THE NOBEL DIPlOMA,15,2002年諾貝爾醫(yī)學(xué)與生理學(xué)頒獎儀式，瑞典斯德哥爾摩音樂廳。,16,Sydney Brenner receiving his Nobel Prize from His Majesty the King at the Stockholm Concert Hall.Photo: Hans Mehlin,

7、Nobel e-Museum,17,1.細胞凋亡和一般性衰老死亡區(qū)分開來，證明了細胞凋亡的必然性； 2. 基因分析與細胞的分裂、分化以及器官的發(fā)育聯(lián)系起來; 3.細胞凋亡機理為艾滋病、腫瘤和癌癥等疾病的治療提供了尋找新方法的可能。,18,“程序性細胞死亡”是細胞的一種生理性、主動性的“自覺自殺行為”，這些細胞死得有規(guī)律，似乎是按編好了的“程序”進行的，其死亡過程猶如秋天片片樹葉的凋落，所以這種細胞死亡又稱為“細胞凋亡”。,19,包括人類在內(nèi)的生物是由細胞組成的，細胞的誕生固然非常重要，但細胞的死亡也重要。,20,早在世紀年代初期，科學(xué)家就開始探索“程序性細胞死亡”的奧秘。但要揭開這一奧秘，需要

8、選擇一個合適的研究對象，像細菌這樣的單細胞生物太簡單，而像哺乳動物這樣由大量細胞組成的生物又太復(fù)雜，科學(xué)家最終選擇了線蟲。線蟲長僅毫米，細胞數(shù)量不多，功能也不復(fù)雜，而且它身體透明，便于用顯微鏡觀測。,21,這位獲獎?wù)叩某晒麨槠渌茖W(xué)家研究“程序性細胞死亡”提供了重要基礎(chǔ)，后來科學(xué)家又在這一領(lǐng)域取得了一系列新成績?？茖W(xué)家們發(fā)現(xiàn)，控制“程序性細胞死亡”的基因有兩類，一類是抑制細胞死亡的，另一類是啟動或促進細胞死亡的。兩類基因相互作用控制細胞正常死亡。,22,如果能發(fā)現(xiàn)所有的調(diào)控基因，分析其功能，研究出能發(fā)揮或抑制這些基因功能的藥物，那么就可加速癌細胞自殺，達到治療癌癥的目的，而同時提高免疫細胞的生

9、命力，則達到抵御艾滋病的目的。,23,細胞凋亡與壞死的區(qū)別,1細胞凋亡,細胞凋亡多發(fā)生于生理情況下，故可稱為生理性死亡，部分病理刺激也可誘導(dǎo)凋亡。 其特征為,1.細胞骨架的擾亂，粘附力降低，伴隨細胞皺縮而產(chǎn)生的胞質(zhì)和核的濃縮;,2.膜發(fā)泡;,3.核中沿核周緣染色質(zhì)凝集，繼而染色質(zhì)降解，凝膠電泳檢測呈現(xiàn)180200bp及其倍數(shù)的特征梯度（ladder）;,4.形成膜包圍的斷裂片段的凋亡小體（apoptosis bodies）.,24,膜通透性增高，細胞水腫，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹，線粒體膨脹破裂，酶被釋放，染色質(zhì)凝集，核固縮，細胞溶解，胞質(zhì)內(nèi)容物釋放，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。,2細胞壞死,細胞壞死（necrosis）

10、是區(qū)別于細胞凋亡的另一種細胞死亡方式，由多種致病因子如局部缺血，物理、化學(xué)和生物因子的作用而產(chǎn)生的急性損傷所致，故稱為病理性死亡。,25,細胞凋亡與壞死的比較,壞死 凋亡,強刺激,弱刺激,溶酶釋出，炎癥反應(yīng),ATP(-),ATP,26,Apoptotic bodies （凋亡小體）,哺乳類的細胞凋亡過程-Apoptosis,27,28,檢測細胞凋亡的方法,組織切片中的凋亡細胞分散，數(shù)量少，迅速為巨噬細胞所吞食。Giemsa 染色、孚爾根染色或Hoechest 33342等熒光染色。在光鏡下鏡檢、可觀察到染色質(zhì)凝集、邊緣化，凋亡小體出現(xiàn)，巨噬細胞的吞食等現(xiàn)象。,1形態(tài)學(xué),組織切片中壞死灶周圍有炎

11、癥反應(yīng)，淋巴細胞集中。,死亡,凋亡,29,在小鼠肌肉中生長的P815腫瘤細胞中因缺血誘導(dǎo)的壞死，示濃縮的染色質(zhì)塊的病態(tài)的邊緣、膨脹的線粒體和分解的膜。,30,孚爾根染色、DNA熒光染色可顯示染色質(zhì)凝集、斷片等現(xiàn)象。 臺盼藍染色，凋亡細胞仍是拒染而壞死細胞是著色的，表明凋亡細胞還保持著一定生物活性。壞死細胞胞質(zhì)不濃縮而是明顯腫脹，無凋亡小體。,電鏡下凋亡細胞的核縮小，染色質(zhì)邊緣化、凝集、電子密度高。晚期則形成核碎片和胞質(zhì)內(nèi)的細胞器混合在一起被細胞膜包圍的凋亡小體；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到后期膨脹成泡狀，胞質(zhì)密度增高， 胞膜絨毛減少；凋亡小體最后脫離胞體，被巨噬細胞所吞噬。,31,正常細胞核,凋亡細胞核,細胞發(fā)生

12、凋亡時，染色質(zhì)會固縮。 所以Hoechst染色時，細胞核會呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染。,32,返回,前進,33,Apoptosis of ANA-1 cell induced by Curcumin,?,34,Human lymphoma cells treated with the chemotherapy agent camptothecin. The cells that are undergoing apoptosis appear yellow and show the characteristic membrane blebbing (bubble formation)seen

13、 in cells dying via apoptosis.,35,線蟲(C. clegans)凋亡細胞是自身cdc3和ced4基因表達依賴性的，凋亡細胞被鄰近細胞吞食。,36,2DNA電泳,提取細胞基因組DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳，凋亡細胞DNA顯示出180200bp及其不同倍數(shù)的梯帶，被視為最典型的凋亡指標。因被激活的核酸內(nèi)切酶選擇性地在核小體的連接段（linker）處切斷所致。壞死細胞DNA則被核酸內(nèi)切酶無規(guī)則地切斷，在培養(yǎng)液中細胞溶解后放出DNA片段，故在電泳膠上呈彌散的涂抹狀。,37,DNA電泳,+,necrosis,apoptosis,38,3流式細胞光度術(shù),由于核酸內(nèi)切酶對DNA

14、的降解成小片段，通過固定改變膜通透性，經(jīng)PI或Hoechest33342染色，G1期出現(xiàn)低于2C DNA含量的峰，成為細胞凋亡的重要標志之一。,39,全反式維甲酸處理人HL-60細胞后，流式細胞光度儀對細胞DNA含量分析藥物處理后第5、6天明顯出現(xiàn)Gl期小峰,40,4凋亡細胞的原位標記,由于凋亡細胞DNA為核酸內(nèi)切酶降解產(chǎn)生3OH的缺口和末端，故可用原位缺口平移法(in situ nick translation)或原位末端標記法 （TUNEL）顯示凋亡細胞。根據(jù)需要可采用生物素、地高辛、熒光素和同位素等標記物，如標記的熒光素可以在流式細胞儀上進行定量分析凋亡與非凋亡細胞。原位標記法的最大優(yōu)點

15、在于，能在組織切片上識別難于判斷的凋亡細胞，不足之處為缺乏專一性，但可結(jié)合形態(tài)學(xué)予以正確判斷。,41,HL-60 cells（急粒，p53缺陷）被喜樹堿誘導(dǎo)3小時。DNA段端被熒光標記的脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶標記。,42,5細胞膜磷脂酰絲氨酸（PS）熒光顯示,PS在非凋亡細胞中分布于細胞內(nèi)膜，細胞凋亡后，細胞內(nèi)膜轉(zhuǎn)至膜外，PS被巨噬細胞識別后被吞噬。而PS出現(xiàn)在細胞膜外，可作為凋亡細胞的標志。 鈣結(jié)合蛋白(annexin V)依靠Ca2+與PS結(jié)合，使用熒光標記的鈣結(jié)合蛋白(annexin Vfluos)及PI兩種熒光可在流式細胞儀上定量地區(qū)別凋亡、壞死和正常的細胞。亦可用熒光顯微鏡鑒定個別的凋

16、亡細胞。,43,Jurkat 人類白血病T細胞經(jīng)喜樹堿處理，ps外翻，早期凋亡特異性的特征被annexin5檢測到。晚期凋亡和壞死細胞被pi染色,44,45,46,confocal microscopy 共聚焦顯微鏡用于檢測凋亡,47,48,細胞凋亡的生物學(xué)意義,細胞凋亡是機體自我保護機制，是長期遺傳、進化的結(jié)果，以保證生物的世代延續(xù)。,確保正常發(fā)育生長：清除多余的細胞 維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定：清除受損、突變、 衰老的細胞 積極防御功能：對病毒感染細胞阻止 復(fù)制,49,細胞凋亡的過程,1 凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)：啟動信號Ca2+、 cAMP、 神經(jīng)酰胺 2 凋亡基因激活：表達酶類和其他物質(zhì) 3 細胞凋亡的執(zhí)行：

17、核酸內(nèi)切酶(DNase)和Caspases 4 凋亡細胞的清除：被臨近的M或其他細胞吞噬分解,50,凋亡時細胞的主要變化,形態(tài)學(xué)改變 胞膜空泡化 固縮 出芽 染色質(zhì)邊集,脫接觸,凋亡小體,51,52,53,細胞凋亡的生化改變,1 DNA的片段化：梯狀條帶形成？ 核小體連接區(qū)被切開：染色質(zhì),300 kb,50kb,180200bp或其整倍數(shù)片段,5min,90min,54,2 內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活及其作用,由一系列胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)環(huán)節(jié)激活，執(zhí)行染色質(zhì)DNA切割,55,Caspase 8的激活，需要FADD( Fas associated protein with death domain)Caspa

18、se 9 激活，需要通過CARD（caspase-recruitment domain)、Apaf-1、細胞色素c、ATP等多個因子的參與。,細胞色素C、Apaf-1和pro-caspase 9 組成了“Apoptosome” （凋亡體）,56,3 凋亡蛋白酶（caspases）的激活及其作用,是一組對底物天冬氨酸部位有特異水解作用，其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶（cysteine-containing aspartate-spicific protease）至少有13個成員 Cysteine 半胱氨酸 Aspartate 天冬氨酸 spicific protease,57,caspases功

19、能,滅活細胞凋亡的抑制物:如Bcl-2 水解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，細胞解體，凋亡小體 在凋亡級聯(lián)反應(yīng)中水解相關(guān)活性蛋白：使其獲得或喪失功能,58,細胞凋亡的調(diào)控,細胞凋亡是細胞自殺現(xiàn)象，是受到一定程序的控制的。如細胞接受凋亡信號，通過一系列的信號傳遞，凋亡有關(guān)的正負調(diào)節(jié)基因的表達，Ca2+的變化，酶的激活等，最終導(dǎo)致細胞凋亡。目前發(fā)現(xiàn)與細胞凋亡有關(guān)的基因有三類，即促進細胞凋亡的基因，抑制細胞凋亡的基因和在細胞凋亡過程中表達的基因。若按基因效應(yīng)劃分，則可分為原癌基因、抑癌基因、病毒基因、生長及其抑制因子基因、細胞受體基因和蛋白激酶基因等。,59,誘導(dǎo)性因素：激素，生長因子、理化因素、免疫、微生物,細胞凋亡

20、相關(guān)因素,抑制性因素： 細胞因子 IL-2，神經(jīng)生長因子 激素ACTH、睪酮、雌激素 其它Zn2+、 苯巴比妥、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、EB病毒、中性氨基酸,60,細胞凋亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo),誘導(dǎo)信號,cell,R,神經(jīng)酰胺,多途徑,R,SAPK/JNK,P53 基因,NF-kB,JNK/AP-1途徑,激活bax or 下調(diào)bcl-2,ROS,mtDNA,61,凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)特點, 多樣性：不同種類的細胞系統(tǒng)不同 偶聯(lián)性：與增殖分化的信號系統(tǒng)交叉偶聯(lián) 同一性：多因素，共用同一系統(tǒng)觸發(fā) 多途性：同一誘導(dǎo)因素啟動多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,62,凋亡相關(guān)基因,抑制凋亡基因：bcl-2 促進凋亡基因： fas，P53

21、 雙向調(diào)控基因： c-myc，bclx,63,1ced基因,在線蟲中已發(fā)現(xiàn)14個與細胞凋亡相關(guān)的基因。其研究得比較深入的有ced3和ced-4以及促進細胞凋亡的有關(guān)基因。ced-4的詳細功能尚不十分清楚，但Ced-3蛋白有530個氨基酸，其中含有約100個氨基酸長度的絲氨酸富含區(qū)，提示磷酸化在細胞凋亡中有十分重要的作用。,64,在哺乳動物中克隆出一個與ced-3相似的基因為白細胞介素1轉(zhuǎn)化酶(inter-leukin- 1 converting enzyme，ICE)，是一種底物特異性半胱氨酸蛋白酶，可裂解IL-1-前體為17.5kDa的成熟形式的IL1。,65,由果蠅(D.melanogas

22、ter)中克隆出rpr(reaper)基因，編碼65個氨基酸的短鏈多肽，其迅速表達可誘導(dǎo)細胞凋亡，但并非參加一切細胞的凋亡。其在進化中的保守性有待深入研究。,2rpr基因,66,它定位于人的第18號染色體，在淋巴瘤中極易發(fā)生染色體易位(14：18)，使bcl-2與14號染色體上IgH基因并列而導(dǎo)致過表達。它編碼26kDa的Bcl-2a及22kDa的Bcl-2蛋白。 bcl-2是一個不斷在擴增的多基因家族的原型(prototypes)，其在哺乳類中的家族成員有Bcl-，Mcl-1，Bax，Bak，Bad，A1和Bik-1。,3Bcl-2,67,Bcl-2 229aa構(gòu)成（鼠236）分在線粒體內(nèi)膜

23、,細胞內(nèi)膜表面，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，核膜等處 * Bcl-2-B cell lymphoma/leukemia-2 * Bcl-2 和C. elegans 中的ced-9 有很高的同源性，具有促進細胞存活的功能,68,大量實驗證明它是多細胞動物中普遍存在的“長壽”基因，如神經(jīng)元壽命長，bcl-2的表達則高于其他類型細胞。,*Bcl-2的功能是延長細胞的壽命，而不是刺激細胞的增殖,69,Bcl-2抗凋亡機制,直接的抗氧化 抑制線粒體釋放促凋亡的蛋白質(zhì) 抑制促凋亡的Bax，Bak細胞毒作用 抑制Caspases激活 維持細胞鈣穩(wěn)態(tài),70,線蟲C.elegans 和哺乳類細胞的死亡途徑比較,71,它是一個多功能

24、的原癌基因，c-myc可促進細胞分裂，參與細胞的轉(zhuǎn)化。c-myc存在于核仁，并可結(jié)合在特異的DNA序列上發(fā)揮轉(zhuǎn)化因子的作用。它既可誘導(dǎo)細胞凋亡，又可抑制細胞凋亡。,4c-myc基因,72,c-myc 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 依賴GF Bcl-x Bcl-xl抑凋亡 Bcl-xs促凋亡,73,p53是腫瘤抑制基因，野生型p53可誘導(dǎo)細胞凋亡。缺乏p53功能的癌細胞若轉(zhuǎn)染p53基因并使其過表達p53時，導(dǎo)致生長抑制。p53誘導(dǎo)細胞周期阻斷的能力，長期以來認為其機理是抑制了腫瘤細胞生長，現(xiàn)在認為p53促進細胞凋亡可能是腫瘤生長抑制的主要原因。,5p53基因,74,P53-野生型誘導(dǎo)凋亡，在G1期發(fā)揮卡點功能有

25、缺陷DNACIP表達啟動修復(fù)失敗啟動凋亡 CIP-cyclin dependent kinase interacting protien-1 P53 = molecular policeman?,75,G1,S,G2,M,Cyclin A+CDK,Cyckin A+CDK1,Cyclin B,Cyclin D,p53,Bax,+,Bcl-2,molecular policeman?,Blocking IGF+R,76,Fas和Apo-1是分別從人的T琳巴細胞瘤KT3細胞株及人B細胞淋巴瘤SKW6.4株分離的兩個cDNA克隆，序列分析證明兩者完全一致，為同一分子。1993年在美國Boston召開的第五屆人類白細胞抗原分型國際會議上，正式命名Apo-1Fas為CD 95。,6FasApo-1,77,Fas L(Fas ligand)為人和鼠的Fas的配體。激活的T淋巴細胞高表達Fas L。Fas和Fas L結(jié)合則誘導(dǎo)細胞凋亡，但如何激活細胞凋亡的機理尚不清楚。,78,ICE基因是由哺乳類中克隆出的cdc-3的同源基因，ICE的前體為p45，有p20及p10 2個亞基，p45可能自身參與這一催化過程，(p20p10)2形成有活性的ICE I。Rat-1細胞中ICE過量表達可導(dǎo)致細胞凋亡，如將ICE的催化位點Cys 285突變，則細胞不能凋亡。,7ICE基因