焦磷酸測序技術的原理

1、Pyrosequencing技術的原理Pyrosequencing是一項全新的DNA測序技術，可以快速、準確地測定一段較短的目標片段。其基本原理如下：第1步：1個特異性的測序引物和單鏈DNA模板結合，然后加入酶混合物（包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase和Apyrase）和底物混合物（包括APS和Luciferin）。第2步：向反應體系中加入1種dNTP,如果它剛好能和DNA模板的下一個堿基配對，則會在DNA 聚合酶的作用下，添加到測序引物的3末端，同時釋放出一個分子的焦磷酸（PPi）。第2步圖示(圖片來自互聯(lián)網(wǎng))第3步：在ATP硫酸化酶的作用

2、下，生成的PPi可以和APS結合形成ATP;在熒光素酶的催化下，生成的ATP又可以和熒光素結合形成氧化熒光素，同時產(chǎn)生可見光。通過CCD光學系統(tǒng)即可獲得一個特異的檢測峰，峰值的高低則和相匹配的堿基數(shù)成正比。第3步圖示(圖片來自互聯(lián)網(wǎng))第4步：反應體系中剩余的dNTP和殘留的少量ATP在Apyrase的作用下發(fā)生降解。第4步圖示(圖片來自互聯(lián)網(wǎng))第5步：加入另一種dNTP,使第2-4步反應重復進行，根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取準確的DNA序列信息。第4步圖示(圖片來自互聯(lián)網(wǎng))Pyrosequecing技術操作簡單，結果準確可靠，可應用于SNP位點檢測、等位基因頻率測定、細菌和病毒分型等領域。附件列表

3、下載次數(shù)：0 如果您認為本詞條還有待完善，請 編輯詞條上一篇SNP（單核苷酸多態(tài)性）下一篇閱讀質粒圖譜具體事例【摘要】 建立了一種將序列標記反轉錄聚合酶鏈反應(PCR)與焦磷酸測序技術結合的相對基因表達量測定法(簡稱“SRPP”)。先用來源特異性引物對不同來源的同一基因通過反轉錄標記上特異性標簽，PCR后用焦磷酸測序法對擴增產(chǎn)物進行序列解碼，使得測序結果中的序列代表基因的來源，峰高代表基因在不同來源中的相對表達量。用實時熒光定量PCR法對本方法的準確性進行了驗證，結果表明，SRPP可以同時準確測定同一基因在3個不同來源中的表達量，并實際測定了Egr1基因在糖尿病、肥胖和正常小鼠肝中的表達量差異

4、。 【關鍵詞】 序列標記反轉錄, 聚合物鏈反應，焦磷酸測序，基因表達1 引 言差異表達基因與疾病密切相關，深入研究可在基因水平揭示疾病的發(fā)病機制。目前，用于檢測基因表達水平的技術主要有SAGE法1、實時熒光定量PCR法2,3和基因芯片法4等。但這些方法存在儀器設備昂貴、定量性能差以及同時測定基因表達量的來源數(shù)目受限等缺點。焦磷酸測序技術是新近發(fā)展起來的一種基于酶催化化學反應的測序技術58，不需要使用熒光標記，定量性能好。目前，焦磷酸測序技術多用于單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、微生物分型和基因甲基化分析等。本研究將焦磷酸測序技術用于基因表達量差異的比較分析，考察了其可行性和準確性，并將其應用于檢

5、測Egr1基因在糖尿病、肥胖癥和正常小鼠中的差異表達。 2 實驗部分2.1 儀器、試劑與材料21R型臺式高速冷凍離心機(美國Beckman公司);Gene Spe微量核酸蛋白測定儀(日本Naka Instrument公司);PTC225 PCR擴增儀、Opticon實時熒光PCR儀(美國MJ Research公司)。焦磷酸測序裝置由本實驗室自行組裝9,10。此裝置主要由焦磷酸測序反應模塊、熒光信號放大和數(shù)據(jù)采集3部分組成。反應模塊由位于中間的反應池通過毛細管與四周的dNTP儲液池相連組成。通過注射器施壓使4種dNTP循環(huán)加入反應池完成測序反應。熒光信號通過R6335光電倍增管(日本Hamama

6、tsu Photonics K.K.公司)放大后，經(jīng)BPCL微弱發(fā)光測量儀(北京中國科學院生物物理研究所)采集數(shù)據(jù)。Hotstar Taq DNA聚合酶、Omniscript RT kit反轉錄試劑盒(德國Qiagen公司);Trizol(上海Inviotrogen公司);熒光素、熒光素酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶和5磷酸化硫酸腺苷(美國Sigma公司); DynabeadsM280鏈霉親和素磁珠(挪威Dynal AS公司); Klenow DNA 聚合酶(美國Promega公司);所有引物均由上海Invitrogen公司合成。實驗中用到的糖尿病、肥胖和正常小鼠的肝組織由南京師范

7、大學生命科學學院提供。2.2 RNA的提取用Trizol試劑盒抽提RNA，用紫外分光光度法測定RNA濃度及純度。2.3 反轉錄合成cDNA第一鏈取等量的不同來源的總RNA，分別以來源特異性反轉錄引物反轉錄。即取總RNA 0.052.0 g至Nucleasefree的小管中，加DEPCH2O至12 L;65 反應5 min后，置冰上至少1 min;在上述各小管中加入10第一鏈合成緩沖液2 L，0.5 mmol/L dNTP混合物，10 U RNase 抑制劑，200 U Omniscript Reverse Transcriptase，1 mol/L反轉錄引物，加DEPCH2O至總體積為20 L

8、。反轉錄條件為：37 反應1 h, 93 反應5 min，然后中止反應。2.4 基因特異性PCR不同來源的cDNA等比例混合，以共用引物CP(5CCA TCT GTT CCC TCC CTG TC3)和生物素標記的基因特異性引物(GSP)進行擴增反應。PCR體系為： cDNA等比例混合液1 L， 0.3 mol/L CP和GSP，1.5 mmol/L Mg2+， 0.2 mmol/L dNTP 混合物，10PCR 緩沖液 5 L，5Q 溶液 10 L ， 1 U HotStar Taq DNA聚合酶，并加入滅菌蒸餾水至50 L。PCR反應程序為： 94 變性 15 min，熱循環(huán)35次(94

9、, 40 s; 60 , 40 s; 72 , 1 min )， 72 延伸10 min， 4 保存?；蛱禺愋砸锏男蛄幸姳?。表1 實驗用引物2.5 焦磷酸測序固相單鏈模板的制備取5 L戴諾磁珠(Dynabeads)，用磁鐵吸棄上清液。磁珠以100 L B&W Buffer(10 mmol/L TrisHCl, pH 7.5, 1 mmol/L EDTA, 2.0 mol/L NaCl)洗滌兩遍，最終懸浮于50 L B&W 緩沖液中;加入50 L PCR產(chǎn)物，37 反應30 min;用磁鐵吸棄上清液，磁珠以180 L H2O洗滌兩遍，加入0.1 mol/L NaOH溶液20 L，混勻室溫放

10、置5 min使PCR產(chǎn)物變性;磁鐵吸棄上清液，磁珠以100 L B&W 緩沖液洗滌兩遍，100 L 1退火緩沖液洗一遍，最終溶于8 L 1退火緩沖液中;加入1 L 10 mol/L測序引物，93 混勻30 s，55 退火3 min，4 保存，待測序用。 2.6 焦磷酸測序反應焦磷酸測序標準混合液的組成為：0.1 mol/L TrisAc緩沖液(pH 7.7)，2 mmol/L EDTA，10 mmol/L Mg(Ac)2，0.1% BSA，1 mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)，3 mol/L 5磷酸化硫酸腺苷(adenosine5phosphosulfate，APS)，0.4 g/L PVP

11、，0.4 mmol/L D蟲熒光素，210-4 U/L三磷酸腺苷硫酸化酶，210-3 U/L 三磷酸腺苷雙磷酸酶，1810-3 U/L無外切酶活性的Klenow DNA聚合酶，14.6 mg/L熒光素酶。3 結果與討論3.1 方法原理焦測序技術是一種基于化學發(fā)光反應定量測定引物延伸副產(chǎn)物焦磷酸鹽(PPi)的測序技術。其原理是：引物與模板DNA退火后, 在DNA 聚合酶(polymerase)、三磷酸腺苷硫酸化酶(ATP sulfurylase)、熒光素酶(luciferase) 和三磷酸腺苷雙磷酸酶(apyrase)的協(xié)同作用下完成循環(huán)測序反應。當加入的dNTP與模板互補時，DNA模板與互補的

12、dNTP聚合可以產(chǎn)生等摩爾PPi;在三磷酸腺苷硫酸化酶的催化下，PPi與5磷酸化硫酸腺苷(APS)反應生成等量的ATP;在熒光素酶催化作用下，ATP與蟲熒光素(luciferin)反應發(fā)出熒光。產(chǎn)生的熒光信號強度與聚合的測序模板量和堿基數(shù)成正比，根據(jù)加入的dNTP類型和測得的熒光信號強度就可實時記錄模板DNA 的核苷酸序列。反應方程式如下：(DNA)n+dNTPpolymerase(DNA)n+l+PPi(1)PPi+APSATP sulfurylaseATP+SO2-4(2)ATP+Luciferin+O2luciferaseAMP+PPi+Oxyluciferin+CO2+hv(3)dNT

13、PApyrasedNDP+PiApyrasedNMP+Pi(4)ATPApyraseADP+PiApyraseAMP+Pi(5)為了定量測定基因表達量差異，本研究將堿基序列標記法與焦磷酸測序解碼技術相結合，其關鍵點在于：在不同來源的同一基因中標記上區(qū)別樣品來源的特異性標簽;對標記序列進行解碼和定量測定。采用反轉錄引物將來源特異性堿基標記到各來源待測基因，然后用焦磷酸測序定量測定標記序列。具體測定過程如圖1所示：(1) 用來源特異性反轉錄引物對不同來源的RNA進行反轉錄。引物由4部分組成：5端為共用序列;位于引物中間的4個堿基為人為設計的來源特異性標簽，在圖1中以深淺不同的4個小圓點表示;3端為

14、oligo(dT)n和用于固定oligo(dT)n位置的兩個兼并堿基。來源特異性反轉錄引物的堿基組成和數(shù)目都相同，只是位于中間的來源特異性堿基的排列位置有所差異;(2) 不同來源的cDNA稀釋后等比例混合;(3) 用生物素標記的基因特異性引物和共用引物擴增上述混合物，通過改變基因特異性引物就可以進行任何基因的表達量差異分析;(4) 用磁性微球技術將PCR產(chǎn)物制備成單鏈，根據(jù)來源特異性反轉錄引物中來源標簽序列進行焦磷酸測序。測序結果中，各來源特異性堿基的相對峰高即代表相對基因表達量差異。本方法稱之為SRPP法(Sequencetagged reversetranscription PCR wit

15、h pyrosequencing)。圖1 堿基序列標記法結合焦磷酸測序解碼技術測定基因表達量差異的原理圖Fig.1 Principle of comparative gene expression analysis by coupling sequencetagged reversetranscription polymerase chain reaction(PCR) with pyrosequencing (SRPP)由于不同來源的同一基因在單管中只用一對引物進行PCR，并且擴增產(chǎn)物的堿基組成和含量完全一樣，僅4個堿基的排列順序不一樣，具有相同的保留時間。所以來源不同，表達量不同的同一基因

16、在單管中能實現(xiàn)等比例擴增。SRPP測定峰高比值也即能代表起始基因的相對表達量。3.2 焦磷酸測序的定量特性在同一焦磷酸測序反應體系中，產(chǎn)生的熒光信號強度與ATP的量成正比，而ATP的量與聚合的dNTP 個數(shù)成正比，所以可以根據(jù)圖譜中測得的信號強度推測出模板DNA相對含量。為了驗證焦磷酸測序的定量特性，人為設計了一條測序單鏈(5GG TT CC AA G T C A CCCCGCCCGC3 )和一條測序引物(5GCGGGCGGGG3)，使測序單鏈的3端與測序引物單鏈的5端完全互補。兩條單鏈退火后按dTTPdGTPdATPSdCTP的順序循環(huán)遞加dNTP進行測序反應。結果顯示，待測模板上測序引物的

17、延伸序列為“T G A C TT GG AA CC”12個堿基，其信號強度跟同質區(qū)的相同堿基個數(shù)成正比。這一結果表明，峰強度與被引物延伸模板的量成正比，可通過測定各峰的峰高之比確定對應的模板的相對含量。本研究利用焦磷酸測序技術的定量特性，通過測序圖譜中的峰高比值分析不同來源的基因相對表達量。3.3 來源特異性基因的標記及標記模板的等比例擴增SRPP法定量的關鍵在于能否在單管中等比例擴增經(jīng)標記的不同來源的同一基因。為了驗證SRPP法是否具有此特性，人工模擬了一系列Actb基因的3個不同來源(分別命名為“來源G”，“來源T”和“來源C”)進行測定。具體方法為取同一來源的RNA樣品分成3等份，分別用

18、來源特異性反轉錄引物RTG(5CCA TCT GTT CCC TCC CTG TC gatc ttt ttt ttt ttt ttt VN3), RTT(5CCA TCT GTT CCC TCC CTG TC tacg ttt ttt ttt ttt ttt VN3)和RTC (5CCA TCT GTT CCC TCC CTG TC catg ttt ttt ttt ttt ttt VN3)進行反轉錄反應，使反轉錄產(chǎn)物分別被標記上“來源G”、“來源T”和“來源C”的特異性標簽(上述序列中的帶下劃線的斜體部分)。然后將上述經(jīng)標記的cDNA模板，分別以111, 511, 151和115(來源G來源

19、T來源C)的體積比混合，作為系列人工模擬模板分別進行PCR擴增，測定結果如圖2所示，序列中的第一個堿基“G”代表“來源G” 的模板;第二個堿基“T”代表“來源T”的模板;第三個堿基“C”代表“來源C” 的模板。3個堿基信號峰的相對強度代表著Actb基因在3個不同來源中的相對表達量。通過計算峰高的比值即可得到所測基因在不同來源中的表達差異。由于dNTP不穩(wěn)定，存在少量的分解產(chǎn)物PPi，在焦磷酸測序中可能會出現(xiàn)背景峰，影響結果的準確性。為此，焦磷酸測序中每種dNTP都連續(xù)加入兩次，所以圖2中每次焦磷酸測序都出現(xiàn)6個峰。其中第1次得到的峰為信號峰，第2次為dNTP背景峰，計算結果時要在信號強度中扣除

20、背景。3種來源模板等量混合(111)的測序結果如圖2A所示，測得的峰高比為1.11.01.0 (來源G來源T來源C)，此測定值與模板理論比例111十分相近;如圖2(BD)所示， 圖2 Actb基因在不同人工模擬3種來源中的表達量差異測序圖譜，3種來源的理論表達量比為111(A), 511(B), 151(C)和115(D)(每種dNTP都連續(xù)加入兩次以扣除其背景吸收)Fig.2 Pyrograms of simulated templates prepared by pooling three sourcespecific cDNAs at the ratios of 111 (A), 511

21、 (B), 151 (C), and 115 (D), respectively. PCR was performed by using the common primer and the Actb genespecific primer. Each deoxyribonucleoside triphosphate(dNTP) was dispensed twice for detecting the background due to pyrophosphoric acid(PPi) impurity in dNTP solution模板比例為511, 151 和115 的SRPP測定結果分

22、別為：5.11.01，0.974.81和0.20.21。結果表明，不同比例的各標記模板(各模板的差別僅是4個堿基的排列序列不同)得到了等比例擴增，沒有序列歧視性，即通過測定擴增產(chǎn)物的比例就可以間接得到不同來源中基因的表達量差異。3.4 準確性實驗為進一步驗證本方法的準確性，將本方法的測定結果與實時熒光定量PCR法進行比較。采用本方法平行測定2次，Actb基因在小鼠腎、心和腦中的相對表達量之比分別為38.819.841.3和40.019.540.5。平均值為39.419.640.9。同時采用實時熒光定量 PCR測得Actb基因在腎、心和腦中的相對表達量比值為37.822.040.2。與兩種方法測定結果一致, 說明SRPP可以用于準確測定同一基因在不同來源中的表達量差異。3.5 Egr1基因在糖尿病小鼠、肥胖小鼠和正常小鼠肝中的