DB33T599-2006水產(chǎn)品中硝基呋喃類(lèi)代謝物殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法.doc

DB33/T 2002浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局 發(fā)布2006-02-08實(shí)施2006-01-05發(fā)布水產(chǎn)品中硝基呋喃類(lèi)代謝物殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法Determination of the metabolites of Nitrofuran Antibiotics residues in aquatic productsLC-MS/MS methodDB33/T 599-2006DB33浙江省地方標(biāo)準(zhǔn)ICS 67.050B 501DB33/T 5992006前 言本標(biāo)準(zhǔn)附錄A為資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省海洋與漁業(yè)局提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：浙江省水產(chǎn)質(zhì)量檢測(cè)中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：張海琪、何中央、王揚(yáng)、鄭重鶯、丁雪燕、應(yīng)永飛。I水產(chǎn)品中硝基呋喃類(lèi)代謝物殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了水產(chǎn)品中呋喃它酮的代謝物5-甲基嗎啉-3-氨基-2-噁唑烷基酮（簡(jiǎn)稱(chēng)AMOZ，下同）、呋喃西林的代謝物氨基脲（簡(jiǎn)稱(chēng)SEM，下同）、呋喃妥因的代謝物1-氨基-2-內(nèi)酰脲（簡(jiǎn)稱(chēng)AHD，下同）和呋喃唑酮的代謝物3-氨基-2-噁唑烷基酮（簡(jiǎn)稱(chēng)AOZ，下同）殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的測(cè)定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于水產(chǎn)品中呋喃它酮代謝物、呋喃西林代謝物、呋喃妥因代謝物和呋喃唑酮代謝物殘留量的檢驗(yàn)。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定呋喃它酮代謝物、呋喃西林代謝物、呋喃妥因代謝物和呋喃唑酮代謝物的檢測(cè)限均為0.50 g/kg。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3 原理樣品中殘留的硝基呋喃類(lèi)抗生素代謝物在酸性條件下水解，用2-硝基苯甲醛衍生化，經(jīng)固相萃取柱凈化后液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。4 試劑除非另有說(shuō)明，僅使用分析純?cè)噭?.1 水：GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。4.2 甲醇：色譜純。4.3 乙腈：色譜純。4.4 乙酸乙酯：色譜純。4.5 磷酸氫二鉀。4.6 甲酸：優(yōu)級(jí)純。4.7 二甲亞砜：優(yōu)級(jí)純。4.8 鹽酸：優(yōu)級(jí)純。4.9 氫氧化鈉：優(yōu)級(jí)純。4.10 2-硝基苯甲醛（2-NBA）：純度99%。4.11 磷酸氫二鉀溶液：0.5 mol/L。稱(chēng)取5.7 g磷酸氫二鉀（4.5），用水溶解，定容至50 mL。4.12 鹽酸溶液：0.2 mol/L。量取17 mL濃鹽酸（4.8）用水定容至1 000 mL。4.13 氫氧化鈉溶液：1 mol/L。稱(chēng)取40 g氫氧化鈉(4.9)，用水溶解，定容至1 000 mL。4.14 2-硝基苯甲醛溶液：8.0 g/L。稱(chēng)取80 mg 2-硝基苯甲醛（4.10）溶于10 mL二甲亞砜(4.7)，臨用前配制。4.15 Oasis HLB固相萃取柱或相當(dāng)者：60 mg，3 mL。使用前分別用3 mL乙酸乙酯、3 mL甲醇和5 mL水預(yù)處理，保持柱體濕潤(rùn)。4.16 AMOZ、SEM、AHD、AOZ及同位素內(nèi)標(biāo)物AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-D3和SCA-13C-15N2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度98%。4.17 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：0.10 mg/mL。準(zhǔn)確稱(chēng)取四種硝基呋喃類(lèi)代謝物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及四種相應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)物，分別用甲醇配成0.10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液。-18避光保存，保存期為三個(gè)月。4.18 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：1 g/mL。吸取四種硝基呋喃類(lèi)代謝物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（4.17），用甲醇配成1 g/mL。-18避光保存，保存期為三個(gè)月，使用前回溫到室溫。4.19 混合內(nèi)標(biāo)工作溶液：100 ng/mL。吸取四種硝基呋喃類(lèi)代謝物同位素的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（4.17），用甲醇配成100 ng/mL。-18避光保存，保存期為三個(gè)月，使用前回溫到室溫。4.20 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：根據(jù)需要，臨用前吸取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（4.18），用甲醇稀釋配制適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。5 儀器和設(shè)備5.1 液相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀，配有電噴霧（ESI）離子源。5.2 恒溫振蕩器。5.3 固相萃取裝置。5.4 高速臺(tái)式離心機(jī)：5 000 r/min。5.5 氮?dú)獯蹈蓛x。5.6 pH計(jì)。6 測(cè)定步驟6.1 提取稱(chēng)取10 g均質(zhì)試樣（精確到0.01 g）于50 mL聚丙烯離心管中，加入100 L內(nèi)標(biāo)工作溶液（4.23），分別加入25 mL 0.2 mol/L鹽酸溶液和0.5 mL衍生劑（4.14），渦旋混合1 min，置于37恒溫振蕩器中保持16h。6.2 凈化將上述提取溶液（6.1）取出放置至室溫，加入1 mL 0.5 mol/L磷酸氫二鉀溶液（4.11），用1 mol/L 氫氧化鈉溶液（4.9）調(diào)節(jié)溶液pH范圍至7.07.4，以4 500 r/min的速度離心15 min，上清液過(guò)已Oasis HLB或相當(dāng)?shù)墓滔噍腿≈?.15），調(diào)節(jié)流速小于等于2 mL/min，待樣液全部通過(guò)固相萃取柱后用3 mL水洗固相萃取柱，棄去全部流出液。負(fù)壓下抽干固相萃取柱10 min，再用6mL乙酸乙酯洗脫被測(cè)物，洗脫液全部收集于10 mL離心管中，并在氮?dú)獯蹈蓛x上40水浴吹干，1mL乙腈與0.4%甲酸水溶液（10+90）溶解殘?jiān)^(guò)0.2 m濾膜，濾液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。6.3 測(cè)定6.3.1 色譜條件a) 色譜柱：Zorbax XDB C18柱（150 mm2.1 mm5 m）或相當(dāng)者；b) 柱溫：35；c) 進(jìn)樣量：40 L；d) 流動(dòng)相及流速見(jiàn)表1。6.3.2 質(zhì)譜條件a) 離子源：電噴霧離子源（ESI）；b) 掃描方式：正離子掃描；c) 檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；d) 霧化氣（NEB）、氣簾氣（CUR）、輔助加熱氣（AUX）、碰撞氣（CAD）均為高純氮?dú)猓皇褂们皯?yīng)調(diào)節(jié)各氣體流量以使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到檢測(cè)要求；e) 噴霧電壓、去集簇電壓、碰撞能等電壓值應(yīng)優(yōu)化至最優(yōu)靈敏度；f) Q1，Q3均為單位分辨率（UNIT）；g) 定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、采集時(shí)間（Dwell）見(jiàn)表2。表1 液相色譜梯度洗脫條件時(shí)間（min）流速（L/min）0.4%甲酸水溶液（%）乙腈（%）0.0020070303.0020070303.0125025758.0025025758.01200703015.002007030表2 四種硝基呋喃代謝物的監(jiān)測(cè)離子對(duì)硝基呋喃代謝物名稱(chēng)定量離子對(duì)（m/z）定性離子對(duì)（m/z）采集時(shí)間（ms）AMOZ335/291335/262100；100SEM209/166209/192100；100AHD249/134249/17850；100AOZ236/134236/104100；50AOZ-D4240/13450AMOZ-D5340/296100AHD-D3252/13450SCA-13C-15N2212/1951006.3.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定6.3.3.1 定性測(cè)定在相同試驗(yàn)條件下，樣品中待測(cè)物與同時(shí)檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有相同的保留時(shí)間，并且非定量離子對(duì)與定量離子對(duì)色譜峰面積的比值相對(duì)偏差小于30%，則可判定為樣品中存在該殘留。6.3.3.2 定量測(cè)定按照6.3.1和6.3.2液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件測(cè)定樣品和混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（6.1.4），以色譜峰面積按內(nèi)標(biāo)法定量，以AMOZ-D5 （m/z 340/296）計(jì)算AMOZ（m/z 335/291）的濃度，以SCA-13C-15N2（m/z 212/195）計(jì)算SEM（m/z 209/166）的濃度，以AHD-D3（m/z 252/134）計(jì)算AHD（m/z 249/134）的濃度，以AOZ-D4（m/z 240/134）計(jì)算AOZ（m/z 236/134）的濃度。 在上述色譜條件下標(biāo)準(zhǔn)溶液的提取離子流圖參見(jiàn)附錄A.1。6.4 空白試驗(yàn)除不加試樣外，均按上述測(cè)定步驟進(jìn)行。7 結(jié)果計(jì)算測(cè)定結(jié)果可由計(jì)算機(jī)按內(nèi)標(biāo)法自動(dòng)計(jì)算，也可按式（1）計(jì)算，計(jì)算結(jié)果需扣除空白值。（1）式中：X 樣品中待測(cè)組分殘留量，單位為微克每千克（g/kg）；C AMOZ、SEM、AHD或AOZ標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度，單位為微克每升（g/L）；Csi 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)物的濃度，單位為微克每升（g/L）；C i0 樣液中內(nèi)標(biāo)物的濃度，單位為微克每升（g/L）；A00 樣液中AMOZ、SEM、AHD或AOZ的峰面積；As AMOZ、SEM、AHD或AOZ標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的峰面積；Asi 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)物的峰面積；Ai 樣液中內(nèi)標(biāo)物的峰面積；V 樣品定容體積，單位為毫升（mL）；W 樣品稱(chēng)樣量，單位為克（g）。注：報(bào)告測(cè)定結(jié)果至小數(shù)二位。8 方法檢測(cè)限、準(zhǔn)確度和精密度8.1 方法檢測(cè)限本方法在水產(chǎn)品中AMOZ、AOZ、S