東南大學12-6-5 生化制藥

名詞解釋題（每題2分，共10分）填空題（每空1分，共30分）簡答題（每題8分，共40分）翻譯題 （每題10分，共20分）l PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又稱為聚合酶鏈式反應(yīng)或PCR擴增技術(shù)，是一種高效快速的體外DNA聚合程序。l 基因文庫（gene library or gene bank）從特定生物個體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式存在（人工構(gòu)建）。 l 將外源基因與受體菌自身的蛋白質(zhì)編碼基因拼接在一起，并作為一個開放型閱讀框架進行表達。由這種雜合基因表達出的蛋白質(zhì)稱為融合蛋白。l 細胞轉(zhuǎn)化指細胞發(fā)生遺傳改變而產(chǎn)生永生化，即由限定性細胞系轉(zhuǎn)化為連續(xù)性細胞系，可以在體外進行無限傳代和生長繁殖 。l 單域抗體即為VH，約為完整分子的1/12。它只由一個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，故稱單域抗體。單域抗體盡管親和力有所降低，但仍保持著原單抗的特異性。 l 轉(zhuǎn)基因動物(transgenic animal）是通過基因工程技術(shù)將外源DNA導(dǎo)入動物生殖細胞，干細胞，早期胚胎，并在染色體上整合，穩(wěn)定傳給子代的技術(shù)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)誘導(dǎo)基因組改變的動物稱轉(zhuǎn)基因動物。 l 動物生物反應(yīng)器（bioreactor）是目的片段在器官或組織中表達的轉(zhuǎn)基因動物。包括乳腺生物反應(yīng)器，血液生物反應(yīng)器和膀胱生物反應(yīng)器等l 固定化酶（immobilized enzyme） 指限制或固定于特定空間位置的酶。即經(jīng)物理或化學方法處理，使酶變成不易隨水流失即運動受到限制，而又能發(fā)揮催化作用的酶制劑。 l 次級代謝產(chǎn)物（Secondary metabolites） 通過次級代謝合成的產(chǎn)物，大多是分子結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的小分子化合物，如抗生素、激素、生物堿、毒素等。多具有生物活性，是植物代謝產(chǎn)物研究的重點。l 外植體(explant) 植物體上取出的用于培養(yǎng)和分離細胞的組織或器官。l 愈傷組織 植物的傷口或外植體的傷口長出的細胞團，既是組織，又是脫分化細胞l 通過在DNA水平上人工設(shè)計引入的蛋白酶切割位點或化學試劑特異性斷裂位點，可以在體外從純化的融合蛋白分子中釋放回收異源蛋白。l 供體、受體、載體是重組DNA技術(shù)的三大基本元件。l 載體的功能包括運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞、為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力、為外源基因的擴增或表達提供必要的條件。l 基因工程轉(zhuǎn)化細胞的篩選方法有抗生素篩選法、籃白斑篩選法、噬菌斑篩選法。l 基因工程轉(zhuǎn)化細胞的鑒定方法有菌落PCR、載體大小檢測、酶切鑒定、測序確證。l 選擇劑是維持工程菌的純正性和質(zhì)粒的穩(wěn)定性的化合物。包括營養(yǎng)缺陷互補和抗生素抗性。l 對于誘導(dǎo)表達型工程菌，Lac啟動子表達系統(tǒng)利用IPTG誘導(dǎo)。甲基營養(yǎng)型酵母通過加入甲醇進行誘導(dǎo)。 l 組織工程三要素是指種子細胞、 支架材料、 生長因子。 l 已分化的植物細胞要表現(xiàn)全能性，首先要脫分化形成分生細胞，然后再分化形成胚胎發(fā)育成植株。脫分化條件為創(chuàng)傷和外源激素l 甾類藥物和抗生素發(fā)現(xiàn)及成功合成被譽為半個世紀來醫(yī)藥工業(yè)取得最引人注目的兩大進展之一。它們都是含有環(huán)戊烷多氫菲核的化合物。 其生產(chǎn)工藝比較復(fù)雜，大多是化學合成和微生物轉(zhuǎn)化相結(jié)合的工藝路線。l 評價固定化酶（細胞）的指標包括固定化酶活力、偶聯(lián)率、半衰期、熱穩(wěn)定性等。l 單加氧酶和雙加氧酶直接在底物分子中加氧；氧化酶催化底物脫氫，脫下的氫再與氧結(jié)合生成水或過氧化氫；脫氫酶催化底物脫氫，但其催化脫下的氫與氧化態(tài)NAD(P)+結(jié)合，然后還原型NAD(P)H再通過呼吸鏈或NAD(P)H氧化酶將電子最終交給氧并生成水。 氧化反應(yīng)本質(zhì)是電子的得失。l 酯酶、脂肪酶和蛋白酶是生物催化手性合成中最常用的水解酶。 l 甾體生產(chǎn)的關(guān)鍵中間體是雄甾-1, 4-二烯-3, 17-二酮(ADD)、雄甾- 4-烯-3, 17-二酮(AD)和3-氧聯(lián)降膽甾-1,4-二烯-20酸(BDA)等。 l 11-羥化是微生物轉(zhuǎn)化甾體的最重要反應(yīng)，將皮質(zhì)類激素羥基化可增加其抑制炎癥的效應(yīng)。 l 甾體化合物羥基化反應(yīng)中，轉(zhuǎn)化到甾體上的羥基是直接取代原來碳骨架上的氫的位置，并且在取代過程中并沒有發(fā)生立體構(gòu)象的改變。羥基化反應(yīng)的氧是來自空氣中的氧。l 發(fā)酵過程pH變化的原因有哪些? 產(chǎn)物形成 某些產(chǎn)物本身呈酸性或堿性，使發(fā)酵液pH變化。如有機酸類產(chǎn)生使pH下降，紅霉素、潔霉素、螺旋霉素等抗生素呈堿性，使pH上升。菌體自溶，pH上升，發(fā)酵后期，pH上升 糖代謝：特別是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是補料的標志之一。氮代謝：當氨基酸中的-NH2被利用后pH會下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降；當碳源不足時，氮源當碳源利用pH上升。生理酸堿性物質(zhì)利用后，pH上升或下降。l 發(fā)酵過程的pH控制的方法有哪些？調(diào)節(jié)好基礎(chǔ)料的pH。基礎(chǔ)料中若含有玉米漿，pH呈酸性，必須調(diào)節(jié)pH。若要控制消后pH在6.0，消前pH往往要調(diào)到6.56.8在基礎(chǔ)料中加入維持pH的物質(zhì)，如CaCO3 ，或具有緩沖能力的試劑，如磷酸緩沖液等通過補料調(diào)節(jié)pH當補料與調(diào)pH發(fā)生矛盾時，加酸堿調(diào)pHl 微生物選擇性邊鏈降解的策略 1 對甾體化合物進行結(jié)構(gòu)修飾 2 向反應(yīng)體系中添加相關(guān)的酶抑制劑3 通過誘變獲得能夠選擇性邊鏈降解的突變株4 利用基因敲除技術(shù)將1，2位脫氫酶敲除，從而獲得唯一產(chǎn)物AD，也有利于產(chǎn)物回收；或?qū)?- 羥化酶敲除，以保護母核，獲得AD和ADD兩種產(chǎn)物 l 甾體藥物分類，代表性甾體藥物的結(jié)構(gòu)式。 甾體化合物又稱類固醇化合物，普遍存在于動植物組織內(nèi)。1 類皮質(zhì)激素 如:可的松、強的松、氫化可的松、地塞米松、潑尼松、氟輕松等。按其生理功能又可分為兩類:(l)鹽皮質(zhì)激素 主要作用于水鹽代謝，對維持機體的電解質(zhì)平衡和體液容量起重要作用，主要用于治療慢性腎上腺皮質(zhì)機能衰退癥(阿狄森氏癥)及低鉀血;(2)糖皮質(zhì)激素 糖皮質(zhì)激素 對糖、脂肪和蛋白質(zhì)三大類物質(zhì)代謝都具有調(diào)節(jié)作用，并能提高機體對各種不良刺激的抵抗力，臨床主要用于抗炎、抗過敏、抗休克等。2 性激素 分為雄性激素和雌性激素兩類，對生育功能及第二性征如聲音、體型的改變都有決定性作用。 3 蛋白同化激素 從睪酮衍生物中分化出來的藥物，其性激素作用己大為減弱，而蛋白同化作用仍然保留或增強，故使用安全。l 抗體工程制藥研究的發(fā)展歷程，每階段的上市藥物（2個） l 基因工程藥物的質(zhì)量控制包括哪些內(nèi)容？1 原材料的質(zhì)量控制 原材料的質(zhì)量控制是要確保編碼藥品的DNA序列的正確性，重組微生物來自單一克隆，所用質(zhì)粒純而穩(wěn)定，以保證產(chǎn)品質(zhì)量的安全性和一致性。2 培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制 在工程菌菌種貯存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定；在培養(yǎng)過程中，要求工程菌所含的質(zhì)粒穩(wěn)定，始終無突變；在重復(fù)發(fā)酵中，工程菌表達穩(wěn)定；始終能排除外源微生物污染。3 純化工藝過程的質(zhì)量控制 產(chǎn)品要有足夠的生理和生物學試驗數(shù)據(jù)，確證提純物分子批間保持一致；外源性蛋白質(zhì)、DNA與熱原都控制在規(guī)定限度下。 l 固定化酶的性質(zhì)特征（1）酶活力的變化：酶經(jīng)過固定化之后活力大都下降。其原因主要是酶活性中心的重要氨基酸與載體發(fā)生結(jié)合，酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化或酶與底物結(jié)合時存在空間位阻效應(yīng)。包埋法中還有底物與產(chǎn)物擴散阻力增大。（2）酶穩(wěn)定性的變化：包括對溫度、pH、蛋白酶變性劑和抑制劑的耐受程度。固定化后，穩(wěn)定性提高，有效壽命延長。其原因是限制了酶分子之間的相互作用，阻止了其自溶，增加了酶構(gòu)型的牢固程度。 熱穩(wěn)定性提高：熱穩(wěn)定性越高，工業(yè)化意義越大。熱穩(wěn)定性高可以提高反應(yīng)溫度和反應(yīng)速度，提高效率。 對有機試劑及酶抑制劑的穩(wěn)定性提高。 pH、蛋白酶等穩(wěn)定性提高。A 操作穩(wěn)定性：通常半衰期達到1個月以上時，即具有工業(yè)應(yīng)用價值。B 貯藏穩(wěn)定性：一般不能長期貯存，否則活力逐漸下降。若需長期保存，可在貯存液中添加底物、產(chǎn)物、抑制劑和防腐劑，并于低溫保存。C 對蛋白酶的穩(wěn)定性：大多數(shù)天然酶經(jīng)固定化后對蛋白酶的耐受力有所提高。可能的原因是由于空間位阻效應(yīng)使蛋白酶不能進入固定化酶內(nèi)部。（3）酶學特性的變化A、底物專一性 對底物的專一性下降。B、最適pH 最適pH可能變大，也可能變?。籶H-酶活曲線可能發(fā)生變化，其變化與酶蛋白和載體的帶電性質(zhì)有關(guān)。 C、最適溫度：一般升高。原因是固定化后空間結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定。 D、米氏常數(shù)(Km) ：Km值均發(fā)生變化，有的增加很小，有的增加很大，但不會變小。 E、最大反應(yīng)速度（