GB 4789.3-2010發(fā)布稿 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù) 發(fā)布稿.pdf

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.32010 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù) National food safety standard Food microbiological examination: Enumeration of coliforms 中 華 人 民 共 和 國(guó) 衛(wèi) 生 部中 華 人 民 共 和 國(guó) 衛(wèi) 生 部 發(fā)布 2010-03-26 發(fā)布 2010-06-01 實(shí)施 GB 4789.32010 I 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T 4789.3-2008食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)。 本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T 4789.3-2008相比，主要修改如下： 修改了標(biāo)準(zhǔn)的中英文名稱； “第二法 大腸菌群平板計(jì)數(shù)法”的平板菌落數(shù)的選擇范圍修改為“15 CFU150 CFU”； 刪除了“第三法 大腸菌群PetrifilmTM 測(cè)試片法”。 本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B為規(guī)范性附錄。 本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為： GB 4789.3-1984、GB 4789.3-1994、GB /T 4789.3-2003、GB /T 4789.3-2008。GB 4789.32010 1 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù) 1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中大腸菌群（Coliforms）計(jì)數(shù)的方法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中大腸菌群的計(jì)數(shù)。 2 術(shù)語(yǔ)和定義 2.1 大腸菌群 coliforms 在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。 2.2 最可能數(shù) most probable number，MPN 基于泊松分布的一種間接計(jì)數(shù)方法。 3 設(shè)備和材料 除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下： 3.1 恒溫培養(yǎng)箱：36 1 。 3.2 冰箱：2 5 。 3.3 恒溫水浴箱：46 1 。 3.4 天平：感量 0.1 g。 3.5 均質(zhì)器。 3.6 振蕩器。 3.7 無(wú)菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸頭。 3.8 無(wú)菌錐形瓶：容量 500 mL。 3.9 無(wú)菌培養(yǎng)皿：直徑 90 mm。 3.10 pH 計(jì)或 pH 比色管或精密 pH 試紙。 3.11 菌落計(jì)數(shù)器。 4 培養(yǎng)基和試劑 4.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉湯：見附錄 A 中 A.1。 GB 4789.32010 2 4.2 煌綠乳糖膽鹽（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉湯：見附錄 A 中 A.2。 4.3 結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）：見附錄 A 中 A.3。 4.4 磷酸鹽緩沖液：見附錄 A 中 A.4。 4.5 無(wú)菌生理鹽水：見附錄 A 中 A.5。 4.6 無(wú)菌 1 mol/L NaOH：見附錄 A 中 A.6。 4.7 無(wú)菌 1 mol/L HCl：見附錄 A 中 A.7。 GB 4789.32010 3 第一法 大腸菌群 MPN 計(jì)數(shù)法 5 檢驗(yàn)程序 大腸菌群MPN計(jì)數(shù)的檢驗(yàn)程序見圖1。 圖1 大腸菌群 MPN 計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)程序 6 操作步驟 6.1 樣品的稀釋 6.1.1 固體和半固體樣品： 稱取 25 g 樣品,放入盛有 225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi), 8000 r/min10000 r/min 均質(zhì) 1 min2 min,或放入盛有 225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打 1 min2 min，制成 1:10 的樣品勻液。 6.1.2 液體樣品：以無(wú)菌吸管吸取 25 mL 樣品置盛有 225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠）中，充分混勻，制成 1:10 的樣品勻液。 6.1.3 樣品勻液的 pH 值應(yīng)在 6.57.5 之間，必要時(shí)分別用 1 mol/L NaOH 或 1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)。 36148h2h36148 h2 h檢 樣 25 g(mL)樣品+225 mL 稀釋液，均質(zhì) 10 倍系列稀釋 選擇適宜 3 個(gè)連續(xù)稀釋度的樣品勻液，接種 LST 肉湯管 產(chǎn) 氣 不產(chǎn)氣 BGLB 肉湯不產(chǎn)氣 產(chǎn) 氣 大腸菌群陽(yáng)性 大腸菌群陰性 查 MPN 表 報(bào)告結(jié)果 GB 4789.32010 4 6.1.4 用 1 mL 無(wú)菌吸管或微量移液器吸取 1:10 樣品勻液 1 mL，沿管壁緩緩注入 9 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用 1 支 1 mL 無(wú)菌吸管反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成 1:100 的樣品勻液。 6.1.5 根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1 次，換用 1 支 1 mL 無(wú)菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過(guò)程不得超過(guò) 15 min。 6.2 初發(fā)酵試驗(yàn) 每個(gè)樣品，選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個(gè)稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過(guò)1 mL，則用雙料LST肉湯），36 1 培養(yǎng)24 h2 h，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，24 h2 h產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48 h2 h，產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。 6.3 復(fù)發(fā)酵試驗(yàn) 用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)， 移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯 （BGLB） 管中， 36 1 培養(yǎng)48 h2 h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計(jì)為大腸菌群陽(yáng)性管。 6.4 大腸菌群最可能數(shù)（MPN）的報(bào)告 按6.3確證的大腸菌群LST陽(yáng)性管數(shù)，檢索MPN表（見附錄B），報(bào)告每g（mL）樣品中大腸菌群的MPN值。 第二法 大腸菌群平板計(jì)數(shù)法 7 檢驗(yàn)程序 大腸菌群平板計(jì)數(shù)法的檢驗(yàn)程序見圖2。 圖2 大腸菌群平板計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)程序 8 操作步驟 檢 樣 25 g(mL)樣品+225 mL 稀釋液，均質(zhì) 10 倍系列稀釋 36118h24h計(jì)數(shù)典型和可疑菌落BGLB 肉湯36124h48h報(bào)告結(jié)果選擇 2 個(gè)3 個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，接種 VRBA 平板 GB 4789.32010 5 8.1 樣品的稀釋 按6.1進(jìn)行。 8.2 平板計(jì)數(shù) 8.2.1 選取2個(gè)3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度, 每個(gè)稀釋度接種2個(gè)無(wú)菌平皿， 每皿1 mL。 同時(shí)取1 mL生理鹽水加入無(wú)菌平皿作空白對(duì)照。 8.2.2 及時(shí)將15 mL20 mL冷至46 的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）約傾注于每個(gè)平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3 mL4 mLVRBA覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板，置于36 1 培養(yǎng)18 h24 h。 8.3 平板菌落數(shù)的選擇 選取菌落數(shù)在 15 CFU150 CFU 之間的平板，分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為 0.5 mm 或更大。 8.4 證實(shí)試驗(yàn) 從 VRBA 平板上挑取 10 個(gè)不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于 BGLB 肉湯管內(nèi)，36 1 培養(yǎng) 24 h48 h，觀察產(chǎn)氣情況。凡 BGLB 肉湯管產(chǎn)氣，即可報(bào)告為大腸菌群陽(yáng)性。 8.5 大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告 經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的試管比例乘以8.3中計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每g（mL）樣品中大腸菌群數(shù)。例：10-4樣品稀釋液1 mL，在VRBA平板上有100個(gè)典型和可疑菌落，挑取其中10個(gè)接種BGLB肉湯管， 證實(shí)有6個(gè)陽(yáng)性管， 則該樣品的大腸菌群數(shù)為： 1006/10104/g （mL） =6.0105 CFU/g（mL）。 GB 4789.32010 6 附錄A （規(guī)范性附錄） 培養(yǎng)基和試劑 A.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯 A.1.1 成分 胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g 氯化鈉 5.0 g 乳糖 5.0 g 磷酸氫二鉀（K2HPO4） 2.75 g 磷酸二氫鉀（KH2PO4） 2.75 g 月桂基硫酸鈉 0.1 g 蒸餾水 1 000 mL pH 6.80.2 A.1.2 制法 將上述成分溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié) pH。分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管 10 mL。121 高壓滅菌 15 min。 A.2 煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯 A.2.1 成分 蛋白胨 10.0 g 乳糖 10.0 g 牛膽粉（oxgall或oxbile）溶液 200 mL 0.1%煌綠水溶液 13.3 mL 蒸餾水 800 mL pH 7.20.1 A.2.2 制法 將蛋白胨、乳糖溶于約500 mL蒸餾水中，加入牛膽粉溶液200 mL（將20.0 g脫水牛膽粉溶于200 mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.07.5），用蒸餾水稀釋到975 mL，調(diào)節(jié)pH，再加入0.1%煌綠水溶液13.3 mL，用蒸餾水補(bǔ)足到1 000 mL，用棉花過(guò)濾后，分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10 mL。121 高壓滅菌15 min。 A.3 結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA） A.3.1 成分 蛋白胨 7.0 g 酵母膏 3.0 g 乳糖 10.0 g 氯化鈉 5.0 g 膽鹽或3號(hào)膽鹽 1.5 g 中性紅 0.03 g 結(jié)晶紫 0.002 g 瓊脂 15 g18 g 蒸餾水 1 000 mL pH 7.40.1 GB 4789.32010 7 A.3.2 制法 將上述成分溶于蒸餾水中，靜置幾分鐘，充分?jǐn)嚢?，調(diào)節(jié)pH。煮沸2 min，將培養(yǎng)基冷卻至45 50 傾注平板。使用前臨時(shí)制備，不得超過(guò)3 h。 A.4 磷酸鹽緩沖液 A.4.1 成分 磷酸二氫鉀（KH2PO4） 34.0 g 蒸餾水 500 mL pH 7.2 A.4.2 制法 貯存液： 稱取34.0 g的磷酸二氫鉀溶于500 mL蒸餾水中， 用大約175 mL的1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，用蒸餾水稀釋至1 000 mL后貯存于冰箱。 稀釋液：取貯存液1.25 mL，用蒸餾水稀釋至1 000 mL，分裝于適宜容器中，121 高壓滅菌15 min。 A.5 無(wú)菌生理鹽水 A.5.1 成分 氯化鈉 8.5 g 蒸餾水 1 000 mL A.5.2 制法 稱取8.5氯化鈉溶于1 000 mL蒸餾水中，121 高壓滅菌15 min。 A.6 1 mol/L NaOH A.6.1 成分 NaOH 40.0 g 蒸餾水 1000 mL A.6.2 制法 稱取40 g氫氧化鈉溶于1 000 mL蒸餾水中，121 高壓滅菌15 min。 A.7 1 mol/L HCl A.7.1 成分 HCl 90 mL 蒸餾水 1 000 mL A.7.2 制法 移取濃鹽酸90 mL，用蒸餾水稀釋至1 000 mL，121 高壓滅菌15 min。 GB 4789.32010 8 附錄B （規(guī)范性附錄） 大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表 B.1 大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表 每g（mL）檢樣中大腸菌群最可能數(shù)（MPN）的檢索見表B.1。 表B.1 大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表 陽(yáng)性管數(shù) 95%可信限 陽(yáng)性管數(shù) 95%可信限 0.10 0.0