骨髓細胞化學染色.ppt

骨髓細胞化學染色,細胞化學染色是以細胞形態(tài)學為基礎，利用化學反應原理，對細胞中的酶類、脂類、糖類及蛋白質等化學物質進行定性、定位或半定量分析的方法。 用于血液系統(tǒng)疾病的診斷、鑒別診斷及療效判斷；用于白血病細胞類型的判斷。,基本步驟,1. 固定:目的是保持細胞固有結構和化學成份不變，分蒸汽固定和液體固定。 2. 顯示:通過化學反應顯示被測物質，有偶氮偶聯(lián)法，聯(lián)苯胺法，金屬沉淀法等。 3. 復染：作為背景染色，使反應的細胞結構能更清楚顯示出來。,原理 機體多余的鐵以鐵蛋白及含鐵血黃素的形式儲存。這些鐵與低鐵氰化鉀在酸性溶液中發(fā)生反應而呈藍色。,鐵染色,試劑,40g/l亞鐵氰化鉀溶液。 4%鹽酸（38%濃鹽酸40ml，小心倒入340ml冷蒸餾水中，混勻） 20g/l伊紅溶液。 甲醛溶液。,方法,取骨髓片2張，加固定液固定10min，水洗待干。 將II緩緩滴入I內，混合后染液滴于骨髓涂片上， 37C放置60分鐘，流水沖洗數(shù)分鐘 流水沖洗，一張待干觀察外鐵，一張沖洗后用核固紅復染1分鐘，沖洗待干，觀察細胞內鐵。,結果觀察,幼紅細胞核染成鮮紅色，胞漿呈淡黃色，鐵粒呈藍綠色。 （1）細胞外鐵：用低倍鏡觀察骨髓小粒,細胞外鐵主要存在于巨噬細胞胞漿內,而被染成藍色，再用油鏡判斷陽性程度。分為（-）、（+）、（+）、（+）、（+）。,細胞外鐵陽性（+）,（2）細胞內鐵：油鏡下計數(shù)100個有核紅細胞，記錄陽性細胞（胞漿中有藍色顆粒即鐵粒幼細胞）的百分率。同時注意有無環(huán)形鐵粒幼細胞（6顆以上，并繞核1/2以上者）。,環(huán)形鐵粒幼紅細胞,1.細胞內鐵：計算100個中幼紅細胞、晚幼紅細胞，計數(shù)陽性率，正常值20-45%；鐵顆粒1-5粒，一般不超過10粒。 2.細胞外鐵：觀察骨髓小粒中巨噬細胞胞漿內藍色顆粒。正常為（+）或（+）。,參考值,臨床意義 鐵染色主要用于缺鐵性貧血與鐵粒幼細胞性貧血的診斷，也是指導鐵劑治療的一個靈敏而可靠的指標。特別是鐵粒幼細胞貧血形成特有的環(huán)形鐵粒幼細胞，也易與其他類型貧血區(qū)別。,中性粒細胞堿性磷酸酶 (NAP)染色(鈣-鈷法）,原理 當細胞內的NAP活性存在時，在pH為9.29.5的堿性條件下，它可將作用液中的基質-甘油磷酸鈉水解，釋出磷酸，進而與作用液中的鈣離子結合，成為磷酸鈣沉淀，再經過硝酸鈷和硫化胺的作用，生成不溶性硫化鈷，呈黑色沉淀定位于胞漿。,NAP染色測定(偶氮偶聯(lián)法）,檢測原理 血細胞內的堿性磷酸酶（NAP）在堿性環(huán)境下，水解-磷酸萘酚鈉，產生 -萘酚。后者與重氮試劑偶聯(lián)形成有色沉淀物，沉淀物的顯色深淺 與NAP活性成正比。 試劑盒組成 1. NAP固定液：1瓶5 2. NAPI液(-磷酸萘酚鈉)：1瓶 5 3. NAPII(堅牢藍B+tris-HCl)液:1瓶 5 4.蘇木素復染液:1瓶 5,方法,1.新鮮涂片滴加固定液(4 C)30秒,水洗待干。 2.將I液置入II液混合成為基質液。將涂片置入后，37C放置30分鐘，流水沖洗數(shù)分鐘，取出待干。 3.蘇木素復染1-2分鐘，水洗，待干，鏡檢。 4.結果顯示： 陽性細胞內出現(xiàn)暗紅色沉淀物，定位于胞質。 陰性細胞內無紅色沉淀物。,(-),(+),(+),(+),(+),(+)、（+）、（+）,積分計算,在油鏡下計數(shù)100個成熟中性粒細胞，包括桿狀核和分葉核粒細胞，結果分級為（-）、（+）、（+）、（+）、（+），分別為0-4分，所有細胞分值之和即為積分值，陽性細胞之和為陽性率。正常范圍：10-100分，陽性率10-50%,注意事項,1.標本宜新鮮，若不能及時測定可先用固定液處理后，可保存數(shù)天。 2.基質液配制后要及時應用，以免失效或降低陽性強度。 3.基質液為一次性使用，配制后不能反復應用。,臨床意義,1.各種急、慢性粒細胞性白血病，其NAP積分可降低甚至為零。 2.各種炎癥（細菌性），手術后，灼傷等NAP積分均可升高。 3. NAP活性對下列疾病有鑒別診斷價值： 1）.慢性粒細胞白血病與類白血病反應的鑒別2 ）.慢性粒細胞白血病與其他骨髓增生性疾病 的鑒別,3） PNH與再生障礙性貧血的鑒別 4） 惡性組織細胞病與反應性組織細胞增生癥的鑒別 5） 真性紅細胞增多癥與繼發(fā)性紅細胞增多癥的鑒別 6） 區(qū)別細菌性感染和病毒性感染,粒細胞和部分單核細胞胞漿中存在過氧化酶，它可將底物(H2O2)分解產生出新生態(tài)氧，進而使無色的聯(lián)苯胺氧化為藍色的聯(lián)苯胺藍，后者與亞硝基鐵氰化鈉結合，形成穩(wěn)定的藍色物質。,過氧化物酶(POX)染色原理,陽性的中性粒細胞,陽性的原始粒細胞和陰性的淋巴細胞,陽性的粒細胞和陰性的巨核細胞,臨床意義,用于鑒別急性粒細胞白血病、急性單核細胞白血病、急性淋巴細胞白血病。POX主要存在于粒系細胞中，細胞越成熟，其反應越強。原始單核細胞呈陰性，幼稚單核細胞和成熟單核細胞呈弱陽性反應。淋巴系、巨核系、紅細胞系各階段細胞均呈陰性反應。,酸性磷酸酶(ACP)染色,原理 在酸性條件下(pH值4.9)，磷酸酶將作用液中的基質(甘油磷酸鈉)水解，產生磷酸，進而與鉛作用生成磷酸鉛沉淀于細胞酶活性存在處，然后與硫化銨作用，生成黑色硫化鉛沉淀。,臨床意義,1.網狀細胞、吞噬細胞、組織細胞、粒細胞和單核細胞此酶呈陽性反應。 2.毛細胞白血病時，毛細胞呈陽性反應，且不為L-酒石酸所抑制。 3.戈謝細胞ACP染色陽性，而尼曼-匹克細胞呈陰性。,特異性酯酶(SE)染色 原理 氯醋酸AS-D萘酚酯酶為粒細胞所特有，故稱特異性酯酶，可將基質中的氯醋酸AS-D萘酚水解而產生萘酚AS-D，后者與重氮鹽偶聯(lián)生成不溶性有色沉淀定位于胞漿中。,臨床意義 1.正常血細胞反應：SE在分化好的原始粒細胞可呈弱陽性反應，早幼粒細胞呈強陽性反應，SE活性不隨粒細胞的成熟而增強。單核細胞呈陰性或弱陽性反應，其他細胞均呈陰性反應。,2.急性白血病類型的鑒別：急性粒細胞白血病時，原始粒細胞和早幼粒細胞的SE活性顯著增強；急性單核細胞白血病、急性淋巴細胞白血病、急性巨核細胞白血病時，其原始、幼稚細胞均呈陰性反應。,非特異性酯酶(NSE)染色 原理 -醋酸萘酚酯酶存在于單核細胞粒細胞及淋巴細胞中，故稱為非特異性酯酶。NSE水解基質液中-醋酸萘酯而產生-萘酚，后者與重氮鹽偶聯(lián)生成不溶性有色沉淀定位于胞質中。,陽性的原始單核細胞,被NaF抑制,被NaF抑制的原單細胞和不抑制的中幼粒細胞,臨床意義 1.正常血細胞反應：NSE主要存在于單核細胞系，從原單細胞到成熟單核細胞逐漸增強。陽性反應能被NaF抑制，粒細胞一般呈陰性反應。,2.急性白血病類型的鑒別：急性單核細胞白血病時，NSE呈強陽性或陽性反應，但NSE活性能被氟化鈉所抑制，稱為氟化鈉抑制試驗陽性。,急性粒細胞白血病時，有部分病例是弱陽性或陽性反應，但其酶活性不被氟化鈉抑制，即氟化鈉抑制試驗陰性。故本試驗可以用于急性單核細胞白血病的診斷及其與急性粒細胞白血病的鑒別。,糖原染色（又稱過碘酸-雪夫反應，PAS反應） 原理 含有乙二醇基的糖類，在過碘酸的作用下，經氧化而產生雙醛基，醛基進而與堿性復紅液(Schiff液)結合，使無色液體變成紫紅色染料，并沉著于含有糖原的細胞或組織結構上。,正常血細胞中中性粒細胞、單核細胞、巨核細胞及少數(shù)淋巴細胞呈陽性反應。 1.紅細胞系列的糖原反應及其診斷意義：正常人、再生障礙性貧血、巨幼紅細胞貧血的幼稚紅細胞均無陽性反應,臨床意義,巨幼貧的PAS染色幼紅細胞呈陰性,AML-M6 PAS 染色 （幼紅細胞呈顆粒狀陽性）,溶血性貧血及MDS偶而有弱陽性反應。紅白血病、缺鐵性貧血、地中海貧血的幼稚紅細胞呈陽性反應。,2.急性粒細胞白血病的原始及早幼粒細