一種適用于PCR 的土壤微生物DNA 的提取方法[J].doc

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壤微生物總DNA電泳結(jié)果顯示沒(méi)有差別,但是只有CTAB、溶菌酶、凍融裂解法提取的總DNA不需要純化,在增加Mg用量的條件下,只需用第一輪非特異PCR產(chǎn)物作為模板即可擴(kuò)增出16SrDNA片段。結(jié)論CTAB、溶菌酶、凍融裂解法提取土壤DNA,方法操作簡(jiǎn)單、快捷,同時(shí)適用于PCR分析,為土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性分析奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞?土壤微生物DNA;提取;PCR;16SrDNA中圖分類(lèi)號(hào)?S154.34?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A?文章編號(hào)?0517-6611(2010)02-00600-02AnExtractionMethodofSoilMicrobialDNAforPCRAnalysisLIHui?minetal?(CollegeofLifeScience,GuangxiNormalUniversity,Guilin,Guangxi541004)Abstract?ObjectiveTheamiofthisstudywastoextractDNAfromsoilmicroorganismsandestablishtherapidextractionmethodofsoilmi?crobialDNAforPCRanalysis.MethodTwokindsofdifferentdirectpyrolysismethodswereinvestigated.16SrDNAwasamplifiedwithbacterialuniver/doc/d946ed53f01dc281e53af0a7.htmlsalprmiers27Fand1492RbyPCR.ResultTheelectrophoresisresultsoftotalDNAfromsoilmicroorganismsbytwokindsofDNAex?tractionmethodshadnodifference.WithoutpurificationofTotalDNAextractedbyCTAB,lysozyme,freezingthawpyrolysismethod,thefirst?cycle2 non?specificPCRproductscouldbeusedasthetemplatetoamplify16SrDNAfragmentsundertheconditionsofaddingMgamoun.tConclu?sionSoilDNAcouldextractedbyCTAB,lysozyme,freezingthawpyrolysismethod.Themethodwassmipleandfastinoperation,suitableforPCRanalysis.Theresearchprovidedthebasisforthediversityanalysisofsoilmicrobialcommunities.Keywords?SoilmicrobialDNA;Extraction;PCR;16SrDNA?土壤是微生物棲居的主要場(chǎng)所,微生物在土壤中的分布及生命活動(dòng)與土壤肥力、植物營(yíng)養(yǎng)、植物病害和植被狀況等密切相關(guān)。因此,研究土壤微生物群落和多樣性對(duì)有機(jī)物的形成和分解、土壤監(jiān)測(cè)與生態(tài)環(huán)境改善等方面有著重要的意義?，F(xiàn)在廣泛公認(rèn)在環(huán)境樣品中只有0.001%15.000%的微生物具有可培養(yǎng)性,其中土壤約為0.300%,活性污泥約為11.000%15.000%。因此,利用傳統(tǒng)微生物學(xué)分離純化培養(yǎng)的方法來(lái)檢測(cè)環(huán)境樣品中的微生物會(huì)極大地低估樣品中微生物的多樣性。隨著分子生物學(xué)的理論與技術(shù)在微生物生態(tài)學(xué)研究中的不斷滲透,微生物多/doc/d946ed53f01dc281e53af0a7.html樣性的研究有了新的突破。而以16SrRNA序列分析作為微生物分類(lèi)系統(tǒng)的主要依據(jù)也得到了廣泛認(rèn)同。由于土壤的理化成分復(fù)雜,在提取的過(guò)程中含有較多的抑制成分,如腐殖酸、酚類(lèi)化合物、重金屬離子等,其中又以腐殖酸和腐殖酸類(lèi)似物的抑制作用最明顯,它們主要通過(guò)干擾裂解、使核酸降解或非特異性吸附和抑制酶活性的方式起作用?？傊?從土壤環(huán)境中高效地獲得微生物基因組DNA具有相當(dāng)?shù)碾y度,所提取DNA的質(zhì)量將在很大程度上影響后續(xù)的PCR、酶切等的研究工作3-421.1.2?試劑與儀器。TENP緩沖液(pH值8.0):50mmol/LTris,20mmol/LEDTA,100mmol/LNaC,l1%(W/V)PVP。DNA提取液 (pH值8.0):100mmol/LTris,100mmol/LED?TA,200mmol/LNaC,l2%(W/V)PVP,2%(W/V)CTAB。DNA提取液!(pH值8.0):100mmol/LTris,100mmol/LED?TA,100mmol/L磷酸鈉,1.5mol/LNaC,l1%CTAB,2?Cl2,1?g/mlBSA。SigmaK?38高速冷凍離心機(jī);GL?20G?!型高速冷凍離心機(jī);FR?980生物電泳圖象分析系統(tǒng)(上海復(fù)日);HH?S恒溫水浴鍋;DYY?5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀;PCR擴(kuò)增儀(AppliedBi?osystems)。1.2?試驗(yàn)方法1.2.1?土壤微生物DNA的提取。?玻璃珠、溶菌酶和SDS裂解法。參照李長(zhǎng)林等的方法略有改動(dòng):取0.5g土壤置于滅過(guò)菌的2ml離心管中,加入1.5mlTENPbuffer,1000r/min離心5min,棄上清液,取沉淀。加入0.2g直徑約1mm的玻璃珠和0.6mlDNA提取液 ,旋渦振蕩10min。加入50?l溶菌酶(100mg/ml),充分混勻,37?水浴2h,期間顛倒離心管4次。加入0.5ml2%的SDS緩沖液,68?水浴40min,隔10min顛倒離心管1次。1000r/min離心10min,取上清液。/doc/d946ed53f01dc281e53af0a7.html在上清液中加入等體積的氯仿/異戊醇(24?1),顛倒混勻,靜置10min。10000r/min離心15min,收集上清液。在上清液中加入0.5倍體積25%PEG6000,4?放置過(guò)夜,12000r/min離心10min,沉淀用70%乙醇洗滌,8000r/min離心5min,沉淀室溫晾干,溶于30?l雙蒸水中,備用。?CTAB、溶菌酶和凍融裂解法。參照李鈞敏等的方6法略有改動(dòng):取土壤樣品0.5g,置于滅過(guò)菌的2ml的離心管中,加入1.3ml12%(W/V)磷酸鈉,高強(qiáng)度旋渦振蕩10min。10000r/min離心5min,取沉淀,再次加入1.0ml12%,離心in,5。因此,無(wú)論是土壤宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建還是土壤微生物的分子生態(tài)學(xué)研究,提取土壤微生物基因組DNA是研究開(kāi)始的關(guān)鍵。1?材料與方法1.1?試驗(yàn)材料1.1.1?DNA提取材料。DNA提取材料的采樣地點(diǎn)位于廣西師范大學(xué)植物園。采樣地點(diǎn)的土地利用類(lèi)型為菜地,種植小白菜。采樣時(shí)間是2008年11月,采集菜地中表層的土壤,采集深度為010cm,用塑料袋封裝帶回,密封在-20?下保存。基金項(xiàng)目?廣西師范大學(xué)第三批青年骨干教師資助計(jì)劃(2007)。作者簡(jiǎn)介?李惠敏(1978-),女,廣西北流人,碩士,講師,從事分子生物學(xué)的教學(xué)與研究工作。*通訊作者。收稿日期?2009?09?0738卷2期?李惠敏等?一種適用于PCR的土壤微生物DNA的提取方法601入0.8ml12%磷酸鈉洗滌,混勻。10000r/min離心5min,取沉淀。加入DNA提取緩沖液!,混勻,再加入50?l溶菌酶(100mg/ml)顛倒混勻,37?水浴1h。65?水浴1h,中間反復(fù)凍融3次。10000r/min離心10min,取上清。加入等體積的氯仿/doc/d946ed53f01dc281e53af0a7.html/異戊醇抽提,12000r/min離心10min,取上清。DNA的沉淀同#?的PEG6000法進(jìn)行沉淀。1.2.2?DNA質(zhì)量檢測(cè)。?電泳檢測(cè)總DNA質(zhì)量。瓊脂糖凝膠電泳初步檢測(cè)總DNA質(zhì)量7EF)。雖然以CTAB、溶菌酶和凍融裂解法提取的總DNA為模板第1次PCR并沒(méi)有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物,而以此產(chǎn)物2.0?l為模板,在PCR緩沖液中已含有Mg的情況下,在20.0?l2 反應(yīng)體積中再加入2.0?l的Mg量進(jìn)行PCR即可得到預(yù)期大小的16SrDNA的特異條帶。2 ,經(jīng)電泳分離且染色后的凝膠直接在復(fù)日科技FR?200生物電泳圖像分析系統(tǒng)上拍照并分析所提取DNA的質(zhì)量。?16SrDNA的PCR擴(kuò)增。用于擴(kuò)增16SrDNA基因的細(xì)菌通用引物:27F(5%?AGAGTTTGATCCTGGCTCAG?3%)和41492R(5%?TACCTTGTTACGACTT?3%),由上海捷瑞生物工程有限公司合成。以廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室平板培養(yǎng)的大腸桿菌單菌落直接作為PCR反應(yīng)的DNA模板,建立16SrDNA的擴(kuò)增反應(yīng)體系。模板DNA(從平板上挑取大腸桿菌單菌落),TaqDNA聚合酶0.5?l(2.5U),10&PCR緩沖液2.5?,ldNTP(each20mmol/L)0.5?,l引物27F和引5物1492R各0.5?,l補(bǔ)水至25.0?。lPCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù):94?預(yù)變性5min,然后94?變性44s,57?退火60s,72?延伸2min,30個(gè)循環(huán),最后72?保溫5min。擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳,對(duì)EB染色后的凝膠進(jìn)行凝膠成像系統(tǒng)掃描后分析其擴(kuò)增產(chǎn)物。為了得到較好的PCR結(jié)果,筆者對(duì)PCR反應(yīng)成分包括Taq酶、BSA和Mg的用量等進(jìn)行了不同的組合,以?xún)?yōu)化P/doc/d946ed53f01dc281e53af0a7.htmlCR反應(yīng)條件。2?結(jié)果與分析2.1?土壤DNA的提取結(jié)果?以采集的土壤為材料,2種方法所得的土壤DNA的提取結(jié)果經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)圖1。圖1顯示,所提總DNA的電泳條帶較完整,拖帶現(xiàn)象不是很明顯,且DNA長(zhǎng)度大于21kb,在提取過(guò)程中無(wú)明顯降解和被剪切的現(xiàn)象。結(jié)合試驗(yàn)過(guò)程中的具體操作,使用玻璃珠、溶菌酶和SDS裂解法提取總DNA時(shí),土壤的預(yù)處理比較簡(jiǎn)單,但所用時(shí)間比較長(zhǎng),在離心去除雜質(zhì)過(guò)程中,經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)沉淀為棕黃色,所得DNA含雜質(zhì)較多。采用CTAB、溶菌酶和凍融裂解法時(shí),土壤的預(yù)處理所用時(shí)間也較長(zhǎng),但所得DNA含雜質(zhì)相對(duì)較少。2.2?16SrDNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果?從圖2可以看出,用這2種不同的方法所獲得的DNA不經(jīng)過(guò)處理直接用于PCR反應(yīng),即使額外地增加Mg或者同時(shí)增加Mg和BSA也無(wú)法擴(kuò)增出16SrDNA。說(shuō)明提取的DNA中可能含有污染物質(zhì)腐2 殖酸,它鰲合了Mg或是和DNA或蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)合,抑制了TaqDNA聚合酶的活性。而取1.02.0?l第1次PCR后的產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR反應(yīng),結(jié)果顯示,以CTAB、溶菌酶和凍融裂解法提取的DNA為模板經(jīng)2次PCR以后與直接用細(xì)菌擴(kuò)增的結(jié)果是一致的,而且提取的DNA不需經(jīng)過(guò)純化,2 只需進(jìn)一步稀釋和加入額外的Mg即可擴(kuò)增出16SrDNA(圖2泳道CD)。而以玻璃珠、溶菌酶和SDS裂解法提取的DNA經(jīng)過(guò)同樣的處理也無(wú)法擴(kuò)增出16SrDNA(圖2泳道2 2 2 ?注:泳道M為DNAMarker(?DNA/EcoRI HindIII);泳道AB為玻璃珠、溶菌酶和SDS裂解法提取的總DNA;泳道CD為CTAB、溶菌酶和凍融裂解法提取的總DNA。?Note:LaneM.DNAMarker(?DNA/EcoRI HindIII);LaneA-B.TotalDNAextractedbyglassbeads?lysozyme?SDSp/doc/d946ed53f01dc281e53af0a7.htmlyrolysismethod;LaneC-D.TotalDNAextractedbyCTAB?lysozyme?freezingthawpyrolysismethod.圖1?總DNA的電泳圖譜Fig.1?TheelectrophoretogramoftotalDNA?注:泳道M為DNAMarker(DL2000);泳道AB的PCR反應(yīng)模板為大腸桿菌菌落;泳道CD為CTAB法的PCR結(jié)果;泳道EF為SDS法的PCR結(jié)果。?Note:LaneM.DL2000DNAMarker;LaneA-B.E.colicoloniesasDNAtemplateinPCR;LaneC-D.PCRamplificationre?sultsofDNAbyCTABmethod;LaneE-F.PCRamplificationresultsofDNAbyCTABmethod.圖2?16SrDNA的PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.2?TheelectrophoretogramofPCRproductsof16SrDNA3?討論從土壤中直接裂解微生物以獲取總微生物DNA與從土壤中先分離微生物再提取DNA相比較,其優(yōu)勢(shì)明顯在于微生物種類(lèi)丟失較少;然而其不足之處在于這樣得到的DNA往往含有較多影響后續(xù)研究如PCR反應(yīng)的腐殖質(zhì)等雜質(zhì)。在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí),DNA的量少至10-12pg就可以進(jìn)行擴(kuò)增,但只要有微量腐殖酸或其類(lèi)似物存在就會(huì)抑制PCR擴(kuò)3增,因此,去除腐殖質(zhì)等是PCR反應(yīng)的一個(gè)關(guān)鍵所在。該研究中,2種土壤DNA的提取方法所得總DNA質(zhì)量在電泳圖譜上并沒(méi)有根本性區(qū)別,然而PCR的結(jié)果卻完全不同。)38卷2期?吳紅娟等?國(guó)內(nèi)外芍藥組織培養(yǎng)研究/doc/d946ed53f01dc281e53af0a7.html進(jìn)展619報(bào)道。?體胚誘導(dǎo)率低,且畸形體胚多。(生根率低、生根質(zhì)量不高。根從苗基部的愈傷組織產(chǎn)生,使根與莖中間形成離層,缺乏疏導(dǎo)組織的聯(lián)系,影響下一步的移栽工作。)試管苗移栽不能成活,主要原因?yàn)?生根質(zhì)量不高;移栽時(shí)期或者環(huán)境條件不適宜;組培苗生根后發(fā)生休眠。總之,由于上述原因,芍藥的組織培養(yǎng)技術(shù)還未能在生產(chǎn)上推廣和應(yīng)用,相關(guān)難題還有待進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)1234李嘉鈺.中國(guó)牡丹與芍藥M.北京:中國(guó)林業(yè)出版社,1999.秦魁杰.芍藥M.北京:中國(guó)林業(yè)出版社,2004.郭風(fēng)云.芍藥組織培養(yǎng)技術(shù)的研究D.北京:北京林業(yè)大學(xué),2001.TAKASHIH,MICHIKOA,TAKEHITOK.Invitropropagationofherba?ceouspeony(PaeonialactifloraPal.l)byalongitudinalshoot?splitmeth?odJ.PlantCellReports,1989(8):243-246.5于惠敏,路朋,何曉光.植物組織培養(yǎng)技術(shù)及常見(jiàn)問(wèn)題和解決措施J.山東教育學(xué)院學(xué)報(bào),2005(6):103.6張慶瑞,孫建洲,任凝輝,等.芍藥組織培養(yǎng)技術(shù)研究J.河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2006(4):88-90.7金飚,何小弟,吳建華,等.芍藥離體培養(yǎng)初步研究J.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2005(4):69.8趙明,張松榮,何小弟,等.芍藥愈傷組織誘導(dǎo)及遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的初步研究J.林業(yè)實(shí)用技術(shù),2009(1):10-12.9蘭海英.芍藥的胚培養(yǎng)及芍藥甙含量的研究D.呼和浩特:內(nèi)蒙古大學(xué),2003.10周美艷.芍藥組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化的初步研究D.揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué),2007.11胡秀嬋,肖平.觀賞兼藥用/doc/d946ed53f01dc281e53af0a7.html花卉?芍藥的組織培養(yǎng)J.農(nóng)業(yè)工程技術(shù):溫室園藝,2007(8):32.12張慶瑞,楊秋生,李永華.不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)芍藥離體培養(yǎng)的影響J.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,41(1):25-28.13胡映泉,馮海華,時(shí)寶凌.芍藥不定芽的誘導(dǎo)技術(shù)J.山西林業(yè)科技,2003(S1):23-33.14董永義,宋旭,郭園.觀賞芍藥組織培養(yǎng)研究J.林業(yè)實(shí)用技術(shù),2009(5):66.15張慶瑞.芍藥組織培養(yǎng)技術(shù)的初步研究D.鄭州:河南農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.16LEEBK,KEJA,KIMYS.Studiesonthethidazurontreatmentofan?thercultureinP.albifloraJ.JournaloftheKoreanSocietyforHorti?culturalScience,1992,33(5):384-395.17TERESAO,AGNIESZKAM,DANUTAK.RegenerationofPaeoniamloksewitschiiLom.andP.tenuifoliaL.invitrofromdefferentexplantsJ.ActaSocietatisBotanicorumPoloniae,1998,67(3/4):223-227.18趙蓉,于曉南.芍藥品種 桃花飛雪,愈傷組織以及芽的初步誘導(dǎo)C.中國(guó)觀賞園藝研究進(jìn)展2008?中國(guó)園藝學(xué)會(huì)觀賞園藝專(zhuān)業(yè)委員會(huì)2008年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集,2008:275-278.19仇道奎,張松榮,何小弟.芍藥組織培養(yǎng)J.中國(guó)花卉園藝,2009(2):32-33.20GABRYSZEWSKAE.Theinfluenceofcytokinins,thidiazuron,pa?://doc/d946ed53f01dc281e53af0a7.htmlarclobutrazolandredlightonshootproliferationofherbaceouspaeonycv.JadwigainvitroJ.JournalofFruitandOrnamentalPlantResearch,1998,6(3/4):157-169.21KIMYS,LEEBK.Effectofplantgrowthregulatorsandculturetemper?atureonembryocultureofP.albifloraJ.JournaloftheKoreanSocietyforHorticulturalScience,1995,36(2):255-262.22KIMYS,LEEB.Somaticembryogenesisandplantregenerationincotyle?doncultureofP.albifloraJ.JournaloftheKoreanSocietyforHorticul?turalScience,1996,37(6):827-830.23BRUKHINVB,BATYGINATB.Embryocultureandsomaticembryo?genesisincultureofP.anomalaJ.Phytomorphology,1994,44(3/4):151-157.24李航,王永偉,何松林.牡丹試管苗生根研究進(jìn)展和展望J.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(12):3499-3499,3513.25儲(chǔ)成才,李大衛(wèi).牡丹組織培養(yǎng)中玻璃化現(xiàn)象的出現(xiàn)及初步觀察J.河南師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,1992,20(1):70-73.26王瑤,岳樺.芍藥屬植物組織培養(yǎng)中褐化問(wèn)題的研究進(jìn)展J.黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué),2009(2):159-160.27何松林,陳笑蕾,陳莉,等.牡丹葉柄離體培養(yǎng)中褐化防止的初步研究J/doc/d946ed53f01dc281e53af0a7.html.河南科學(xué),2005,23(1):47-50.28郎玉濤,羅曉芳.牡丹愈傷組織的誘導(dǎo)及愈傷褐化抑制的研究J.河南林業(yè)科技,2007,27(1):4-6,29.29安佰義,趙飛.牡丹不同類(lèi)型總酚含量與PPO活性研究J.北華大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2005,6(2):169-172.64.30ZHANGW,GUOXD,WANGY,eta.lStudyontissuecultureandeffec?tivecloneestablishmentofHemisteptalyrataBungeJ.AgriculturalSci?ence&Technology,2009,10(1):47-50,104.31程麥風(fēng).大花蕙蘭的組織培養(yǎng)和快速繁殖技術(shù)研究J.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技,2005(Z2):190-191.32MENGDQ,YUANDB,ZHANGYF,eta.lReproductionofthethree-linegenicmalesterilelineparentMian7MB?1(BrasscianapusL.)andseedproductionofF1basedonsomatictissuecultureJ.AgriculturalScience&Technology,2009,10(1):22-25,114.33王二強(qiáng),王占營(yíng),王曉暉,等.國(guó)內(nèi)外牡丹組織培養(yǎng)技術(shù)研究現(xiàn)狀J.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技,2008(6):75-77.34ZHAOXJ,ZHANGHX.StudyontissuecultureandradiationmutationofAstragalusmembranaceusBge.var.mongholicus(Bge.)HsiaoJ.Ag?riculturalScience&Technology,2009,10(2):37-40.35李靖霞,朱國(guó)立,李曉娜,等.植物組織培http