搖瓶種子的制備及菌種的保藏.ppt

主題二 搖瓶種子的制備及菌種的保藏,帶圖象分析系統(tǒng)的微生物菌種 顯微觀察裝置,第三節(jié) 搖瓶種子的制備,將斜面種子或米孢子接種入裝在錐形搖瓶(又稱三角搖瓶)內(nèi)的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中，在搖床上振蕩培養(yǎng)得到的液體種子，就叫做搖瓶種子。 搖瓶種子可以在搖瓶中傳代，第一代俗稱“母瓶”，第二代就叫做“子瓶”。 母瓶或子瓶可用于生產(chǎn)上種子罐的接種，也常常作為搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)的種子。,1.搖瓶種子的制備工藝,(1)工藝流程 搖瓶種子的制備流程如圖5l所示。 斜面種子或米孢子 培養(yǎng)基配制 分裝 滅菌 接種 恒溫振蕩培養(yǎng) 搖瓶種子 圖51 搖瓶種子制備的工藝流程,（2）培養(yǎng)基配制 搖瓶種子以培養(yǎng)具有強(qiáng)生長活性的營養(yǎng)菌體為目的，因而在配制培養(yǎng)基時必須全面、均衡地滿足菌體生長對各種營養(yǎng)物質(zhì)的要求，包括碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因子等。 搖瓶種子在培養(yǎng)過程中一般不便于調(diào)節(jié)pH，故在培養(yǎng)基成分的選擇時還應(yīng)考慮培養(yǎng)過程中pH的穩(wěn)定，可以通過生理酸、堿性物質(zhì)的平衡搭配及加入磷酸鹽、碳酸鈣之類緩沖劑來實(shí)現(xiàn)。 分裝培養(yǎng)基的三角搖瓶用棉塞或泡沫塑料塞口，置高壓蒸汽鍋內(nèi)滅菌。 滅菌結(jié)束后要緩慢降壓，以免培養(yǎng)基暴沸沖濕塞子。,(3)接種 搖瓶種子的接種一般采用斜面種子挖塊法或米孢子粒計(jì)數(shù)接人法。 這種接種法難于掌握一致的接種量，可能影響搖瓶種子質(zhì)量的穩(wěn)定。 對接種量敏感的菌種，最好采用懸液接種法，即用無茵蒸餾水將斜面種子或米孢子粒上的細(xì)胞或孢子洗下，制成細(xì)胞或抱子懸液，然后按一定體積或一定細(xì)胞(孢子)數(shù)接種至搖瓶種子培養(yǎng)基中。,(4)培養(yǎng) 搖瓶種子在恒溫室內(nèi)的搖床上進(jìn)行培養(yǎng)。搖床分旋轉(zhuǎn)式和往復(fù)式兩種。 抗生素工廠常用的是旋轉(zhuǎn)式。 這種搖床由于主動軸和從動軸之間有一個偏心距(一般為2550mm)，從向而旋轉(zhuǎn)中產(chǎn)生振蕩作用，以利于培養(yǎng)時氣體交換。 為了使搖瓶中的水分蒸發(fā)量保持穩(wěn)定，恒溫室也應(yīng)控制一定的濕度。,(5)保存 搖瓶種子應(yīng)當(dāng)在培養(yǎng)成熟后立即使用。如果暫時不用，可置4冰箱中保存，保存期最好不超過3d。 經(jīng)過保存的搖瓶種子一般不用做生產(chǎn)種子，可用于搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)或小型發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)。,2搖瓶種子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),搖瓶種子是液體培養(yǎng)的種子，在質(zhì)量的控制方面，除了保證不污染雜菌及生產(chǎn)能力高這類與固體培養(yǎng)種子相同的一般標(biāo)準(zhǔn)外，還有其特殊標(biāo)準(zhǔn)。 (1)菌體濃度 (2)菌體生長階段,(1)菌體濃度,搖瓶種子以培養(yǎng)強(qiáng)生命力的營養(yǎng)菌體為目的，因而優(yōu)良的搖瓶種子，首先要有一定的活菌體量。 在一定的體積接種之下，活菌量越多，意味著至下一級種子的接種量越大，下一級種子的生長就越快，生長質(zhì)量一般也越好。 菌體濃度也不能太高，否則將影響搖瓶中的混合和氣體交換，降低菌體生長質(zhì)量。,（2）菌體生長階段,為了使搖瓶種子有較強(qiáng)的生長活力，同時又滿足上述達(dá)到較高菌體濃度的要求，應(yīng)將搖瓶種子的菌體生長階段控制在對數(shù)生長的后期。 這一菌體生長階段，本應(yīng)由測得的菌體濃度變化曲線來確定，但搖瓶系統(tǒng)取樣監(jiān)測不現(xiàn)實(shí)，且測量結(jié)果滯后，通常只憑在一定培養(yǎng)時間內(nèi)外觀稠度的觀察、靜置沉降量或離心濕菌體積的測定以及顯微鏡檢查的結(jié)果進(jìn)行判斷。,3.影響搖瓶種子質(zhì)量的因素及其控制,影響斜面種子質(zhì)量的各種因素一般也影響搖瓶種子的質(zhì)量。除此以外，還有以下一些因素必須予以注意。 （1）培養(yǎng)基組成 （2）搖瓶裝量 （3）搖床轉(zhuǎn)速 （4）搖瓶在搖床中的位置,（1）培養(yǎng)基組成,培養(yǎng)基組成應(yīng)能均衡地滿足營養(yǎng)菌體生長對所有營養(yǎng)成分的需要。 在這一前提下，培養(yǎng)基組成越豐富，所能獲得的菌體濃度就越高。 如果由于某一必需營養(yǎng)成分不足而打破了這種均衡，那么其它營養(yǎng)成分的豐富不僅不能促進(jìn)菌體的生長，反而因代謝的失衡引起pH的波動或(和)毒性中間代謝產(chǎn)物的積累，而降低菌體濃度。,（2）搖瓶裝量,搖瓶裝量影響搖瓶內(nèi)的通氣效果；裝量越小，通氣效果越好。 對搖瓶種子培養(yǎng)最合適的裝量，隨抗生素產(chǎn)生菌耗氧特性和搖床轉(zhuǎn)速而異，應(yīng)當(dāng)通過實(shí)驗(yàn)來確定。 一般情況下，250、500mL和750mL搖瓶的裝量分別為4050、6080mL和80100mL，基本上可以滿足各種抗生素?fù)u瓶種子培養(yǎng)的要求。,（3）搖床轉(zhuǎn)速,搖床轉(zhuǎn)速越高，偏心距越大，搖瓶內(nèi)的氣體交換速度就越快。 我國設(shè)計(jì)的搖床，一般偏心距為25mm，轉(zhuǎn)速為200300rmin。 但在使用中應(yīng)經(jīng)常檢查傳動皮帶的松緊，皮帶過松將使轉(zhuǎn)速顯著下降，從而影響搖瓶通氣效果的搖瓶種子的培養(yǎng)。,（4）搖瓶在搖床中的位置,由于代謝熱和機(jī)械振蕩熱的生成，搖床瓶內(nèi)的溫度必然高于搖床室室溫。 在搖床的不同位置，這種溫差存在明顯的差異。搖床上層的溫度高于下層，中間的溫度高于邊緣。 由于這種差異，使在不同位置上培養(yǎng)的搖瓶種子呈現(xiàn)不同的菌體生長濃度和生長階段，造成種子質(zhì)量的波動。 為了避免這種波動，搖瓶種子的培養(yǎng)最好在具有相同溫度帶的搖床固定位置上進(jìn)行。,4孢子接入量,對于絲狀菌來說，孢子接入量對搖瓶種子的質(zhì)量及其后的抗生素生產(chǎn)有很大的影響。 接入孢子量過少，延緩種子的生長及發(fā)酵前期的產(chǎn)物合成； 接入孢子量過大，能加速種子的生長和發(fā)酵前期產(chǎn)物合成的速度，但后期產(chǎn)物合成速度下降較快。 究竟采用多大的孢子接種量比較合適，對于每種抗生素的生產(chǎn)都應(yīng)當(dāng)通過實(shí)驗(yàn)來確定。,第四節(jié) 菌種保藏,在生產(chǎn)發(fā)酵中，具有高產(chǎn)有重要經(jīng)濟(jì)價值的某一代謝產(chǎn)物能力的微生物菌種的保存和長期保藏，對于一成功的工業(yè)發(fā)酵過程極為重要。,一、理想的菌種保藏方法應(yīng)具備的條件,(1) 經(jīng)長期保藏后菌種存活健在； (2) 保證高產(chǎn)突變株不改變表型和基因型，特別是不改變初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的高產(chǎn)能力。 (3)菌種保藏的基本措施是低溫、干燥、真空。,二、工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù),(1)冷凍干燥或真空干燥保藏； (2)超低溫或在液氮中冷凍保藏； (3) 轉(zhuǎn)接培養(yǎng)或斜面?zhèn)鞔２兀?(4)土壤或陶瓷珠等載體干燥保藏。,(一) 冷凍保藏,冷凍保藏為最簡單而有效的方法。 通過冷凍，使微生物代謝活動停止。 一般而言，冷凍溫度愈低，效果愈好。 為了獲得滿意的冷凍結(jié)果，通常應(yīng)在培養(yǎng)物中加入一定的冷凍保護(hù)劑。 冷凍保藏時溫度要求在-20以下，同時應(yīng)認(rèn)真掌握好冷凍速度和解凍速變。 冷凍深藏的缺點(diǎn)之一是培養(yǎng)物運(yùn)輸較困難。,冷凍保藏種類,一、普通冷凍保藏技術(shù)(-20) 二、超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60 一 -80) 三、液氮冷凍保藏技術(shù),1.普通冷凍保藏技術(shù)(-20),將液體培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲的細(xì)胞分接到試管或指管肉，然后貯藏于一冰箱的冷藏室中，或于溫度范圍在-5-20的普通冰箱(-20)中?；蛘?，將菌種培養(yǎng)在小的試管或培養(yǎng)瓶斜面上，待生長適度后，將試管或瓶口用橡膠塞嚴(yán)格封好，同上置于冰箱中保存。 用此方法可以維持若干微生物的活力12年。,應(yīng)注意的是經(jīng)過一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再用來保藏。 保藏過程中應(yīng)注意控制保藏溫度，培養(yǎng)瓶或試管應(yīng)嚴(yán)格密封。 這一方法雖簡便易行，但不適宜多數(shù)微生物的長期保藏。,2.超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60-80),要求長期保藏的微生物菌種，一般都要求在-60以下進(jìn)行保藏。 在超低溫冷藏柜中保藏菌種的一般方法是： (1)離心收獲對數(shù)生長中期至后期的微生物細(xì)胞； (2)用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細(xì)胞； (3)加入等體積的20甘油或10二甲亞砜； (4)混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于-70超低溫冰箱中保藏。,如果待保藏菌種生長在斜面上，則可用含10甘油的新配制液體培養(yǎng)基洗滌收獲。 超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在1 2min。 若干細(xì)菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏5年而活力不受影響。,3.液氮冷凍保藏技術(shù),(1)冷凍保護(hù)劑 在液氮冷凍保藏中，最常用的冷凍保護(hù)劑是二甲亞砜和甘油，最終使用濃度一般為甘油10、二甲亞砜5。 所使用的甘油一般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞砜最好為過濾滅菌。,(2)液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟 冷凍保藏菌種懸液的制備 a.從生長斜面制備菌懸液： 每一斜面加入5ml含10甘油的營養(yǎng)液體培養(yǎng)基；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌體細(xì)胞懸液；0.5lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶，,b.從浸沒培養(yǎng)物制備菌懸液： 在浸沒培養(yǎng)液中加入等體積20%無菌甘油；輕輕振蕩混勻培養(yǎng)液，如果菌體絮凝較緊，則需先用玻璃珠打散； 0.5 lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口； 將所有封好的安瓿置于5冰箱中3min，以使細(xì)胞和懸浮培養(yǎng)基之間達(dá)到平衡。,控速冷凍 a.將安瓿或液氮瓶置于鋁盒或布袋中，然后置于一較大的金屬容器中； b.將此金屬容器置于控速冷凍機(jī)的冷凍室中； c.以1 2/min的致冷速度降溫，直到溫度達(dá)到相對溫度之上幾度的細(xì)胞凍結(jié)點(diǎn)(通常為-30)； d.補(bǔ)加一定量的液氮至系統(tǒng)中，使細(xì)胞在凍結(jié)點(diǎn)時盡可能快地發(fā)生相變；,e.細(xì)胞凍結(jié)后，將致冷速度降為1/min，直到溫度達(dá)-50； f.將安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196)或 氣相(-156)中保存。 如果無控速冷凍機(jī)，則一般可將安瓿或液氮瓶置于一70冰箱中冷凍4h，然后迅速移入液氮罐中保存。,復(fù)蘇 a從液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中； b迅速將安瓿置于37 40水浴中，并輕輕搖動以加速解； c用巴氏吸管將安瓿中貯存培養(yǎng)物移接入含有2m1無菌液體培養(yǎng)基的試管中，用同一支吸管反復(fù)抽吸數(shù)次，然后取0.1 0.2ml (約4、8滴)轉(zhuǎn)接入瓊脂斜面上。,4. 凍干保藏,冷凍干燥的基本方法：是通過在減壓條件下使凍結(jié)的細(xì)胞懸液中的水分升華，使培養(yǎng)物干燥。 此法是微生物菌種長期保藏的最為有效的方法之一。 冷凍干燥過程中必須使用冷凍保護(hù)劑，目前國內(nèi)常用脫脂乳和蔗糖，國外尚有運(yùn)用動物血清等的。 大部分微生物菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏10年之久而不喪失活力。 而且經(jīng)凍干后的菌株無需進(jìn)行冷凍保藏，便于運(yùn)輸。,培養(yǎng)物的凍干過程,(1)操作步驟 啟動冷凍干燥器的致冷單元。當(dāng)冷凝器的溫度達(dá)到-40時啟動真空泵，使真空度達(dá)到2.674.00Pa。 將冷凍槽置于歧管之下方。槽中裝入23體積的異丙醇，然后插入溫度計(jì)及可調(diào)溫控儀降溫探頭。 打開降溫探頭控制醇浴溫度在-40，這一過程約需30min。 每支斜面加入2ml 20的脫脂乳，然后用巴氏吸管將斜面上的菌苔吹打下制成孢子或菌體均懸液，最終菌株濃度一般要求在106個m1用細(xì)菌浸沒培養(yǎng)物來保藏時，加入40的脫脂乳，混合制成含106個ml的均懸液。,4取下安瓿上的棉塞，然后用lml移液管分裝安瓿(0.2ml瓿)，重新塞好棉塞。 5輕輕振蕩安瓿，以使細(xì)胞重新懸浮。將安瓿與歧管相聯(lián)后迅速置于醇浴中，然后調(diào)節(jié)溫控裝置。使細(xì)胞懸液迅速凍結(jié)。,615min后，將歧管與真空泵相通。 7維持-40的醇浴溫度90 120min，然后調(diào)節(jié)溫控裝置。使醇浴溫度上升至-10，維持2h。 8關(guān)掉可調(diào)溫控裝置的降溫探頭，讓醇浴溫度上升至室溫(25) 9在冷凍干燥的最初4h內(nèi)應(yīng)定期測真空度，在安瓿置于真空下后1h內(nèi)，真空度必須達(dá)到13.33Pa，并于菌懸液接近干燥時逐漸降到2.674.0Pa。,10 在真空狀態(tài)下，讓安瓿保存在冷凍干燥機(jī) 中至少16h以獲得完全干燥。 11干燥后，在2.674.00Pa的真空度下封瓶 12在所有安瓿都封蓋好后，撤去真空。 13關(guān)閉真空泵。 14關(guān)閉冷凝器。,(2)凍干菌種的保藏與再生,1保藏：冷凍干燥后的培養(yǎng)物在低于5下保藏。較低的保藏溫度(-20-70)對于培養(yǎng)物的長期穩(wěn)定更好。 2復(fù)蘇： (1)在超凈工作臺中用70酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂輪在安瓿中銼一道溝。 (2)用無菌紗布或無菌毛巾包好安瓿，然后用手掰開安瓿,(3)在安瓿中加入0.51ml營養(yǎng)液體培養(yǎng)基，慢慢旋轉(zhuǎn)安瓿，使凍干菌種復(fù)水。然后將此轉(zhuǎn)接到一含有再生培養(yǎng)基的無菌試管中，或直接接種瓊脂斜面或涂布平板。 (4)在指管中凍干的菌種通常為絮粉狀，可以將此直接振落入盛有l(wèi)2ml液體培養(yǎng)基的試管中，輕輕振蕩5l0min，然后用此懸液接種適宜的再生培養(yǎng)基。,(二） 其他保藏方法,1.傳代保藏 2.礦物油中浸沒保藏,1.傳代保藏,將菌種定期在新鮮瓊脂培養(yǎng)基上傳代，然后在一定的生長溫度下生長和保存的傳代保藏方法。 可用于實(shí)驗(yàn)室中若干菌種的保藏。 此法最為簡單和經(jīng)濟(jì)，且不要求任何特殊的設(shè)備。 但此方法易發(fā)生培養(yǎng)基干枯、菌體自溶、基因突變。,因此要求在基本培養(yǎng)基上傳代為好，目的是能淘汰突變株；同時轉(zhuǎn)接菌量應(yīng)保持較低水平。 斜面培養(yǎng)物應(yīng)在密閉容器中于5保藏，以防止培養(yǎng)基脫水并能降低代謝活性。 此方法一般不適宜作工業(yè)生產(chǎn)菌種的長期保藏方法。,2.礦物油中浸沒保藏,將瓊脂斜面或液體培養(yǎng)物浸入礦物油中于室溫下保藏，此方法簡便有