食品中乳酸菌的檢測(cè).doc

。1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了含乳酸菌食品中乳酸菌（lactic acid bacteria）的檢驗(yàn)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的檢驗(yàn)。2 規(guī)范性引用文件本標(biāo)準(zhǔn)中引用的文件對(duì)于本標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3 術(shù)語(yǔ)和定義3.1 乳酸菌lactic acid bacteria一類可發(fā)酵糖主要產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的通稱。本標(biāo)準(zhǔn)中乳酸菌主要為乳桿菌屬（Lactobacillus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和鏈球菌屬（Streptococcus）。4 設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：4.1 恒溫培養(yǎng)箱：361。4.2 冰箱：25。4.3 均質(zhì)器及無(wú)菌均質(zhì)袋、均質(zhì)杯或滅菌乳缽。4.4 天平：感量0.1 g。4.5無(wú)菌試管：18 mm180 mm、15 mm100 mm。4.6 無(wú)菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸頭。4.7無(wú)菌錐形瓶：500 mL、250 mL。5 培養(yǎng)基和試劑5.1MRS（Man Rogosa Sharpe）培養(yǎng)基及莫匹羅星鋰鹽（Li-Mupirocin）改良MRS培養(yǎng)基：見附錄A中A.1。5.2 MC培養(yǎng)基（Modified Chalmers培養(yǎng)基）：見附錄A中A.2。5.3 0.5%蔗糖發(fā)酵管:見附錄A中A.3。5.4 0.5%纖維二糖發(fā)酵管:見附錄A中A.3。5.50.5%麥芽糖發(fā)酵管:見附錄A中A.3。5.6 0.5%甘露醇發(fā)酵管:見附錄A中A.3。5.7 0.5%水楊苷發(fā)酵管:見附錄A中A.3。5.8 0.5%山梨醇發(fā)酵管:見附錄A中A.3。5.9 0.5%乳糖發(fā)酵管:見附錄A中A.3。5.10七葉苷發(fā)酵管:見附錄A中A.45.11革蘭氏染色液：見附錄A中A.5。5.12莫匹羅星鋰鹽（Li-Mupirocin）：化學(xué)純。5.13半胱氨酸鹽酸鹽（Cysteine Hydrochloride）：純度99%。6 檢驗(yàn)程序乳酸菌檢驗(yàn)程序見圖1。7 操作步驟7.1樣品制備7.1.1 樣品的全部制備過程均應(yīng)遵循無(wú)菌操作程序。7.1.2 冷凍樣品可先使其在25條件下解凍，時(shí)間不超過18 h，也可在溫度不超過45的條件解凍，時(shí)間不超過15 min。7.1.3 固體和半固體食品：以無(wú)菌操作稱取25 g樣品，置于裝有225 mL生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi)，于8000 r/min10000 r/min均質(zhì)1 min2 min，制成1:10樣品勻液；或置于225 mL生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min2 min制成1:10的樣品勻液。7.1.4 液體樣品：液體樣品應(yīng)先將其充分搖勻后以無(wú)菌吸管吸取樣品25 mL放入裝有225 mL生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠）中，充分振搖，制成1:10的樣品勻液。7.2 步驟7.2.1 用1 mL無(wú)菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于裝有9 mL生理鹽水的無(wú)菌試管中（注意吸管尖端不要觸及稀釋液），振搖試管或換用1支無(wú)菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。7.2.2 另取1 mL無(wú)菌吸管或微量移液器吸頭，按上述操作順序，做10倍遞增樣品勻液，每遞增稀釋一次，即換用1次1 mL滅菌吸管或吸頭。7.2.3 乳酸菌計(jì)數(shù)7.2.3.1 乳酸菌總數(shù)根據(jù)待檢樣品活菌總數(shù)的估計(jì)，選擇2個(gè)3個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度，每個(gè)稀釋度吸取1 mL樣品勻液于滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。稀釋液移入平皿后，將冷卻至50的MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注入平皿約15mL，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使混合均勻。361厭氧培養(yǎng)48 h2 h，培養(yǎng)后計(jì)數(shù)。從樣品稀釋到平板傾注要求在15min內(nèi)完成。7.2.3.2 雙歧桿菌計(jì)數(shù)根據(jù)對(duì)待檢樣品雙歧桿菌含量的估計(jì)，選擇2個(gè)3個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度，每個(gè)稀釋度吸取1 mL樣品勻液于滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。稀釋液移入平皿后，將冷卻至50的莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽的MRS培養(yǎng)基傾注入平皿約15mL，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使混合均。361厭氧培養(yǎng)48 h2 h，培養(yǎng)后計(jì)數(shù)平板上的所有菌落數(shù)。從樣品稀釋到平板傾注要求在15 min內(nèi)完成。7.2.3.3 嗜熱鏈球菌計(jì)數(shù)根據(jù)待檢樣品嗜熱鏈球菌活菌數(shù)的估計(jì)，選擇2個(gè)3個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度，每個(gè)稀釋度吸取1 mL樣品勻液于滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。稀釋液移入平皿后，將冷卻至50的MC培養(yǎng)基傾注入平皿約15mL，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使混合均勻。361需氧培養(yǎng)48 h2 h，培養(yǎng)后計(jì)數(shù)。嗜熱鏈球菌在MC瓊脂平板上的菌落特征為：菌落中等偏小，邊緣整齊光滑的紅色菌落，直徑2 mm1 mm， 菌落背面為粉紅色。從樣品稀釋到平板傾注要求在15 min內(nèi)完成。7.2.3.4 乳桿菌計(jì)數(shù)7.2.3.1項(xiàng)乳酸菌總數(shù)結(jié)果減去7.2.3.2項(xiàng)雙歧桿菌與7.2.3.3項(xiàng)嗜熱鏈球菌計(jì)數(shù)結(jié)果之和即得乳桿菌計(jì)數(shù)。7.3 菌落計(jì)數(shù)可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（colony-forming units，CFU）表示。7.3.1選取菌落數(shù)在30 CFU300 CFU之間、無(wú)蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30 CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300 CFU的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。7.3.2其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2，代表一個(gè)平板菌落數(shù)。7.3.3當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無(wú)明顯界線的鏈狀生長(zhǎng)時(shí)，則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。7.4 結(jié)果的表述7.4.1 若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每g（mL）中菌落總數(shù)結(jié)果。7.4.2若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，按公式（1）計(jì)算：式中：N樣品中菌落數(shù)；C平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和；n1第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；n2第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；d稀釋因子（第一稀釋度）。7.4.3 若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300CFU，則對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。7.4.4若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30CFU，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。7.4.5 若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。7.4.6若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30CFU300CFU之間，其中一部分小于30CFU或大于300CFU時(shí)，則以最接近30CFU或300CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。7.5 菌落數(shù)的報(bào)告7.5.1菌落數(shù)小于100CFU時(shí)，按“四舍五入”原則修約，以整數(shù)報(bào)告。7.5.2 菌落數(shù)大于或等于100CFU時(shí)，第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來(lái)表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。7.5.3 稱重取樣以CFU/g為單位報(bào)告，體積取樣以CFU/mL為單位報(bào)告。8 結(jié)果與報(bào)告根據(jù)菌落計(jì)數(shù)結(jié)果出具報(bào)告，報(bào)告單位以CFU/g（mL）表示。9 乳酸菌的鑒定（可選做）9.1 純培養(yǎng)挑取3個(gè)或以上單個(gè)菌落，嗜熱鏈球菌接種于MC瓊脂平板，乳桿菌屬接種于MRS瓊脂平板，置361厭氧培養(yǎng)48 h。9.2 鑒定9.2.1雙歧桿菌的鑒定按GB 4789.34的規(guī)定操作。9.2.2 涂片鏡檢：乳桿菌屬菌體形態(tài)多樣，呈長(zhǎng)桿狀、彎曲桿狀或短桿狀。無(wú)芽胞，革蘭氏染色陽(yáng)性。嗜熱鏈球菌菌體呈球形或球桿狀，直徑為0.5m2.0m，成對(duì)或成鏈排列，無(wú)芽胞，革蘭氏染色陽(yáng)性。9.2.3乳酸菌菌種主要生化反應(yīng)見表1和表2。附錄A培養(yǎng)基及試劑A.1 MRS培養(yǎng)基A.1.1成分蛋白胨10.0 g牛肉粉5.0 g酵母粉4.0 g葡萄糖20.0 g吐溫801.0 mLK2HPO47H2O2.0 g醋酸鈉3H2O5.0 g檸檬酸三銨2.0 gMgSO47H2O0.2 gMnSO44H2O0.05 g瓊脂粉pH 6.215.0 gA.1.2制法將上述成分加入到1 000 mL蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH，分裝后121高壓滅菌15 min20 min。A.1.3 莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽改良MRS培養(yǎng)基A.1.3.1莫匹羅星鋰鹽儲(chǔ)備液制備：稱取50mg莫匹羅星鋰鹽加入到50 mL蒸餾水中，用0.22mm微孔濾膜過濾除菌。A.1.3.2半胱氨酸鹽酸鹽儲(chǔ)備液制備：稱取250mg莫匹羅星鋰鹽加入到50 mL蒸餾水中，用0.22mm微孔濾膜過濾除菌。A.1.3.2制法將A.1.1成分加入到950 mL蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH，分裝后121高壓滅菌15 min20 min。臨用時(shí)加熱熔化瓊脂，在水浴中冷至48，用帶有0.22mm微孔濾膜的注射器將莫匹羅星鋰鹽儲(chǔ)備液及半胱氨酸鹽酸鹽儲(chǔ)備液制備加入到熔化瓊脂中，使培養(yǎng)基中莫匹羅星鋰鹽的濃度為50mg/mL，半胱氨酸鹽酸鹽的濃度為500mg/mL。A.2 MC培養(yǎng)基A.2.1成分大豆蛋白胨 5.0 g牛肉粉3.0 g酵母粉3.0 g葡萄糖20.0 g乳糖 20.0 g碳酸鈣10.0 g瓊脂15.0 g蒸餾水1 000 mL1中性紅溶液pH6.05.0 mLA.2.2制法將前面7種成分加入蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH，加入中性紅溶液。分裝后121高壓滅菌15 min20 min。A.3 乳酸桿菌糖發(fā)酵管A.3.1基礎(chǔ)成分牛肉膏5.0 g蛋白胨5.0 g酵母浸膏5.0 g吐溫800.5 mL瓊脂1.5 g1.6%溴甲酚紫酒精溶液1.4 mL蒸餾水1 000 mLA.3.2 制法按0.5%加入所需糖類，并分裝小試管,121高壓滅菌15 min20 min。A.4七葉苷培養(yǎng)基A.4.1成分蛋白胨5.0 g磷酸氫二鉀1.0 g七葉苷3.0 g枸櫞酸鐵0.5 g1.6%溴甲酚紫酒精溶液1.4 mL蒸餾水100 mLA.4.2制法將上述成分加入蒸餾水中，加熱溶解，121高壓滅菌15 min20 min。A.5革蘭氏染色液A.5.1結(jié)晶紫染色液A.5.1.1成分結(jié)晶紫1.0 g95乙醇20 mL1草酸銨水溶液80 mLA.5.1.2制法將結(jié)晶紫完全溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。A.5.2革蘭氏碘液A.5.2.1成分碘1.0 g碘化鉀2.0 g蒸餾水300 mLA.5.2.2制法將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合，加入蒸餾水少許充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300 mL。A.5.3 沙黃復(fù)染液A.5.3.1成分沙黃0.25 g95乙醇10 mL