本科論文_細腳擬青霉發(fā)酵液中清除DPPH自由基活性物質的分離和制備

1 目 錄 中文摘要 2 關鍵詞 2 前言 2 1 材料與方法 3 1.1 材料 3 1.1.1 供試菌株 3 1.1.2 常用培養(yǎng)基 3 1.1.3 顯色劑 3 1.1.4 主要儀器 3 1.2 研究方法 4 1.2.1 供試菌株液體種子的準備 4 1.2.2 發(fā)酵罐培養(yǎng)與發(fā)酵液的處理 4 1.2.3 清除自由基活性 檢測 模型 4 1.2.4 活性指導下的分離 5 2.結果與分析 7 2.1 活性組分的初步確定 7 2.2 乙酸乙酯相活性組分的硅膠柱色譜的粗分及活性跟蹤 8 2.3 樣品的凝膠柱色譜和活性追蹤 9 2.4 樣品的純度鑒定 : 10 2.4.1 TLC 檢驗 10 2.4.2 高效液相色譜分析 11 2.5 樣品的活性驗證 12 3.討論 12 參考文獻 12 致謝 13 英文摘要 14 2 細腳擬青霉發(fā)酵液中清除 DPPH 自由基活性物質的 分離和制備 作者：王偉 指導老師：樊美珍 （安徽農業(yè)大學生命科學學院 2003 級生物科學二班，安徽合肥， 230036） 摘要 :本文對一株細腳擬青霉菌株 P6發(fā)酵液中清除 DPPH自由基活性物質進行了研究 ,將發(fā)酵液選擇 45減壓濃縮到一定體積，采用 70乙醇醇沉去除大分子適當濃縮后用不同有機溶劑萃取處理，采用 TLC- DPPH（ 二苯基苦基苯肼） 薄層層析法和 DPPH 自由基酶標儀法對發(fā)酵液及其提取物中 清除 DPPH 自由基活性物質進行定性和定量檢測。結果表明，在起始反應濃度為 5.0 mg/ml 時的有機萃取相中，乙酸乙酯與三氯甲烷萃取相組分的活性最高，對 DPPH 的相對清除率分別為 71.6 %， 66.3 %；且與水相的抑制率也基本互補。因此，初步判定發(fā)酵液的脂溶性活性成分主要存在于乙酸乙酯相。對乙酸乙酯相中的活性成分進行分離、制備后，得 一較純組分 P6-01，經活性測定，在反應濃度為 0.5mg/ml 時，于 37下保溫 10min時對 0.4mg/mlDPPH 自由基清除率為 78.5。 關鍵詞： 蟲草 無性型 次生代謝產物 前言 細腳擬青霉（ Paecilomyces tenuipes (Peck) Samson） 是一種世界性分布的蟲生真菌，在國內常見寄生于南方森林中鱗翅膜昆蟲的蛹和幼蟲，被認為是蟲草的無性階段 1。由于蟲生菌與昆蟲的長期協(xié)同進化關系，近年來蟲生菌被認為是最有可能從中發(fā)現(xiàn)新型生物活性物質的類群，有關研究受到世界各國的廣泛 關注 2。目前對細腳擬青霉的研究主要有如下幾方面：一、單純的生物活性研究，如蘇銀法等（ 1996） 曾對該菌株的孢梗束水提物進行了對小鼠中樞神經和免疫器官的影響試驗，發(fā)現(xiàn)細腳擬青霉具有明顯的鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用 4；金麗琴等（ 1997,2002） 曾對細腳擬青霉菌絲體水煎品對大鼠脂質過氧化物和還原型谷光甘肽水平影響進行試驗，結果表明能減少脂質過氧化物的生成，維持還原型谷光甘肽的含量；同時發(fā)現(xiàn)細腳擬青霉總多糖對大鼠非特異性免疫調節(jié)作用 5-6。此外，還有其水提物治療糖尿病的報道以及抗菌、抗瘧、殺蟲和細胞毒的報道 (Nam et al, 2001； Kikuchi et al， 2004) 。二、單純的成分研究，如陳祝安和徐珊（ 1989）和陳召南（ 1992）等曾分別對細腳擬青霉的固體培養(yǎng)物與天然冬 蟲夏草的氨基酸、甾醇類、糖醇和生物堿等成分進行過比較分析； Kikuchi 等（ 2004）報道了一種單端孢烷和烯類骨架的新化合物 Tenuipesine A 和 Spirotenuipesine A 和B 。三、活性成分的 鑒定。泰國學者 Nilanonta 等 （ 2002） 曾通過特殊培養(yǎng)方式從中發(fā)現(xiàn)了具抗菌、殺蟲活性的 Beauveric in A 和 B、 Allobeauvericin A、 B 和 C11；另外， Nam 等 （ 2001）還報道了兩種細胞毒成分： Acetoxyscripenediol 和 一種麥角甾醇過氧化物 12。 雖然對細腳擬青霉的相關研究已有較多的報道，但還未見其清除二苯代苦味肼基自由基（ 1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl, DPPH）活性系統(tǒng)研究的詳細報道?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，人體內很多疾病都與機體內的自由基有著密切的關系，對自由基方面的研究已經成為醫(yī)藥學界研 3 究熱點 13。 本實驗室在一次大規(guī)模的生物活性物質篩選中發(fā)現(xiàn)一株細腳擬青霉 P6 的發(fā)酵物具有較強的清除自由基活性。為了進一步確定該菌株株發(fā)酵液提取物的清除自由基活性，本研究將分別對搖瓶發(fā)酵液和其提取物進行清除 DPPH 自由基研究，為進一步 的結構研究和相關藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。 1 材料 與方法 1.1 材料 1.1.1 供試菌株 實驗所用菌株均由安徽農業(yè)大學微生物防治省級重點實驗室提供。 1.1.2 常用培養(yǎng)基 固體斜面培養(yǎng)基 (SDAY)：蛋白胨 10 g/L、酵母浸出粉 10 g/L、葡萄糖 40 g/L、瓊脂 20 g/L，以蒸餾水定容。 固體斜面培養(yǎng)基 (PDA)：馬鈴薯 200 g/L （去皮，切成小塊煮沸 20min，紗布過慮），葡萄糖 20 g/L，瓊脂 20 g/L，以蒸餾水定容。 液體搖瓶培養(yǎng)基（ SDY）：蛋白胨 10 g/L、酵母浸出粉 10 g/L、葡萄糖 40 g/L、 pH 6.7，以蒸餾水定容。 固體平皿培養(yǎng)基 (SDAY)：蛋白胨 10 g/L、酵母浸膏 10 g/L、葡萄糖 40 g/L、瓊脂 20 g/L，以蒸餾水定容。 深層液體發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨 1.0 %、酵母粉 1.0 %、白砂糖 4.0 %?；螯S豆粉3%、酵母粉 1.0 %、白砂糖 2.0 %。 1.1.3 顯色劑 碘試劑：在密閉的玻璃缸內將少許碘結晶或將少許碘結晶與適量的 75 150 m 硅膠攪拌均勻，顯色時，將點過樣品薄層板放入碘缸內即可。 15 %硫酸乙醇溶液：取濃硫酸 120ml 沿瓶壁緩慢的加入到盛有無水乙醇（分析純） 780 ml的廣口瓶中，同時不斷地攪拌，蓋上瓶蓋備用。顯色時，將點過樣品的薄層板用鑷子直接浸入其中，取出淋干后放置電爐上小火慢慢烘烤或放在電熱板上烘烤到呈現(xiàn)明顯的斑點即可。 1.1.4 主要儀器 本研究使用的具體儀器及型號見下表。 表 1 主要儀器 及其型號 Table 1 Main equipments and their types 儀器名稱 Name 規(guī)格型號 Type 生產廠家 Manufactory HPLC SP930D, Uv730D 韓國 Younglin 公司 全波長掃描酶標儀 Spectra Max M2 美國 Molecular device 公司 系列色譜柱 玻璃柱 中國科技大學玻璃儀器廠 自動收集儀 BSZ-100 上海滬西分析儀器廠 4 高效薄層硅膠板 GF254 分析型（鋁基和玻璃基） 德國 Merck 公司和青島海洋化工廠 高效薄層硅膠板 GF254 制備型（玻璃基） 安徽岳西硅源材料廠 光照培養(yǎng)箱 LRH-250-G 廣東省醫(yī)療器械廠 手提式壓力蒸汽滅菌器 YXQ.SG4.280 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司 全溫振蕩培養(yǎng)箱 HZQ-F 160 哈爾濱東聯(lián)電子公司 30L 發(fā)酵罐 GY-70C 江蘇理工大學 電熱蒸汽發(fā)生器 DZFZ 上海佳田制造有限公司 電熱恒溫培養(yǎng)箱 HH-B11-560 上海躍進醫(yī)療器械公司 數(shù)碼顯微鏡 VHX-100 日本 Keyence 公司 高速分散器 PT3100 瑞士 POLYTRON 酸度計 818 美國 ORION 公司 三用紫外分析儀 WFH-203B 上海精科實業(yè)有限公司 真空旋轉蒸發(fā)儀 SENCO R-502B 上海申勝生物技術有限公司 超凈工作臺 AIR TECH 蘇凈集團安泰公司 數(shù)控超聲波清 洗器 KH5200 昆山禾創(chuàng)超聲儀器公司 冷凍干燥系統(tǒng) 040520111G 美國 LABCONCO 公司 超速離心機 2K15 美國 Sigma 公司 管式離心機 GQ105 上海市離心機械研究所 高速冷凍離心機 TL 15 江蘇圖門離心機廠 梅特勒電子天平 AE200 型 上海分析儀器廠 循環(huán)水式真空泵 SHZ-D 河南鞏義英豫華儀器廠 超低溫冰箱 MDF-382E 日本三洋公司 1.2 研究方法 1.2.1 供試菌株液體種子的準備 將供試菌株 P6 的固體種子分別接種至液體搖瓶培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)時裝液 量為 200 ml500 ml，接種量控制在 5，接種后置于全溫振蕩培養(yǎng)箱，溫度 25、轉速 180 rpm，培養(yǎng)7d 備用。 1.2.2 發(fā)酵罐培養(yǎng)與發(fā)酵液的處理 采用 30L 發(fā)酵罐進行發(fā)酵，初始裝液量 20L，接種量 10 %，通氣量 1:1（ v/v），以棗莊市嶧城廠生產的食用消泡劑進行消泡， 25恒溫通氣培養(yǎng) 10d 出罐。采用管式離心機進行發(fā)酵液和菌絲體分離；將獲得的發(fā)酵液用低溫真空濃縮法進行濃縮處理，濃縮至原體積的1/10，后加入濃度為 95%乙醇使發(fā)酵液中的乙醇濃度含量達到 70%。過夜，再用布氏漏斗真空抽濾法去除 生物大分子（多糖和蛋白）。取出上清液進行濃縮，冷凍干燥，凍干粉備用；菌絲體采用 50 熱干燥法烘干保存?zhèn)溆谩?1.2.3 清除自由基活性 檢測 模型 1.2.3.1 供試樣品的準備 電子天平準確的稱取上述供試菌株發(fā)酵液凍干粉 1g，用乙酸乙酯 10ml，于 100Hz 超聲波中提取 30 min。離心吸取上清液并吹干稱重，溶于甲醇溶液，配成 濃度為 10.0 mg/mL 作為初試樣品 5 1.2.3.2 清除自由基活性物質定性檢測 取濃度為 10 mg/mL 上述提取物的甲醇溶液進行 DPPH 自由基薄層試驗，以 1.0 mg/mL的抗壞血酸 甲醇溶液為陽性對照。點樣量為 4 L， 展開劑為氯仿 :甲醇 = 80:20。等流動相到達距上沿 1cm 的地方，取出讓展開劑自然揮去，然后噴濃度為 1 mg/mL 的 DPPH 自由基 95乙醇溶液進行顯色，并用鉛筆輕輕的劃下活性點。 1.2.3.3 清除自由基活性物質的定量測定 參考胡豐林和陸瑞利（ 2004）的 DPPH 自由基酶標儀法。加各濃度樣品 100 L 和事先用95乙醇配好的 0.4 mg/mL 的 DPPH 自由基試劑 100 L于 96 孔酶標板中，每個樣品設三個重復。樣品加入后將 96 孔酶標板置于酶標儀中振動 30 s，在 37和 517 nm 波長下測定其吸光值（ Ap）； 37保溫 10min 后再測定一次。同時測定不加 DPPH 自由基試劑的樣品空白吸光值 (Ac)和加 DPPH 自由基試劑但不加樣品（ 100 L 80甲醇代替樣品）的吸光值（ Amax）。最后按下述公式計算： 相對清除率（） =1-（ Ap-Ac） /Amax 100 1.2.4 活性指導下的分離 活性提取物的確定 ： 將篩選出的活性菌株 發(fā)酵液凍干品分別用石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水等試劑浸提。提取物經低溫真空濃縮凍干后，用適當?shù)娜軇┡涑梢欢舛?的溶液，用DPPH 活性測定模型進 行活性測定，找出活性提取物以進行進一步的分離純化。 1.2.4.1 薄層層析（ TLC） 薄層層析（ thin-layer chromatography，簡稱 TLC）是在吸附層析的基礎上發(fā)展起來的，目前已廣泛應用于定性和定量分析、分離、純化、制備目的，它的作用機理主要包括吸附、分配、離子交換等作用。 按照相似相溶規(guī)律，極性組分易溶于極性溶劑，非極性組分則易溶于非極性溶劑中，因此在同一薄板上，不同極性化合物的組分在同一溶劑中的溶解度不同，溶解度愈大，移動速度愈快；反之則相反。展層的過程即樣品各組分得到分離的過程，它 也是一個吸附，解析，再吸附，再解析的連續(xù)過程。 薄層層析的定性分析與紙層析類似，對組分簡單樣品的定性，可根據(jù)在同一薄層板上，樣品組分的 Rf值和標準樣品的 Rf值對照；對于復雜樣品的定性，需數(shù)種方法才能確定；薄層層析后，樣品組分的定量分析有洗脫測定法和原位法。 試驗方法：用毛細管吸取樣品點到已活化的 GF254高效薄層層析硅膠板上，點的直徑在 2 3 mm，距薄層一端距離為 1cm 左右，各樣品點之間的距離一般也控制在 1cm 左右。將硅膠板放入已飽和的層析槽中展開，當展開溶劑上行到距硅膠板另一端 1cm 處時，取出硅膠板，待溶劑揮發(fā)干后于紫外燈下觀察結果并用鉛筆在有樣品的地方圈出，同時碘染顯色和 10%濃硫酸中顯色，主要用于對過層析柱后的樣品的合并以及對分離得到的單體進行鑒定。 6 1.2.4.2 硅膠柱層析 (采用濕法裝柱干法上樣法 ) 洗脫劑極性的選擇及起始裝柱溶劑的選擇：采用薄層色譜法對洗脫劑極性和起始裝柱溶劑進行選擇。洗脫劑一般多用混合溶劑，但起始溶劑的選擇原則就以開始的純溶劑為展開劑對樣品展開，點或利用 TLC 色譜選擇樣品保留在點樣剛剛出頭的溶劑為裝柱的溶劑，然后通過比例的調節(jié)，按照由極性小逐漸過渡到極性大的洗脫劑為原則（正向層 析），從而達到分離物質的目的。由于薄層色譜的固定相是干燥的，干燥硅膠的吸附活性是一般濕法裝柱的硅膠吸附活性的 2 倍。因此，洗脫劑的極性選擇原則采用最大極性展開劑使樣品在薄層板上的Rf值在 1/2 以下為宜。 裝柱：首先將適量洗脫劑倒入柱內，排走其中的空氣，然后把預先用洗脫劑浸泡好的硅膠（硅膠的用量約為樣品量的 30 50 倍）攪勻，隨即將此懸浮液連續(xù)傾入柱（硅膠柱色譜規(guī)格 4.040cm ）中，待其自然沉降至柱高的 1/4 1/3 時打開柱下端的閥門，讓溶劑緩慢流出，硅膠沉降時，輕輕振動層析柱外壁，使硅膠沉降均勻，直至硅膠 沉降完全，關閉閥門。 拌樣：將濃縮后的樣品充分溶解于少量的有機溶劑中，與適量的粗硅膠 (H60)攪拌均勻，揮發(fā)干溶劑后，得到柱層析所需樣品。 上樣：打開柱下端的閥門，當柱上端溶液流到與固定相表面一致的位置時將經拌樣得到的樣品在柱面上鋪勻，再加入少量起始洗脫劑，使樣品慢慢潤濕，等樣品完全潤濕后，加入洗脫劑，打開閥門，收集洗脫液。 洗脫與收集：選擇適當?shù)南疵搫?，按極性從小到大的順序，選擇不同的梯度（每個梯度1 2 個柱體積）連續(xù)洗脫，分管收集洗脫液。 1.2.4.3 凝膠柱層析 采用 151000 mm 的羥丙基葡聚 糖（ LH-20）柱 ： 裝柱：先將 SephadexLH-20 在甲醇中充分的溶漲過夜。溶漲好后用干凈的吸管把上清懸浮的顆粒凝膠吸去，然后倒入事先準備好的玻璃柱中，裝柱時上緩 倒 ,下慢放，要一次完成（ in one pour）。裝柱操作中注意不要劇烈攪拌，以防顆粒碎裂；操作要均勻，以免柱中形成緊實的界面；振動有利于提高柱質量。讓其自然沉降至膠平面不在下降為止（ 12-24 h），為加速沉降可同時進行以 1-5 ml/min 的甲醇進行柱子平衡。 上樣：上樣體積控制在 1 5 %。先放掉柱上過多的流動相，等液面剛好接近膠平面時關掉放液閥，用吸管吸取樣品沿柱壁緩慢的加入待分樣品后，打開放液閥，使加入的樣品進入膠內后關閉閥門，再用甲醇洗剩下的樣品，打開放液閥使樣品進 入 膠內后，再吸取流動相甲醇沿柱壁慢慢加入，調整柱流速控制在 2-3 滴 /min，準備收集。 收集：調整好流速后用自動收集儀進行收集，每管控制收集 5 ml。收集到的各個組分用旋轉蒸發(fā)儀 42 左右減壓濃縮，然后用 TLC 或 HPLC 進行分析。同時進行活性測定 。 活性部分將用 HPLC 等方法進一步純化。 1.2.4.4 高效液相色譜 法 7 樣品前處理：所有的樣品都必須澄清透明，并盡可能溶于水 或甲醇中。 流動相：主要是水和甲醇或水和乙腈進行等度洗脫或分段梯度洗脫，具體配比要根據(jù) HPLC 的分析結果來定；洗脫速度：一般為 15-20 ml/min。 色譜柱：使用 Wters 19250 mm, 10 m, ODS2 。 檢測條件：根據(jù)目標成分的紫外光譜特性選擇適當?shù)臋z測波長。常用 254 nm或 210 nm等波長檢測。 主要分離純化工藝流程如下： 2.結果與分析 2.1 活性組分的初步確定 為了選擇最佳萃取試劑， 選取 4 種有機溶劑：石油醚、 氯仿、乙酸乙酯、甲醇進行萃取，將所得有機相和水相分別濃縮至干，稱重，以甲醇為溶劑，分別配制成反應濃度為5.0mg/ml 的供試樣品，按前述方法進行活性測定。結果見表 2。 表 2 不同有機溶劑提取物對清除 DPPH 活性的影響 Table2 Effect of different extracting solvent on DPPH free radical scavenging activity 樣品 反應濃度（ 5mg/ml） DPPH 的相對清除率 （ %） 石油醚相 5 19.6 0.02 石油醚萃取后的水相 5 80.1 0.21 發(fā)酵液的脂溶相（ 乙酸乙酯相） 凝膠層析柱（ SephadexLH-20） /高效液相色譜（ HPLC） TLC-DPPH 自由基清除 活性檢測，合并相同組分 硅膠柱色譜初步分離 純度鑒定 發(fā) 酵 醪 液 活 性 驗 證 8 三氯甲烷相 5 66.3 0.14 三氯甲烷萃取后的水相 5 32.9 0.04 乙酸乙酯相 5 71.6 0.24 乙酸乙酯萃取后的水相 5 27.5 0.036 甲醇相 5 58.1 0.007 甲醇萃取后的水相 5 41.5 0.009 由表 2 中結果可以看出，起始反應濃度同為 5.0 mg/ml 時，在有機萃取相中，乙酸乙酯與三氯甲烷萃取相組分的活性最高，對 DPPH 的相對清除率分別為 71.6 %， 66.3 %；且與水相的抑制率也基本互補。因此，初步 判定發(fā)酵液的脂溶性活性成分主要存在于乙酸乙酯相。 2.2 乙酸乙酯相活性組分的硅膠柱色譜的粗分及活性跟蹤 將 8.5g 浸膏加入適量的甲醇充分溶解后，適量硅膠拌樣，減壓濃縮至干，加到常壓硅膠柱中進行粗分 .具體洗脫梯度如表 3 表 3 流動相梯度表 Table3 Different proportion of ambulatory organic impregnant 上樣后，逐管收集洗脫液，每管收集 100ml。于同一塊硅膠板上，將收集的各管洗脫液分別點樣 50l，揮干溶劑后，然后噴濃度為 1 mg/ml 的 DPPH 自由基 95乙醇溶液進行顯色。30 分鐘數(shù)碼相機拍照記錄。結果如圖 1 所示 從 圖 可看到 P6 發(fā)酵液乙酸乙酯提取物，經 硅膠柱 分離后的流分中 22、 26、 27、 28、32、 33、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45 和 46 號收集物都有較強的 清除 DPPH 自由基活洗脫劑 比例 體積 (mL) 三氯甲烷 / 500 三氯甲烷甲醇 99:1 500 三氯甲烷甲醇 98:2 500 三氯甲烷甲醇 97:3 500 三氯甲烷甲醇 95:5 500 三氯甲烷甲醇 9:1 500 三氯甲烷甲醇 8:2 500 三氯甲烷甲醇 7:3 500 三氯甲烷甲醇 6:4 500 三氯甲烷甲醇 5:5 500 三氯甲烷甲醇 4:6 500 三氯甲烷甲醇 3:7 500 三氯甲烷甲醇 2:8 500 三氯甲烷甲醇 1:9 500 甲醇 / 500 A C 9 性。本研究選擇有活性部分收集物進一步進行 TLC 試驗，合并相同組分。經過進一步 TLC試驗結果發(fā)現(xiàn)收集物，成份相似，且成分相對較少。結果如圖 2 所示 。合并 39至 46 管收集物，減壓濃縮后得樣品 50 ，將樣 品進行進一步的分離制備和活性研究。 圖 1 1-66 的 TLC 分析 Fig 1 TLC Analysis of components1-66 圖 2 39-46 的 TLC 分析 Fig 2 TLC Analysis of components 39-46 2.3 樣品的凝膠柱色譜和活性追蹤 首先將 20mg 樣品 充分溶于甲醇中， 然后 放掉柱上過多的流動相，等液面剛好接近膠平面時關掉放液閥，用吸管吸取樣品沿柱壁緩慢的加入樣品 后， 打開放液閥，使加入的樣品進入膠內后關閉閥門，再用甲醇洗剩下的樣品，打開放液閥使樣品進 入 膠內后，再吸取流動相甲醇沿柱壁慢慢加入，調整柱流速控制在 2-3 滴 /min， 每管收集 10ml。 10 于同一塊硅膠板上，將收集的各管洗脫液分別點樣 20l，揮干溶劑后，然后噴濃度為1 mg/ml的 DPPH 自由基 95乙醇溶液進行顯色。 30 分鐘數(shù)碼相機拍照記錄。結果如圖 3 所示 圖 3 樣品 的 TLC 分析 Fig 3 TLC Analysis of samples 由圖 3 可以看出 44 號樣品黃色斑點最明顯說明其清 除 DPPH 自由基最強。其次， 52、53、 54、 55、 56 和 57 號 也具有相對較強的清除 DPPH 自由基活性。 下面將僅對有活性的 收集 物逐管進行 TLC 試驗，近一步的進行純度鑒定和活性追蹤。 2.4 樣品的純度鑒定 2.4.1 TLC 檢驗 采用 TLC 檢驗，選擇展開劑及配比主要為乙酸乙酯 :甲醇 6:1；氯仿 :甲醇 5:1進行檢驗，結果發(fā)現(xiàn)僅 44 號管收集物為一純品。純度鑒定如圖 7 所示： 1 2 3 圖 4 P6-01 TLC 圖譜 Fig4 The TLC picture of P6-01 11 從上述的兩種展開劑展開的結果，初步判定 44 號收集物為單一化合物，命名為 P6-01。圖 7 中 1 和 2 分別為化合物 P6-01 在展開劑和中展開后碘蒸汽顯色的情況， 10%濃硫酸乙醇 P6-1 顯紫色為圖 7 中 3 2.4.2 高效液相色譜分析 色譜條件：色譜柱為 Wters 19250 mm, 10 m, ODS2 ；洗脫梯度為甲醇從 0 100；洗脫時間為 50 分鐘；進樣量為 20l 。檢測波長為 260nm、 210nm 試樣分別為 (1)P6 培養(yǎng)液提取物 (1Omg ml 甲醇 )； (2)P6-01(2 5mg ml 甲醇 )。結果見圖 6 和圖 7： 圖 6 P6發(fā)酵液提取物的 HPLC圖 Fig 6 HPLC chromatogram of the extract 圖 7 化合物 P6-01的 HPLC圖 Fig 7 HPLC chromotogram of compound P6-01 HPLC 分析結果顯示； (1)P6-01 在不同檢測渡長下都僅有一個單峰，并且光譜特征一致， 12 說明 P6-01在該檢測條件下為一純物質 (2)化合物 P6-01的保留時間與其在原提取物中的保留時間基本一致，說明分離制備過程中該化合物的色譜特性沒變 2.5 樣品的活性驗證 參照 1.2.3 的方法對樣品 P6-01 進行活性驗證， DPPH-TLC 圖譜如圖 8 所示。另外，P6-01在濃度為 0.5 mg/mL于 37下保溫 10min時對 0.4mg/ml DPPH自由基清除率為 78.5%。 圖 8 P6-01 DPPH 試驗 TLC譜圖 Fig 8 DPPH-TLC assay of P6-01 3.討論與結論 細腳擬青霉被認為是高雄山蟲草的無性型，具有多種藥理作用。目前，細腳擬青霉的相關研究已有較多的報道，但還未見其清除 DPPH 自由基活性物質系統(tǒng)研究的詳細報道。本文采用 TLC-DPPH 法對發(fā)酵液中的清除 DPPH 自由基活性物質進行定性分析， 采用 DPPH自由基酶標儀法進行定量檢測，并經過反復硅膠柱和凝膠柱分離、制備后，得一組分 P6-01。經 TLC 法和 HPLC 分析，初步鑒定 P6-01 為一純品，進一步活性驗證，結果表明， P6-01 在反應濃度為 0.5mg/ml時，于 37下保溫 10min時對 0.4mg/mlDPPH自由基清除率為 78.5。這表明本試驗采用的方法對于試驗菌株 P6 的發(fā)酵液中清除 DPPH 自由基活性物質的分離、制備及純度、活性驗證的發(fā)方法是可行的。 參考文獻 1 蒲蟄龍 ,李增智（主編） ,1996. 合肥 : 昆蟲真菌學 . 安徽科學技術 出版社 . 193 2 梁宗琦 , 2001.我國蟲草屬真菌研究開發(fā)的現(xiàn)狀及思考 ,食用菌學報 .8（ 2）： 5362 3 胡豐林 ,陸瑞利 ,2004.薔薇科一些植物鮮葉提取物清除 DPPH自由基活性的研究 .植物學通報 ,21(1):7478 4 蘇銀法 ,徐珊 ,吳真列 , 1996. 細腳擬青霉對 CNS 和免疫器官重量的影響 .中醫(yī)藥研究 ,3:5051 5 金麗琴 ,呂建新 ,胡云良 ,樓永良 ,1997.細腳擬青霉對大鼠脂質過氧化物和還原型谷光甘肽水平的影響 .中國病理生理雜志 ,13(4):379382 6 金麗琴 ,呂建新 ,袁謙 , 2002. 細腳擬青霉總多糖對大鼠非特異性免疫調節(jié)作用 .科技通 13 報 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A novel carbon skeletal trichothecane, tenuipesine A, isolated from an entomopathogenic fungus, Paecilomyces tenuipes. Org Lett, 6(24): 45314533. 致謝 本實驗是在樊美珍教授及陳安徽博士研究生的悉心指導下完成的。從論文的選題，每一步的實驗設計，到實驗的具體操作， 直至論文的最后審閱，都傾注了指導老師的心血。在此衷心感謝樊美珍教授及陳安徽師兄對我的精心指導。同時，在實驗過程中，還得到了實驗室各位老師和師兄師姐的熱心幫助，在此一并向他們表示感謝！另外，向四年來為我提供了良好的學習環(huán)境的生命科學學院的各位領導和