本科論文_細(xì)腳擬青霉發(fā)酵液中清除DPPH自由基活性物質(zhì)的分離和制備

1 目 錄 中文摘要 2 關(guān)鍵詞 2 前言 2 1 材料與方法 3 1.1 材料 3 1.1.1 供試菌株 3 1.1.2 常用培養(yǎng)基 3 1.1.3 顯色劑 3 1.1.4 主要儀器 3 1.2 研究方法 4 1.2.1 供試菌株液體種子的準(zhǔn)備 4 1.2.2 發(fā)酵罐培養(yǎng)與發(fā)酵液的處理 4 1.2.3 清除自由基活性 檢測 模型 4 1.2.4 活性指導(dǎo)下的分離 5 2.結(jié)果與分析 7 2.1 活性組分的初步確定 7 2.2 乙酸乙酯相活性組分的硅膠柱色譜的粗分及活性跟蹤 8 2.3 樣品的凝膠柱色譜和活性追蹤 9 2.4 樣品的純度鑒定 : 10 2.4.1 TLC 檢驗(yàn) 10 2.4.2 高效液相色譜分析 11 2.5 樣品的活性驗(yàn)證 12 3.討論 12 參考文獻(xiàn) 12 致謝 13 英文摘要 14 2 細(xì)腳擬青霉發(fā)酵液中清除 DPPH 自由基活性物質(zhì)的 分離和制備 作者：王偉 指導(dǎo)老師：樊美珍 （安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 2003 級生物科學(xué)二班，安徽合肥， 230036） 摘要 :本文對一株細(xì)腳擬青霉菌株 P6發(fā)酵液中清除 DPPH自由基活性物質(zhì)進(jìn)行了研究 ,將發(fā)酵液選擇 45減壓濃縮到一定體積，采用 70乙醇醇沉去除大分子適當(dāng)濃縮后用不同有機(jī)溶劑萃取處理，采用 TLC- DPPH（ 二苯基苦基苯肼） 薄層層析法和 DPPH 自由基酶標(biāo)儀法對發(fā)酵液及其提取物中 清除 DPPH 自由基活性物質(zhì)進(jìn)行定性和定量檢測。結(jié)果表明，在起始反應(yīng)濃度為 5.0 mg/ml 時的有機(jī)萃取相中，乙酸乙酯與三氯甲烷萃取相組分的活性最高，對 DPPH 的相對清除率分別為 71.6 %， 66.3 %；且與水相的抑制率也基本互補(bǔ)。因此，初步判定發(fā)酵液的脂溶性活性成分主要存在于乙酸乙酯相。對乙酸乙酯相中的活性成分進(jìn)行分離、制備后，得 一較純組分 P6-01，經(jīng)活性測定，在反應(yīng)濃度為 0.5mg/ml 時，于 37下保溫 10min時對 0.4mg/mlDPPH 自由基清除率為 78.5。 關(guān)鍵詞： 蟲草 無性型 次生代謝產(chǎn)物 前言 細(xì)腳擬青霉（ Paecilomyces tenuipes (Peck) Samson） 是一種世界性分布的蟲生真菌，在國內(nèi)常見寄生于南方森林中鱗翅膜昆蟲的蛹和幼蟲，被認(rèn)為是蟲草的無性階段 1。由于蟲生菌與昆蟲的長期協(xié)同進(jìn)化關(guān)系，近年來蟲生菌被認(rèn)為是最有可能從中發(fā)現(xiàn)新型生物活性物質(zhì)的類群，有關(guān)研究受到世界各國的廣泛 關(guān)注 2。目前對細(xì)腳擬青霉的研究主要有如下幾方面：一、單純的生物活性研究，如蘇銀法等（ 1996） 曾對該菌株的孢梗束水提物進(jìn)行了對小鼠中樞神經(jīng)和免疫器官的影響試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)細(xì)腳擬青霉具有明顯的鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用 4；金麗琴等（ 1997,2002） 曾對細(xì)腳擬青霉菌絲體水煎品對大鼠脂質(zhì)過氧化物和還原型谷光甘肽水平影響進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明能減少脂質(zhì)過氧化物的生成，維持還原型谷光甘肽的含量；同時發(fā)現(xiàn)細(xì)腳擬青霉總多糖對大鼠非特異性免疫調(diào)節(jié)作用 5-6。此外，還有其水提物治療糖尿病的報(bào)道以及抗菌、抗瘧、殺蟲和細(xì)胞毒的報(bào)道 (Nam et al, 2001； Kikuchi et al， 2004) 。二、單純的成分研究，如陳祝安和徐珊（ 1989）和陳召南（ 1992）等曾分別對細(xì)腳擬青霉的固體培養(yǎng)物與天然冬 蟲夏草的氨基酸、甾醇類、糖醇和生物堿等成分進(jìn)行過比較分析； Kikuchi 等（ 2004）報(bào)道了一種單端孢烷和烯類骨架的新化合物 Tenuipesine A 和 Spirotenuipesine A 和B 。三、活性成分的 鑒定。泰國學(xué)者 Nilanonta 等 （ 2002） 曾通過特殊培養(yǎng)方式從中發(fā)現(xiàn)了具抗菌、殺蟲活性的 Beauveric in A 和 B、 Allobeauvericin A、 B 和 C11；另外， Nam 等 （ 2001）還報(bào)道了兩種細(xì)胞毒成分： Acetoxyscripenediol 和 一種麥角甾醇過氧化物 12。 雖然對細(xì)腳擬青霉的相關(guān)研究已有較多的報(bào)道，但還未見其清除二苯代苦味肼基自由基（ 1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl, DPPH）活性系統(tǒng)研究的詳細(xì)報(bào)道?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，人體內(nèi)很多疾病都與機(jī)體內(nèi)的自由基有著密切的關(guān)系，對自由基方面的研究已經(jīng)成為醫(yī)藥學(xué)界研 3 究熱點(diǎn) 13。 本實(shí)驗(yàn)室在一次大規(guī)模的生物活性物質(zhì)篩選中發(fā)現(xiàn)一株細(xì)腳擬青霉 P6 的發(fā)酵物具有較強(qiáng)的清除自由基活性。為了進(jìn)一步確定該菌株株發(fā)酵液提取物的清除自由基活性，本研究將分別對搖瓶發(fā)酵液和其提取物進(jìn)行清除 DPPH 自由基研究，為進(jìn)一步 的結(jié)構(gòu)研究和相關(guān)藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。 1 材料 與方法 1.1 材料 1.1.1 供試菌株 實(shí)驗(yàn)所用菌株均由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物防治省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。 1.1.2 常用培養(yǎng)基 固體斜面培養(yǎng)基 (SDAY)：蛋白胨 10 g/L、酵母浸出粉 10 g/L、葡萄糖 40 g/L、瓊脂 20 g/L，以蒸餾水定容。 固體斜面培養(yǎng)基 (PDA)：馬鈴薯 200 g/L （去皮，切成小塊煮沸 20min，紗布過慮），葡萄糖 20 g/L，瓊脂 20 g/L，以蒸餾水定容。 液體搖瓶培養(yǎng)基（ SDY）：蛋白胨 10 g/L、酵母浸出粉 10 g/L、葡萄糖 40 g/L、 pH 6.7，以蒸餾水定容。 固體平皿培養(yǎng)基 (SDAY)：蛋白胨 10 g/L、酵母浸膏 10 g/L、葡萄糖 40 g/L、瓊脂 20 g/L，以蒸餾水定容。 深層液體發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨 1.0 %、酵母粉 1.0 %、白砂糖 4.0 %?；螯S豆粉3%、酵母粉 1.0 %、白砂糖 2.0 %。 1.1.3 顯色劑 碘試劑：在密閉的玻璃缸內(nèi)將少許碘結(jié)晶或?qū)⑸僭S碘結(jié)晶與適量的 75 150 m 硅膠攪拌均勻，顯色時，將點(diǎn)過樣品薄層板放入碘缸內(nèi)即可。 15 %硫酸乙醇溶液：取濃硫酸 120ml 沿瓶壁緩慢的加入到盛有無水乙醇（分析純） 780 ml的廣口瓶中，同時不斷地?cái)嚢?，蓋上瓶蓋備用。顯色時，將點(diǎn)過樣品的薄層板用鑷子直接浸入其中，取出淋干后放置電爐上小火慢慢烘烤或放在電熱板上烘烤到呈現(xiàn)明顯的斑點(diǎn)即可。 1.1.4 主要儀器 本研究使用的具體儀器及型號見下表。 表 1 主要儀器 及其型號 Table 1 Main equipments and their types 儀器名稱 Name 規(guī)格型號 Type 生產(chǎn)廠家 Manufactory HPLC SP930D, Uv730D 韓國 Younglin 公司 全波長掃描酶標(biāo)儀 Spectra Max M2 美國 Molecular device 公司 系列色譜柱 玻璃柱 中國科技大學(xué)玻璃儀器廠 自動收集儀 BSZ-100 上海滬西分析儀器廠 4 高效薄層硅膠板 GF254 分析型（鋁基和玻璃基） 德國 Merck 公司和青島海洋化工廠 高效薄層硅膠板 GF254 制備型（玻璃基） 安徽岳西硅源材料廠 光照培養(yǎng)箱 LRH-250-G 廣東省醫(yī)療器械廠 手提式壓力蒸汽滅菌器 YXQ.SG4.280 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司 全溫振蕩培養(yǎng)箱 HZQ-F 160 哈爾濱東聯(lián)電子公司 30L 發(fā)酵罐 GY-70C 江蘇理工大學(xué) 電熱蒸汽發(fā)生器 DZFZ 上海佳田制造有限公司 電熱恒溫培養(yǎng)箱 HH-B11-560 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械公司 數(shù)碼顯微鏡 VHX-100 日本 Keyence 公司 高速分散器 PT3100 瑞士 POLYTRON 酸度計(jì) 818 美國 ORION 公司 三用紫外分析儀 WFH-203B 上海精科實(shí)業(yè)有限公司 真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 SENCO R-502B 上海申勝生物技術(shù)有限公司 超凈工作臺 AIR TECH 蘇凈集團(tuán)安泰公司 數(shù)控超聲波清 洗器 KH5200 昆山禾創(chuàng)超聲儀器公司 冷凍干燥系統(tǒng) 040520111G 美國 LABCONCO 公司 超速離心機(jī) 2K15 美國 Sigma 公司 管式離心機(jī) GQ105 上海市離心機(jī)械研究所 高速冷凍離心機(jī) TL 15 江蘇圖門離心機(jī)廠 梅特勒電子天平 AE200 型 上海分析儀器廠 循環(huán)水式真空泵 SHZ-D 河南鞏義英豫華儀器廠 超低溫冰箱 MDF-382E 日本三洋公司 1.2 研究方法 1.2.1 供試菌株液體種子的準(zhǔn)備 將供試菌株 P6 的固體種子分別接種至液體搖瓶培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)時裝液 量為 200 ml500 ml，接種量控制在 5，接種后置于全溫振蕩培養(yǎng)箱，溫度 25、轉(zhuǎn)速 180 rpm，培養(yǎng)7d 備用。 1.2.2 發(fā)酵罐培養(yǎng)與發(fā)酵液的處理 采用 30L 發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，初始裝液量 20L，接種量 10 %，通氣量 1:1（ v/v），以棗莊市嶧城廠生產(chǎn)的食用消泡劑進(jìn)行消泡， 25恒溫通氣培養(yǎng) 10d 出罐。采用管式離心機(jī)進(jìn)行發(fā)酵液和菌絲體分離；將獲得的發(fā)酵液用低溫真空濃縮法進(jìn)行濃縮處理，濃縮至原體積的1/10，后加入濃度為 95%乙醇使發(fā)酵液中的乙醇濃度含量達(dá)到 70%。過夜，再用布氏漏斗真空抽濾法去除 生物大分子（多糖和蛋白）。取出上清液進(jìn)行濃縮，冷凍干燥，凍干粉備用；菌絲體采用 50 熱干燥法烘干保存?zhèn)溆谩?1.2.3 清除自由基活性 檢測 模型 1.2.3.1 供試樣品的準(zhǔn)備 電子天平準(zhǔn)確的稱取上述供試菌株發(fā)酵液凍干粉 1g，用乙酸乙酯 10ml，于 100Hz 超聲波中提取 30 min。離心吸取上清液并吹干稱重，溶于甲醇溶液，配成 濃度為 10.0 mg/mL 作為初試樣品 5 1.2.3.2 清除自由基活性物質(zhì)定性檢測 取濃度為 10 mg/mL 上述提取物的甲醇溶液進(jìn)行 DPPH 自由基薄層試驗(yàn)，以 1.0 mg/mL的抗壞血酸 甲醇溶液為陽性對照。點(diǎn)樣量為 4 L， 展開劑為氯仿 :甲醇 = 80:20。等流動相到達(dá)距上沿 1cm 的地方，取出讓展開劑自然揮去，然后噴濃度為 1 mg/mL 的 DPPH 自由基 95乙醇溶液進(jìn)行顯色，并用鉛筆輕輕的劃下活性點(diǎn)。 1.2.3.3 清除自由基活性物質(zhì)的定量測定 參考胡豐林和陸瑞利（ 2004）的 DPPH 自由基酶標(biāo)儀法。加各濃度樣品 100 L 和事先用95乙醇配好的 0.4 mg/mL 的 DPPH 自由基試劑 100 L于 96 孔酶標(biāo)板中，每個樣品設(shè)三個重復(fù)。樣品加入后將 96 孔酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀中振動 30 s，在 37和 517 nm 波長下測定其吸光值（ Ap）； 37保溫 10min 后再測定一次。同時測定不加 DPPH 自由基試劑的樣品空白吸光值 (Ac)和加 DPPH 自由基試劑但不加樣品（ 100 L 80甲醇代替樣品）的吸光值（ Amax）。最后按下述公式計(jì)算： 相對清除率（） =1-（ Ap-Ac） /Amax 100 1.2.4 活性指導(dǎo)下的分離 活性提取物的確定 ： 將篩選出的活性菌株 發(fā)酵液凍干品分別用石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水等試劑浸提。提取物經(jīng)低溫真空濃縮凍干后，用適當(dāng)?shù)娜軇┡涑梢欢舛?的溶液，用DPPH 活性測定模型進(jìn) 行活性測定，找出活性提取物以進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。 1.2.4.1 薄層層析（ TLC） 薄層層析（ thin-layer chromatography，簡稱 TLC）是在吸附層析的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，目前已廣泛應(yīng)用于定性和定量分析、分離、純化、制備目的，它的作用機(jī)理主要包括吸附、分配、離子交換等作用。 按照相似相溶規(guī)律，極性組分易溶于極性溶劑，非極性組分則易溶于非極性溶劑中，因此在同一薄板上，不同極性化合物的組分在同一溶劑中的溶解度不同，溶解度愈大，移動速度愈快；反之則相反。展層的過程即樣品各組分得到分離的過程，它 也是一個吸附，解析，再吸附，再解析的連續(xù)過程。 薄層層析的定性分析與紙層析類似，對組分簡單樣品的定性，可根據(jù)在同一薄層板上，樣品組分的 Rf值和標(biāo)準(zhǔn)樣品的 Rf值對照；對于復(fù)雜樣品的定性，需數(shù)種方法才能確定；薄層層析后，樣品組分的定量分析有洗脫測定法和原位法。 試驗(yàn)方法：用毛細(xì)管吸取樣品點(diǎn)到已活化的 GF254高效薄層層析硅膠板上，點(diǎn)的直徑在 2 3 mm，距薄層一端距離為 1cm 左右，各樣品點(diǎn)之間的距離一般也控制在 1cm 左右。將硅膠板放入已飽和的層析槽中展開，當(dāng)展開溶劑上行到距硅膠板另一端 1cm 處時，取出硅膠板，待溶劑揮發(fā)干后于紫外燈下觀察結(jié)果并用鉛筆在有樣品的地方圈出，同時碘染顯色和 10%濃硫酸中顯色，主要用于對過層析柱后的樣品的合并以及對分離得到的單體進(jìn)行鑒定。 6 1.2.4.2 硅膠柱層析 (采用濕法裝柱干法上樣法 ) 洗脫劑極性的選擇及起始裝柱溶劑的選擇：采用薄層色譜法對洗脫劑極性和起始裝柱溶劑進(jìn)行選擇。洗脫劑一般多用混合溶劑，但起始溶劑的選擇原則就以開始的純?nèi)軇檎归_劑對樣品展開，點(diǎn)或利用 TLC 色譜選擇樣品保留在點(diǎn)樣剛剛出頭的溶劑為裝柱的溶劑，然后通過比例的調(diào)節(jié)，按照由極性小逐漸過渡到極性大的洗脫劑為原則（正向?qū)?析），從而達(dá)到分離物質(zhì)的目的。由于薄層色譜的固定相是干燥的，干燥硅膠的吸附活性是一般濕法裝柱的硅膠吸附活性的 2 倍。因此，洗脫劑的極性選擇原則采用最大極性展開劑使樣品在薄層板上的Rf值在 1/2 以下為宜。 裝柱：首先將適量洗脫劑倒入柱內(nèi)，排走其中的空氣，然后把預(yù)先用洗脫劑浸泡好的硅膠（硅膠的用量約為樣品量的 30 50 倍）攪勻，隨即將此懸浮液連續(xù)傾入柱（硅膠柱色譜規(guī)格 4.040cm ）中，待其自然沉降至柱高的 1/4 1/3 時打開柱下端的閥門，讓溶劑緩慢流出，硅膠沉降時，輕輕振動層析柱外壁，使硅膠沉降均勻，直至硅膠 沉降完全，關(guān)閉閥門。 拌樣：將濃縮后的樣品充分溶解于少量的有機(jī)溶劑中，與適量的粗硅膠 (H60)攪拌均勻，揮發(fā)干溶劑后，得到柱層析所需樣品。 上樣：打開柱下端的閥門，當(dāng)柱上端溶液流到與固定相表面一致的位置時將經(jīng)拌樣得到的樣品在柱面上鋪勻，再加入少量起始洗脫劑，使樣品慢慢潤濕，等樣品完全潤濕后，加入洗脫劑，打開閥門，收集洗脫液。 洗脫與收集：選擇適當(dāng)?shù)南疵搫?，按極性從小到大的順序，選擇不同的梯度（每個梯度1 2 個柱體積）連續(xù)洗脫，分管收集洗脫液。 1.2.4.3 凝膠柱層析 采用 151000 mm 的羥丙基葡聚 糖（ LH-20）柱 ： 裝柱：先將 SephadexLH-20 在甲醇中充分的溶漲過夜。溶漲好后用干凈的吸管把上清懸浮的顆粒凝膠吸去，然后倒入事先準(zhǔn)備好的玻璃柱中，裝柱時上緩 倒 ,下慢放，要一次完成（ in one pour）。裝柱操作中注意不要劇烈攪拌，以防顆粒碎裂；操作要均勻，以免柱中形成緊實(shí)的界面；振動有利于提高柱質(zhì)量。讓其自然沉降至膠平面不在下降為止（ 12-24 h），為加速沉降可同時進(jìn)行以 1-5 ml/min 的甲醇進(jìn)行柱子平衡。 上樣：上樣體積控制在 1 5 %。先放掉柱上過多的流動相，等液面剛好接近膠平面時關(guān)掉放液閥，用吸管吸取樣品沿柱壁緩慢的加入待分樣品后，打開放液閥，使加入的樣品進(jìn)入膠內(nèi)后關(guān)閉閥門，再用甲醇洗剩下的樣品，打開放液閥使樣品進(jìn) 入 膠內(nèi)后，再吸取流動相甲醇沿柱壁慢慢加入，調(diào)整柱流速控制在 2-3 滴 /min，準(zhǔn)備收集。 收集：調(diào)整好流速后用自動收集儀進(jìn)行收集，每管控制收集 5 ml。收集到的各個組分用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 42 左右減壓濃縮，然后用 TLC 或 HPLC 進(jìn)行分析。同時進(jìn)行活性測定 。 活性部分將用 HPLC 等方法進(jìn)一步純化。 1.2.4.4 高效液相色譜 法 7 樣品前處理：所有的樣品都必須澄清透明，并盡可能溶于水 或甲醇中。 流動相：主要是水和甲醇或水和乙腈進(jìn)行等度洗脫或分段梯度洗脫，具體配比要根據(jù) HPLC 的分析結(jié)果來定；洗脫速度：一般為 15-20 ml/min。 色譜柱：使用 Wters 19250 mm, 10 m, ODS2 。 檢測條件：根據(jù)目標(biāo)成分的紫外光譜特性選擇適當(dāng)?shù)臋z測波長。常用 254 nm或 210 nm等波長檢測。 主要分離純化工藝流程如下： 2.結(jié)果與分析 2.1 活性組分的初步確定 為了選擇最佳萃取試劑， 選取 4 種有機(jī)溶劑：石油醚、 氯仿、乙酸乙酯、甲醇進(jìn)行萃取，將所得有機(jī)相和水相分別濃縮至干，稱重，以甲醇為溶劑，分別配制成反應(yīng)濃度為5.0mg/ml 的供試樣品，按前述方法進(jìn)行活性測定。結(jié)果見表 2。 表 2 不同有機(jī)溶劑提取物對清除 DPPH 活性的影響 Table2 Effect of different extracting solvent on DPPH free radical scavenging activity 樣品 反應(yīng)濃度（ 5mg/ml） DPPH 的相對清除率 （ %） 石油醚相 5 19.6 0.02 石油醚萃取后的水相 5 80.1 0.21 發(fā)酵液的脂溶相（ 乙酸乙酯相） 凝膠層析柱（ SephadexLH-20） /高效液相色譜（ HPLC） TLC-DPPH 自由基清除 活性檢測，合并相同組分 硅膠柱色譜初步分離 純度鑒定 發(fā) 酵 醪 液 活 性 驗(yàn) 證 8 三氯甲烷相 5 66.3 0.14 三氯甲烷萃取后的水相 5 32.9 0.04 乙酸乙酯相 5 71.6 0.24 乙酸乙酯萃取后的水相 5 27.5 0.036 甲醇相 5 58.1 0.007 甲醇萃取后的水相 5 41.5 0.009 由表 2 中結(jié)果可以看出，起始反應(yīng)濃度同為 5.0 mg/ml 時，在有機(jī)萃取相中，乙酸乙酯與三氯甲烷萃取相組分的活性最高，對 DPPH 的相對清除率分別為 71.6 %， 66.3 %；且與水相的抑制率也基本互補(bǔ)。因此，初步 判定發(fā)酵液的脂溶性活性成分主要存在于乙酸乙酯相。 2.2 乙酸乙酯相活性組分的硅膠柱色譜的粗分及活性跟蹤 將 8.5g 浸膏加入適量的甲醇充分溶解后，適量硅膠拌樣，減壓濃縮至干，加到常壓硅膠柱中進(jìn)行粗分 .具體洗脫梯度如表 3 表 3 流動相梯度表 Table3 Different proportion of ambulatory organic impregnant 上樣后，逐管收集洗脫液，每管收集 100ml。于同一塊硅膠板上，將收集的各管洗脫液分別點(diǎn)樣 50l，揮干溶劑后，然后噴濃度為 1 mg/ml 的 DPPH 自由基 95乙醇溶液進(jìn)行顯色。30 分鐘數(shù)碼相機(jī)拍照記錄。結(jié)果如圖 1 所示 從 圖 可看到 P6 發(fā)酵液乙酸乙酯提取物，經(jīng) 硅膠柱 分離后的流分中 22、 26、 27、 28、32、 33、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45 和 46 號收集物都有較強(qiáng)的 清除 DPPH 自由基活洗脫劑 比例 體積 (mL) 三氯甲烷 / 500 三氯甲烷甲醇 99:1 500 三氯甲烷甲醇 98:2 500 三氯甲烷甲醇 97:3 500 三氯甲烷甲醇 95:5 500 三氯甲烷甲醇 9:1 500 三氯甲烷甲醇 8:2 500 三氯甲烷甲醇 7:3 500 三氯甲烷甲醇 6:4 500 三氯甲烷甲醇 5:5 500 三氯甲烷甲醇 4:6 500 三氯甲烷甲醇 3:7 500 三氯甲烷甲醇 2:8 500 三氯甲烷甲醇 1:9 500 甲醇 / 500 A C 9 性。本研究選擇有活性部分收集物進(jìn)一步進(jìn)行 TLC 試驗(yàn)，合并相同組分。經(jīng)過進(jìn)一步 TLC試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)收集物，成份相似，且成分相對較少。結(jié)果如圖 2 所示 。合并 39至 46 管收集物，減壓濃縮后得樣品 50 ，將樣 品進(jìn)行進(jìn)一步的分離制備和活性研究。 圖 1 1-66 的 TLC 分析 Fig 1 TLC Analysis of components1-66 圖 2 39-46 的 TLC 分析 Fig 2 TLC Analysis of components 39-46 2.3 樣品的凝膠柱色譜和活性追蹤 首先將 20mg 樣品 充分溶于甲醇中， 然后 放掉柱上過多的流動相，等液面剛好接近膠平面時關(guān)掉放液閥，用吸管吸取樣品沿柱壁緩慢的加入樣品 后， 打開放液閥，使加入的樣品進(jìn)入膠內(nèi)后關(guān)閉閥門，再用甲醇洗剩下的樣品，打開放液閥使樣品進(jìn) 入 膠內(nèi)后，再吸取流動相甲醇沿柱壁慢慢加入，調(diào)整柱流速控制在 2-3 滴 /min， 每管收集 10ml。 10 于同一塊硅膠板上，將收集的各管洗脫液分別點(diǎn)樣 20l，揮干溶劑后，然后噴濃度為1 mg/ml的 DPPH 自由基 95乙醇溶液進(jìn)行顯色。 30 分鐘數(shù)碼相機(jī)拍照記錄。結(jié)果如圖 3 所示 圖 3 樣品 的 TLC 分析 Fig 3 TLC Analysis of samples 由圖 3 可以看出 44 號樣品黃色斑點(diǎn)最明顯說明其清 除 DPPH 自由基最強(qiáng)。其次， 52、53、 54、 55、 56 和 57 號 也具有相對較強(qiáng)的清除 DPPH 自由基活性。 下面將僅對有活性的 收集 物逐管進(jìn)行 TLC 試驗(yàn)，近一步的進(jìn)行純度鑒定和活性追蹤。 2.4 樣品的純度鑒定 2.4.1 TLC 檢驗(yàn) 采用 TLC 檢驗(yàn)，選擇展開劑及配比主要為乙酸乙酯 :甲醇 6:1；氯仿 :甲醇 5:1進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅 44 號管收集物為一純品。純度鑒定如圖 7 所示： 1 2 3 圖 4 P6-01 TLC 圖譜 Fig4 The TLC picture of P6-01 11 從上述的兩種展開劑展開的結(jié)果，初步判定 44 號收集物為單一化合物，命名為 P6-01。圖 7 中 1 和 2 分別為化合物 P6-01 在展開劑和中展開后碘蒸汽顯色的情況， 10%濃硫酸乙醇 P6-1 顯紫色為圖 7 中 3 2.4.2 高效液相色譜分析 色譜條件：色譜柱為 Wters 19250 mm, 10 m, ODS2 ；洗脫梯度為甲醇從 0 100；洗脫時間為 50 分鐘；進(jìn)樣量為 20l 。檢測波長為 260nm、 210nm 試樣分別為 (1)P6 培養(yǎng)液提取物 (1Omg ml 甲醇 )； (2)P6-01(2 5mg ml 甲醇 )。結(jié)果見圖 6 和圖 7： 圖 6 P6發(fā)酵液提取物的 HPLC圖 Fig 6 HPLC chromatogram of the extract 圖 7 化合物 P6-01的 HPLC圖 Fig 7 HPLC chromotogram of compound P6-01 HPLC 分析結(jié)果顯示； (1)P6-01 在不同檢測渡長下都僅有一個單峰，并且光譜特征一致， 12 說明 P6-01在該檢測條件下為一純物質(zhì) (2)化合物 P6-01的保留時間與其在原提取物中的保留時間基本一致，說明分離制備過程中該化合物的色譜特性沒變 2.5 樣品的活性驗(yàn)證 參照 1.2.3 的方法對樣品 P6-01 進(jìn)行活性驗(yàn)證， DPPH-TLC 圖譜如圖 8 所示。另外，P6-01在濃度為 0.5 mg/mL于 37下保溫 10min時對 0.4mg/ml DPPH自由基清除率為 78.5%。 圖 8 P6-01 DPPH 試驗(yàn) TLC譜圖 Fig 8 DPPH-TLC assay of P6-01 3.討論與結(jié)論 細(xì)腳擬青霉被認(rèn)為是高雄山蟲草的無性型，具有多種藥理作用。目前，細(xì)腳擬青霉的相關(guān)研究已有較多的報(bào)道，但還未見其清除 DPPH 自由基活性物質(zhì)系統(tǒng)研究的詳細(xì)報(bào)道。本文采用 TLC-DPPH 法對發(fā)酵液中的清除 DPPH 自由基活性物質(zhì)進(jìn)行定性分析， 采用 DPPH自由基酶標(biāo)儀法進(jìn)行定量檢測，并經(jīng)過反復(fù)硅膠柱和凝膠柱分離、制備后，得一組分 P6-01。經(jīng) TLC 法和 HPLC 分析，初步鑒定 P6-01 為一純品，進(jìn)一步活性驗(yàn)證，結(jié)果表明， P6-01 在反應(yīng)濃度為 0.5mg/ml時，于 37下保溫 10min時對 0.4mg/mlDPPH自由基清除率為 78.5。這表明本試驗(yàn)采用的方法對于試驗(yàn)菌株 P6 的發(fā)酵液中清除 DPPH 自由基活性物質(zhì)的分離、制備及純度、活性驗(yàn)證的發(fā)方法是可行的。 參考文獻(xiàn) 1 蒲蟄龍 ,李增智（主編） ,1996. 合肥 : 昆蟲真菌學(xué) . 安徽科學(xué)技術(shù) 出版社 . 193 2 梁宗琦 , 2001.我國蟲草屬真菌研究開發(fā)的現(xiàn)狀及思考 ,食用菌學(xué)報(bào) .8（ 2）： 5362 3 胡豐林 ,陸瑞利 ,2004.薔薇科一些植物鮮葉提取物清除 DPPH自由基活性的研究 .植物學(xué)通報(bào) ,21(1):7478 4 蘇銀法 ,徐珊 ,吳真列 , 1996. 細(xì)腳擬青霉對 CNS 和免疫器官重量的影響 .中醫(yī)藥研究 ,3:5051 5 金麗琴 ,呂建新 ,胡云良 ,樓永良 ,1997.細(xì)腳擬青霉對大鼠脂質(zhì)過氧化物和還原型谷光甘肽水平的影響 .中國病理生理雜志 ,13(4):379382 6 金麗琴 ,呂建新 ,袁謙 , 2002. 細(xì)腳擬青霉總多糖對大鼠非特異性免疫調(diào)節(jié)作用 .科技通 13 報(bào) ,18(4):276280 7 Kikuchi H, Miyagawa Y, Sahashi Y, Inatomi S, Haganuma A, Nakahata N, Oshima Y, 2004. 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A novel carbon skeletal trichothecane, tenuipesine A, isolated from an entomopathogenic fungus, Paecilomyces tenuipes. Org Lett, 6(24): 45314533. 致謝 本實(shí)驗(yàn)是在樊美珍教授及陳安徽博士研究生的悉心指導(dǎo)下完成的。從論文的選題，每一步的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，到實(shí)驗(yàn)的具體操作， 直至論文的最后審閱，都傾注了指導(dǎo)老師的心血。在此衷心感謝樊美珍教授及陳安徽師兄對我的精心指導(dǎo)。同時，在實(shí)驗(yàn)過程中，還得到了實(shí)驗(yàn)室各位老師和師兄師姐的熱心幫助，在此一并向他們表示感謝！另外，向四年來為我提供了良好的學(xué)習(xí)環(huán)境的生命科學(xué)學(xué)院的各位領(lǐng)導(dǎo)和