組培常見問題.doc

植物組培過程中污染產(chǎn)生的原因及防治措施一、 污染的原因 污染是指在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基或培養(yǎng)材料上滋生真菌、細菌等微生物，使培養(yǎng)材料不能正常生長和發(fā)育的現(xiàn)象。組織培養(yǎng)中污染是經(jīng)常發(fā)生的，常見的污染病原是細菌和真菌兩大類。細菌污染常在接種1-2d后表現(xiàn)，培養(yǎng)基表面出現(xiàn)黏液狀菌斑。真菌污染一般在接種后3d以后才表現(xiàn)，主要癥狀時培養(yǎng)基上出現(xiàn)絨毛狀菌絲，然后形成不同顏色的孢子層。 造成污染的原因也很多，主要有 (1) 培養(yǎng)基及各種使用器具滅菌不徹底 (2) 外植體消毒不徹底 (3) 接種時不嚴格無菌操作 (4) 接種和培養(yǎng)環(huán)境不清潔 (5) 培養(yǎng)容器原因，包括蓋子和封口膜等。二、 材料帶菌或培養(yǎng)基滅菌不徹底會造成成批接種材料被細菌污染，操作人員不嚴格遵守無菌操作規(guī)程也是造成細菌污染的重要原因。培養(yǎng)環(huán)境不清潔、超凈工作臺的過濾裝置失效、培養(yǎng)容器的口徑過大以及封口膜破損等主要引起真菌污染。2 污染的預防措施 2.1滅菌要徹底 在組培生產(chǎn)中，各種培養(yǎng)基以及接種過程中使用的各種器具都要嚴格滅菌。首先是培養(yǎng)基的滅菌，耐高溫的培養(yǎng)基需要在121-123條件下滅菌20-30min。若出現(xiàn)滅菌時間不足或溫度不夠，培養(yǎng)一段時間后就會在培養(yǎng)基表面產(chǎn)生細菌性的污染。一些不耐高溫的物質，可采取細菌過濾器除去其中的微生物。其次，接種用的器具除了經(jīng)過高溫霉菌外，在接種的過程中，每使用1次后，都要蘸酒精在酒精燈火焰上灼燒滅菌，特別是在不慎接觸到污染物時，極易由于器具引起污染。第三，對于被污染的培養(yǎng)瓶和器皿要單獨浸泡，單獨清洗，有條件的滅菌后再清洗。 2.2環(huán)境消毒 不清潔的環(huán)境也會使培養(yǎng)的污染率明顯增加，尤其是在夏季，高溫高濕條件下污染率更高。接種和培養(yǎng)環(huán)境要保持清潔，定期進行熏蒸或噴霧消毒。高錳酸鉀和甲醛熏蒸效果好，但對人體有一定的傷害，一般每年熏蒸2-3次。平時讀接種室和培養(yǎng)室可采用紫外線照射消毒或噴2%來蘇爾消毒。臭氧消毒機對環(huán)境消毒效果較好，而且使用靈活方便，對人體的傷害也相對較小。 2.3嚴格無菌操作 在接種時要嚴格無菌操作，避免人為因素造成污染。為了使超凈工作臺有效工作，防止操作區(qū)域本身帶菌，要定期讀一過濾器進行清洗和更換。對內部的過濾器，不必經(jīng)常更換，但每隔一定時間要檢測操作區(qū)的帶菌量，如果發(fā)現(xiàn)過濾器失敗，則要整塊更換。此外還需要測定操作區(qū)的風速，通過調壓旋鈕使操作區(qū)的風速達到無菌操作需要的20-30m/min。植物組培過程中培養(yǎng)物的玻璃化及其防治方法 當植物材料不斷地進行離體繁殖時，有些培養(yǎng)物的嫩莖、葉片往往會呈半透明水漬狀，苗體趨于透明，其莖、葉表面無蠟質，這種現(xiàn)象通常稱為玻璃化。玻璃化為組培苗的生理失調癥，它的出現(xiàn)會使組培苗生長 緩慢、繁殖系數(shù)有所下降，玻璃化的嫩莖不宜誘導生根。 1 導致玻璃化的主要因素： 材料差異，在不同的種類、品種間，組培苗的玻璃化程度有所差異。 激素水平過高,若細胞分裂素濃度過高或細胞分裂素與生長素相對含量高，易引起玻璃化現(xiàn)象。 培養(yǎng)基水勢，培養(yǎng)基中離子種類,比例不適。 環(huán)境溫度、光照強度和通氣性。溫度過低或過高,光照時間強度不足及培養(yǎng)容器中空氣濕度過高，透氣性較差所造成的通氣不良,易造成組培苗含水量高,從而發(fā)生玻璃化現(xiàn)象。 瓊脂濃度降低、有雜質等。 2 常用的防治措施有 增加光照強度和光照時數(shù)。 降低細胞分裂素含量。在培養(yǎng)基中添加少量聚乙烯醇、脫落 酸等物質，能夠在一定程度上減輕玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生 增大培養(yǎng)基中瓊脂的含量，以降低培養(yǎng)基的水勢 降低NH4+濃度，減少培養(yǎng)基中含氮化合物的用量 增加容器通風，最好進行 CO2施肥，這對減輕組培苗玻璃化的現(xiàn)象有明顯的作用； 降低培養(yǎng)溫度，進行變溫培養(yǎng)，有助于減輕組培苗玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生；組培苗瘦弱或徒長的防治措施正常的組培苗應當葉色濃綠、植株粗壯。如果在增殖階段出現(xiàn)芽苗瘦弱、徒長或節(jié)間過長，這種苗轉入生根培養(yǎng)時能夠生根，在環(huán)境條件較好的情況下，也會稍轉粗壯，但總體看來，苗的株型、葉色、葉片大小等性狀還是差于生長正常的增殖苗；有時即便是正?；蚪训脑鲋趁?，若生根階段培養(yǎng)基不適宜或培養(yǎng)的環(huán)境條件得不到保障，往往根原基及根還未形成，就很快表現(xiàn)出小苗徒長，節(jié)間明顯伸長，葉片變細、變薄、變嫩并出現(xiàn)黃化。這樣的苗進行過渡培養(yǎng)時，會出現(xiàn)萎蔫和爛根，很容易死亡，過渡成活率極低。 對組培苗瘦弱的原因分析如下。 (1)細胞分裂素濃度過高，產(chǎn)生了過多的不定芽，這些密集的芽若不及時進行轉移和分切，很快就開始變成瘦弱苗。 (2)溫度過高，高溫有利于苗的生長，多數(shù)品種適宜的溫度是25左右，在過高的溫度條件下，苗木的伸長速度快，葉片變薄、變長。 (3)光照不足，組培苗會變黃、變弱、變細并加速生長，使苗在短時間內變得更瘦弱。 (4)培養(yǎng)基水分過多，在瓊脂含量不足會引起植株徒長變弱。 (5)通氣不良，在使用不透氣膜時，會增加瓶內濕度，從而使苗表現(xiàn)嫩弱。 以上因素同時出現(xiàn)時，對苗的不良影響明顯大于單一因素，各個因素之間相互促進又相互制約。因此控制瘦弱苗，培養(yǎng)粗壯苗應通過多個因素共同調節(jié)才可能獲得理想的效果。 減少和避免徒長和瘦弱苗的產(chǎn)生，可從以下幾個方面考慮。 (1)根據(jù)品種特點減少細胞分裂素用量，加速繼代轉瓶的速度，適當降低接種密度。 (2)利用空調降低培養(yǎng)室溫度。(3)提高光照強度和延長光照時間，充分利用較強的自然光做光源，調整擺放位置和密度。(4)調整培養(yǎng)基硬度，改用透氣膜做封口，進行培養(yǎng)基及環(huán)境因子的綜合調控，力求獲得最優(yōu)質健壯的組培瓶苗。植物組織培養(yǎng)技術原理之滅菌方法常用的滅菌方法： 常用的滅菌方法可分為物理的和化學的兩類，即：物理方法如干熱(烘燒和灼燒)、濕熱(常壓或高壓蒸煮)、射線處理(紫外線、超聲波、微波)、過濾、清洗和大量無菌水沖洗等措施；化學方法是使用升汞、甲醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇兒、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學藥品處理。1、濕熱滅菌（培養(yǎng)基） 培養(yǎng)基在制備后的24h內完成滅菌工序。高壓滅菌的原理是：在密閉的蒸鍋內，其中的蒸氣不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋內溫度也隨之增加。在o1MPa的壓力下，鍋內溫度達121。在此蒸氣溫度下，可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢。 注意完全排除鍋內空氣，使鍋內全部是水蒸氣，滅菌才能徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，但目的都是要排凈空氣，使鍋內均勻升溫，保證滅菌徹底。常用方法是：關閉放氣閥，通電后，待壓力上升到O05MPa時，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關閉放氣閥。關閥再通電后，壓力表上升達到01MPa時壓力01-015MPa，20min。對于一些布制品，如實驗服、口罩等也可用高壓滅菌。洗凈晾干后用耐高壓塑料袋裝好，高壓滅菌20-30min。培養(yǎng)基中的鐵在高壓滅菌時會催化蔗糖水解，可使15%-25%的蔗糖水解為葡萄糖和果糖。培養(yǎng)基值小于5.5，其水解量更多，培養(yǎng)基中添加0.1%活性炭時，高壓下蔗糖水解大大增強，添加1%活性炭，蔗糖水解率可達5%。防止高壓滅菌培養(yǎng)基變化的方法：(1)經(jīng)常注意搜集有關高壓滅菌影響培養(yǎng)基成分的資料，及時采取有效措施。(2)設計培養(yǎng)基配方時盡量采用效果類似的穩(wěn)定試劑并準確掌握劑量。如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇，以IBA代替IAA，控制活性炭的用量(在0.1%以下)注意pH值對高壓滅菌下培養(yǎng)基中成分的影響等。(3)配制培養(yǎng)基時應注意成分的適當分組與加入的順序。如將磷、鈣和鐵放在最后加入。(4)注意高壓滅菌后培養(yǎng)基pH值的變化及回復動態(tài)。如高壓滅菌后的pH值常由5.80升高至6.48。而96h后又回降至5.8左右。 2、灼燒滅菌（用于無菌操作的器械）在無菌操作時，把鑷子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精燈火焰卜灼燒火菌。冷卻后，立即使用。操作中可采用250或500ml的廣口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。3、紫外線和熏蒸滅菌（空間）(1)紫外線滅菌 在接種室、超凈臺上或接種箱里用紫外燈滅菌。紫外線滅菌是利用輻射因子滅菌，細菌吸收紫外線后，蛋白質和核酸發(fā)生結構變化，引起細菌的染色體變異，造成死亡。紫外線的波長為200300nm，其中以260nm的殺菌能力最強，但是由于紫外線的穿透物質的能力很弱，所以只適于空氣和物體表面的滅菌，而且要求距照射物以不超過1.2m為宜。(2)熏蒸滅菌 用加熱焚燒、氧化等方法，使化學藥劑變?yōu)闅怏w狀態(tài)擴散到空氣中，以殺死空氣和物體表面的微生物。這種方法簡便，只需要把消毒的空間關閉緊密即可。常用熏蒸劑是甲醛，熏蒸時，房間關閉緊密，按58mlm3用量，將甲醛置于廣口容器中，加5g/m3高錳酸鉀氧化揮發(fā)。熏蒸時，房間可預先噴濕以加強效果。冰醋酸也可進行加熱熏蒸，但效果不如甲醛。4、噴霧滅菌（物體表面）物體表面可用一些藥劑涂擦、噴霧滅菌。褐變和玻璃化1、初代培養(yǎng)外植體的褐變外植體褐變是指在接種后，其表面開始褐變，有時甚至會使整個培養(yǎng)基褐變的現(xiàn)象。它的出現(xiàn)是由于植物組織中的多酚氧化酶被激活，而使細胞的代謝發(fā)生變化所致。在褐變過程中，會產(chǎn)生醌類物質，它們多呈棕褐色，當擴散到培養(yǎng)基后，就會抑制其他酶的活性，從而影響所接種外植體的培養(yǎng)。 褐變的主要原因:植物品種:研究表明，在不同品種間的褐變現(xiàn)象是不同的。由于多酚氧化酶活性上的差異。生理狀態(tài):由于外植體的生理狀態(tài)不同，所以在接種后褐變程度也有所不同。一般來說，處于幼齡期的植物材料褐變程度較淺，而從已經(jīng)成年的植株采收的外植體，由于含醌類物質較多，因此褐變較為嚴重。培養(yǎng)基成分：濃度過高的無機鹽會使某些觀賞植物的褐變程度增加，此外，細胞分裂素的水平過高也會刺激某些外植體的多酚氧化酶的活性，從而使褐變現(xiàn)象加深。培養(yǎng)條件不當：如果光照過強、溫度過高、培養(yǎng)時間過長等，均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加速被培養(yǎng)的外植體的褐變程度。減輕褐變現(xiàn)象發(fā)生的方法選擇合適的外植體 一般來說，最好選擇生長處于旺盛的外植體，這樣可以使褐變現(xiàn)象明顯減輕。合適的培養(yǎng)條件 無機鹽成分、植物生長物質水平、適宜溫度、及時繼代培養(yǎng)均可以減輕材料的褐變現(xiàn)象。使用抗氧化劑 在培養(yǎng)基中，使用半胱氨酸、抗壞血酸、PVP等抗氧化劑能夠較為有效地避免或減輕很多外植體的褐變現(xiàn)象。另外，使用0.1%-0.5%的活性炭對防止褐變也有較為明顯的效果。連續(xù)轉移 對容易褐變的材料可間隔1224h的培養(yǎng)后，再轉移到新的培養(yǎng)基上，這樣經(jīng)過連續(xù)處理7-l0d后，褐變現(xiàn)象便會得到控制或大為減輕。 2、繼代培養(yǎng)時材料的玻璃化實踐表明，當植物材料不斷地進行離體繁殖時，有些培養(yǎng)物的嫩莖、葉片往往會呈半透明水漬狀，這種現(xiàn)象通常稱為玻璃化。它的出現(xiàn)會使試管苗生長緩慢、繁殖系數(shù)有所下降。當培養(yǎng)基上細胞分裂素水平較高時，也容易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。在培養(yǎng)基中添加少量聚乙烯醇、脫落酸等物質，能夠在一定程度上減輕玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生。呈現(xiàn)玻璃化的試管苗，其莖、葉表面無蠟質，體內的極性化合物水平較高，細胞持水力差，植株蒸騰作用強，無法進行正常移栽。這種情況主要是由于培養(yǎng)容器中空氣濕度過高，透氣性較差造成的，其具體解決的方法為：增加培養(yǎng)基中的溶質水平，以降低培養(yǎng)基的水勢；減少培養(yǎng)基中含氮化合物的用量；增加光照；增加容器通風，最好進行CO2施肥，這對減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象有明顯的作用；降低培養(yǎng)溫度，進行變溫培養(yǎng)，有助于減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生；降低培養(yǎng)基中細胞分裂素含量，可以考慮加入適量脫落酸。組培苗瘦弱或徒長的防治措施正常的組培苗應當葉色濃綠、植株粗壯。如果在增殖階段出現(xiàn)芽苗瘦弱、徒長或節(jié)間過長，這種苗轉入生根培養(yǎng)時能夠生根，在環(huán)境條件較好的情況下，也會稍轉粗壯，但總體看來，苗的株型、葉色、葉片大小等性狀還是差于生長正常的增殖苗；有時即便是正?；蚪训脑鲋趁?，若生根階段培養(yǎng)基不適宜或培養(yǎng)的環(huán)境條件得不到保障，往往根原基及根還未形成，就很快表現(xiàn)出小苗徒長，節(jié)間明顯伸長，葉片變細、變薄、變嫩并出現(xiàn)黃化。這樣的苗進行過渡培養(yǎng)時，會出現(xiàn)萎蔫和爛根，很容易死亡，過渡成活率極低。對組培苗瘦弱的原因分析如下。(1)細胞分裂素濃度過高，產(chǎn)生了過多的不定芽，這些密集的芽若不及時進行轉移和分切，很快就開始變成瘦弱苗。(2)溫度過高，高溫有利于苗的生長，多數(shù)品種適宜的溫度是25左右，在過高的溫度條件下，苗木的伸長速度快，對于一些有節(jié)間的品種如香石竹、滿天星、菊花等，組培苗會變得特別瘦弱。對一些無節(jié)間種類如非洲菊、勿忘我、情人草等的影響相對小一些，主要是葉片變薄、變長。(3)光照不足，組培苗會變黃、變弱、變細并加速生長，使苗在短時間內變得更瘦弱。(4)培養(yǎng)基水分過