慢病毒包裝原理-介紹

慢病毒包裝系統(tǒng)簡介及應用慢病毒包裝系統(tǒng)簡介及應用 一 慢病毒包裝簡介及其用途一 慢病毒包裝簡介及其用途 慢病毒 Lentivirus 載體是以 HIV 1 人類免疫缺陷 I 型病毒 為基礎發(fā)展起來的 基因治療載體 區(qū)別一般的逆轉錄病毒載體 它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力 慢病毒載體的研究發(fā)展得很快 研究的也非常深入 該載體可以將外源基因有效地整合到 宿主染色體上 從而達到持久性表達 在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細胞 肝細胞 心肌細胞 腫瘤細胞 內(nèi)皮細胞 干細胞等多種類型的細胞 從而達到良好的的基因治療 效果 在美國已經(jīng)開展了臨床研究 效果非常理想 因此具有廣闊的應用前景 目前慢病毒也被廣泛地應用于表達 RNAi 的研究中 由于有些類型細胞脂質(zhì)體轉染效果差 轉移到細胞內(nèi)的 siRNA 半衰期短 體外合成 siRNA 對基因表達的抑制作用通常是短暫的 因而使其應用受到較大的限制 采用事先在體外構建能夠表達 siRNA 的載體 然后轉移到 細胞內(nèi)轉錄 siRNA 的策略 不但使脂質(zhì)體有效轉染的細胞種類增加 而且對基因表達抑制 效果也不遜色于體外合成 siRNA 在長期穩(wěn)定表達載體的細胞中 甚至可以發(fā)揮長期阻斷 基因表達的作用 在所構建的 siRNA 表達載體中 是由 RNA 聚合酶 啟動子來指導 RNA 合成的 這是因為 RNA 聚合酶 有明確的起始和終止序列 而且合成的 RNA 不會帶 poly A 尾 當 RNA 聚合酶 遇到連續(xù) 4 個或 5 個 T 時 它指導的轉錄就會停止 在轉錄產(chǎn) 物 3 端形成 1 4 個 U U6 和 H1 RNA 啟動子是兩種 RNA 聚合酶 依賴的啟動子 其 特點是啟動子自身元素均位于轉錄區(qū)的上游 適合于表達 21ntRNA 和 50ntRNA 莖環(huán) 結構 stem loop 在 siRNA 表達載體中 構成 siRNA 的正義與反義鏈 可由各自的 啟動子分別轉錄 然后兩條鏈互補結合形成 siRNA 也可由載體直接表達小發(fā)卡狀 RNA small hairpin RNA shRNA 載體包含位于 RNA 聚合酶 啟動子和 4 5 T 轉錄 終止位點之間的莖環(huán)結構序列 轉錄后即可折疊成具有 1 4 個 U 3 突出端的莖環(huán)結構 在細胞內(nèi)進一步加工成 siRNA 構建載體前通常要通過合成 siRNA 的方法 尋找高效的 siRNA 然后從中挑選符合載體要求的序列 將其引入 siRNA 表達載體 慢病毒載體 Lentiviral vector 較逆轉錄病毒載體有更廣的宿主范圍 慢病毒能夠有 效感染非周期性和有絲分裂后的細胞 慢病毒載體能夠產(chǎn)生表達 shRNA 的高滴度的慢病毒 在周期性和非周期性細胞 干細胞 受精卵以及分化的后代細胞中表達 shRNA 實現(xiàn)在多 種類型的細胞和轉基因小鼠中特異而穩(wěn)定的基因表達的功能性沉默 為在原代的人和動物 細胞組織中快速而高效地研究基因功能 以及產(chǎn)生特定基因表達降低的動物提供了可能性 慢病毒表達載體包含了包裝 轉染 穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息 慢病毒包裝質(zhì)?？商峁?所有的轉錄并包裝 RNA 到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白 為產(chǎn)生高滴度的病毒 顆粒 需要利用表達載體和包裝質(zhì)粒同時共轉染細胞 在細胞中進行病毒的包裝 包裝好 的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養(yǎng)基中 離心取得上清液后 可以直接用于宿主細胞的感 染 目的基因進入到宿主細胞之后 經(jīng)過反轉錄 整合到基因組 從而高水平的表達效應 分子 二 這一系統(tǒng)的目的 主要是為了解決以下問題 二 這一系統(tǒng)的目的 主要是為了解決以下問題 1 對于一些較難轉染的細胞 如原代細胞 干細胞 不分化的細胞等 能大大提高目的基 因轉導效率 而且目的基因整合到宿主細胞基因組的幾率大大增加 這就為 RNAi cDNA 克隆以及報告基因的研究提供了一個有利的途徑 2 進行穩(wěn)轉細胞株的篩選 3 為活體動物模型實驗提供高質(zhì)量的包含目的基因的病毒液 在細胞相關的實驗操作中 對于一些按常規(guī)方法難以轉染甚至無法轉染的細胞 通過病毒 介導的實驗能夠大大提高基因的轉導效率 以達到目的基因的高效瞬時表達 三 慢病毒載體介紹三 慢病毒載體介紹 慢病毒載體 Lentiviral vector LVs 是在 HIV 1 病毒基礎上改造而成的病毒載體系 統(tǒng) 它能高效的將目的基因 或 RNAi 導入動物和人的原代細胞或細胞系 慢病毒載體 基因組是正鏈 RNA 其基因組進入細胞后 在細胞漿中被其自身攜帶的反轉錄酶反轉為 DNA 形成 DNA 整合前復合體 進入細胞核后 DNA 整合到細胞基因組中 整合后的 DNA 轉錄 mRNA 回到細胞漿中 表達目的蛋白 或產(chǎn)生 RNAi 干擾 慢病毒載體介導的基因表達或 RNAi 干擾作用持續(xù)且穩(wěn)定 原因是目的基因整合到宿主細 胞基因組中 并隨細胞基因組的分裂而分裂 另外 慢病毒載體能有效感染并整合到非分 裂細胞中 以上特性使慢病毒載體與其它病毒載體相比 比如不整合的腺病毒載體 整合 率低的腺相關病毒載體 只整合分裂細胞的傳統(tǒng)逆轉錄病毒載體 有鮮明的特色 大量文 獻研究表明 慢病毒載體介導的目的基因長期表達的組織或細胞包括腦 肝臟 肌肉 視 網(wǎng)膜 造血干細胞 骨髓間充質(zhì)干細胞 巨噬細胞等 慢病毒載體不表達任何 HIV 1 蛋白 免疫原性低 在注射部位無細胞免疫反應 體液免疫 反應也較低 不影響病毒載體的第 2 次注射 四 慢病毒載體的構建四 慢病毒載體的構建 1 1 構建原理構建原理 慢病毒屬于逆轉錄病毒科 但其基因組結構復雜 除 gag pol 和 env 這 3 個和單純逆 轉錄病毒相似的結構基因外 還包括 4 個輔助基因 vif vpr nef vpu 和 2 個調(diào)節(jié)基 因 tat 和 rev HIV 21 是慢病毒中最具特征性的病毒 第一個慢病毒載體系統(tǒng)即以此 病毒為基礎進行構建的 慢病毒載體的構建原理就是將 HIV 21 基因組中的順式作用元件 如包裝信號 長末端重復序列 和編碼反式作用蛋白的序列進行分離 載體系統(tǒng)包括包 裝成分和載體成分 包裝成分由 HIV 21 基因組去除了包裝 逆轉錄和整合所需的順式作 用序列而構建 能反式提供產(chǎn)生病毒顆粒所需的蛋白 載體成分與包裝成分互補 含有包 裝 逆轉錄和整合所需的 HIV 21 順式作用序列 同時具有異源啟動子控制下的多克隆位 點及在此位點插入的目的基因 為降低兩種成分同源重組產(chǎn)生有復制能力的病毒 RCV 的可能性 將包裝成分的 5 LTR 換成巨細胞病毒 CMV 立即早期啟動子 3 LTR 換成 SV 40 polyA 位點等 將包裝成分分別構建在兩個質(zhì)粒上 即一個表達 gag 和 pol 另一個表達 env 根據(jù)這個原理 Naldini 和 Kafri 等構建了三質(zhì)粒表達系統(tǒng) 2 2 三質(zhì)粒表達系統(tǒng)三質(zhì)粒表達系統(tǒng) 三質(zhì)粒表達系統(tǒng)包括包裝質(zhì)粒 包膜蛋白質(zhì)粒和轉移質(zhì)粒 其中包裝質(zhì)粒在 CMV 啟動子的 控制下 表達 HIV 21 復制所需的全部反式激活蛋白 但不產(chǎn)生病毒包膜蛋白及輔助蛋白 vpu 包膜蛋白質(zhì)粒編碼水泡性口炎病毒 G 蛋白 V SV 2G 應用 VSV 2G 包膜的假構型 慢病毒載體擴大了載體的靶細胞嗜性范圍 而且增加了載體的穩(wěn)定性 允許通過高速離心 對載體進行濃縮 提高了滴度 轉移質(zhì)粒中除含有包裝 逆轉錄及整合所需的順式序列 還保留 350 bp 的 gag 和 RRE 并在其中插入目的基因或標志基因 綠色熒光蛋白 GFP 將載體系統(tǒng)分成三個質(zhì)粒最大的益處是使序列重疊的機會大大減少 減少載體重組過程 中產(chǎn)生 RCV 的可能性 通過三質(zhì)粒共轉染 293T 細胞 超速離心后病毒滴度可達 109IU m l 3 3 四質(zhì)粒表達系統(tǒng)四質(zhì)粒表達系統(tǒng) 為了減少 HIV 21 包裝結構的序列同源性 進一步減少重組成 RCV 的可能性 Dull 等人 將輔助基因去除 但由于 gag2pol 的轉運需要 rev 因此 在上述的三質(zhì)粒系統(tǒng)的基礎上 構建成四質(zhì)粒表達系統(tǒng) 該系統(tǒng)加上含 rev 的質(zhì)粒減少了產(chǎn)生 RCV 的可能性 而且對非 分裂期細胞轉導效率無影響 五 慢病毒載體應用五 慢病毒載體應用 1 將目的基因 RNAi 基因轉入難以轉染