慢病毒包裝原理-介紹

慢病毒包裝系統(tǒng)簡介及應(yīng)用慢病毒包裝系統(tǒng)簡介及應(yīng)用 一 慢病毒包裝簡介及其用途一 慢病毒包裝簡介及其用途 慢病毒 Lentivirus 載體是以 HIV 1 人類免疫缺陷 I 型病毒 為基礎(chǔ)發(fā)展起來的 基因治療載體 區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 它對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力 慢病毒載體的研究發(fā)展得很快 研究的也非常深入 該載體可以將外源基因有效地整合到 宿主染色體上 從而達(dá)到持久性表達(dá) 在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞 肝細(xì)胞 心肌細(xì)胞 腫瘤細(xì)胞 內(nèi)皮細(xì)胞 干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞 從而達(dá)到良好的的基因治療 效果 在美國已經(jīng)開展了臨床研究 效果非常理想 因此具有廣闊的應(yīng)用前景 目前慢病毒也被廣泛地應(yīng)用于表達(dá) RNAi 的研究中 由于有些類型細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效果差 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的 siRNA 半衰期短 體外合成 siRNA 對基因表達(dá)的抑制作用通常是短暫的 因而使其應(yīng)用受到較大的限制 采用事先在體外構(gòu)建能夠表達(dá) siRNA 的載體 然后轉(zhuǎn)移到 細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄 siRNA 的策略 不但使脂質(zhì)體有效轉(zhuǎn)染的細(xì)胞種類增加 而且對基因表達(dá)抑制 效果也不遜色于體外合成 siRNA 在長期穩(wěn)定表達(dá)載體的細(xì)胞中 甚至可以發(fā)揮長期阻斷 基因表達(dá)的作用 在所構(gòu)建的 siRNA 表達(dá)載體中 是由 RNA 聚合酶 啟動子來指導(dǎo) RNA 合成的 這是因?yàn)?RNA 聚合酶 有明確的起始和終止序列 而且合成的 RNA 不會帶 poly A 尾 當(dāng) RNA 聚合酶 遇到連續(xù) 4 個或 5 個 T 時 它指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄就會停止 在轉(zhuǎn)錄產(chǎn) 物 3 端形成 1 4 個 U U6 和 H1 RNA 啟動子是兩種 RNA 聚合酶 依賴的啟動子 其 特點(diǎn)是啟動子自身元素均位于轉(zhuǎn)錄區(qū)的上游 適合于表達(dá) 21ntRNA 和 50ntRNA 莖環(huán) 結(jié)構(gòu) stem loop 在 siRNA 表達(dá)載體中 構(gòu)成 siRNA 的正義與反義鏈 可由各自的 啟動子分別轉(zhuǎn)錄 然后兩條鏈互補(bǔ)結(jié)合形成 siRNA 也可由載體直接表達(dá)小發(fā)卡狀 RNA small hairpin RNA shRNA 載體包含位于 RNA 聚合酶 啟動子和 4 5 T 轉(zhuǎn)錄 終止位點(diǎn)之間的莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列 轉(zhuǎn)錄后即可折疊成具有 1 4 個 U 3 突出端的莖環(huán)結(jié)構(gòu) 在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步加工成 siRNA 構(gòu)建載體前通常要通過合成 siRNA 的方法 尋找高效的 siRNA 然后從中挑選符合載體要求的序列 將其引入 siRNA 表達(dá)載體 慢病毒載體 Lentiviral vector 較逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有更廣的宿主范圍 慢病毒能夠有 效感染非周期性和有絲分裂后的細(xì)胞 慢病毒載體能夠產(chǎn)生表達(dá) shRNA 的高滴度的慢病毒 在周期性和非周期性細(xì)胞 干細(xì)胞 受精卵以及分化的后代細(xì)胞中表達(dá) shRNA 實(shí)現(xiàn)在多 種類型的細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因小鼠中特異而穩(wěn)定的基因表達(dá)的功能性沉默 為在原代的人和動物 細(xì)胞組織中快速而高效地研究基因功能 以及產(chǎn)生特定基因表達(dá)降低的動物提供了可能性 慢病毒表達(dá)載體包含了包裝 轉(zhuǎn)染 穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息 慢病毒包裝質(zhì)?？商峁?所有的轉(zhuǎn)錄并包裝 RNA 到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白 為產(chǎn)生高滴度的病毒 顆粒 需要利用表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒同時共轉(zhuǎn)染細(xì)胞 在細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝 包裝好 的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中 離心取得上清液后 可以直接用于宿主細(xì)胞的感 染 目的基因進(jìn)入到宿主細(xì)胞之后 經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄 整合到基因組 從而高水平的表達(dá)效應(yīng) 分子 二 這一系統(tǒng)的目的 主要是為了解決以下問題 二 這一系統(tǒng)的目的 主要是為了解決以下問題 1 對于一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 如原代細(xì)胞 干細(xì)胞 不分化的細(xì)胞等 能大大提高目的基 因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率 而且目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組的幾率大大增加 這就為 RNAi cDNA 克隆以及報(bào)告基因的研究提供了一個有利的途徑 2 進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選 3 為活體動物模型實(shí)驗(yàn)提供高質(zhì)量的包含目的基因的病毒液 在細(xì)胞相關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作中 對于一些按常規(guī)方法難以轉(zhuǎn)染甚至無法轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 通過病毒 介導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虼蟠筇岣呋虻霓D(zhuǎn)導(dǎo)效率 以達(dá)到目的基因的高效瞬時表達(dá) 三 慢病毒載體介紹三 慢病毒載體介紹 慢病毒載體 Lentiviral vector LVs 是在 HIV 1 病毒基礎(chǔ)上改造而成的病毒載體系 統(tǒng) 它能高效的將目的基因 或 RNAi 導(dǎo)入動物和人的原代細(xì)胞或細(xì)胞系 慢病毒載體 基因組是正鏈 RNA 其基因組進(jìn)入細(xì)胞后 在細(xì)胞漿中被其自身攜帶的反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)為 DNA 形成 DNA 整合前復(fù)合體 進(jìn)入細(xì)胞核后 DNA 整合到細(xì)胞基因組中 整合后的 DNA 轉(zhuǎn)錄 mRNA 回到細(xì)胞漿中 表達(dá)目的蛋白 或產(chǎn)生 RNAi 干擾 慢病毒載體介導(dǎo)的基因表達(dá)或 RNAi 干擾作用持續(xù)且穩(wěn)定 原因是目的基因整合到宿主細(xì) 胞基因組中 并隨細(xì)胞基因組的分裂而分裂 另外 慢病毒載體能有效感染并整合到非分 裂細(xì)胞中 以上特性使慢病毒載體與其它病毒載體相比 比如不整合的腺病毒載體 整合 率低的腺相關(guān)病毒載體 只整合分裂細(xì)胞的傳統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 有鮮明的特色 大量文 獻(xiàn)研究表明 慢病毒載體介導(dǎo)的目的基因長期表達(dá)的組織或細(xì)胞包括腦 肝臟 肌肉 視 網(wǎng)膜 造血干細(xì)胞 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 巨噬細(xì)胞等 慢病毒載體不表達(dá)任何 HIV 1 蛋白 免疫原性低 在注射部位無細(xì)胞免疫反應(yīng) 體液免疫 反應(yīng)也較低 不影響病毒載體的第 2 次注射 四 慢病毒載體的構(gòu)建四 慢病毒載體的構(gòu)建 1 1 構(gòu)建原理構(gòu)建原理 慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科 但其基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜 除 gag pol 和 env 這 3 個和單純逆 轉(zhuǎn)錄病毒相似的結(jié)構(gòu)基因外 還包括 4 個輔助基因 vif vpr nef vpu 和 2 個調(diào)節(jié)基 因 tat 和 rev HIV 21 是慢病毒中最具特征性的病毒 第一個慢病毒載體系統(tǒng)即以此 病毒為基礎(chǔ)進(jìn)行構(gòu)建的 慢病毒載體的構(gòu)建原理就是將 HIV 21 基因組中的順式作用元件 如包裝信號 長末端重復(fù)序列 和編碼反式作用蛋白的序列進(jìn)行分離 載體系統(tǒng)包括包 裝成分和載體成分 包裝成分由 HIV 21 基因組去除了包裝 逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作 用序列而構(gòu)建 能反式提供產(chǎn)生病毒顆粒所需的蛋白 載體成分與包裝成分互補(bǔ) 含有包 裝 逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的 HIV 21 順式作用序列 同時具有異源啟動子控制下的多克隆位 點(diǎn)及在此位點(diǎn)插入的目的基因 為降低兩種成分同源重組產(chǎn)生有復(fù)制能力的病毒 RCV 的可能性 將包裝成分的 5 LTR 換成巨細(xì)胞病毒 CMV 立即早期啟動子 3 LTR 換成 SV 40 polyA 位點(diǎn)等 將包裝成分分別構(gòu)建在兩個質(zhì)粒上 即一個表達(dá) gag 和 pol 另一個表達(dá) env 根據(jù)這個原理 Naldini 和 Kafri 等構(gòu)建了三質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng) 2 2 三質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)三質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng) 三質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)包括包裝質(zhì)粒 包膜蛋白質(zhì)粒和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 其中包裝質(zhì)粒在 CMV 啟動子的 控制下 表達(dá) HIV 21 復(fù)制所需的全部反式激活蛋白 但不產(chǎn)生病毒包膜蛋白及輔助蛋白 vpu 包膜蛋白質(zhì)粒編碼水泡性口炎病毒 G 蛋白 V SV 2G 應(yīng)用 VSV 2G 包膜的假構(gòu)型 慢病毒載體擴(kuò)大了載體的靶細(xì)胞嗜性范圍 而且增加了載體的穩(wěn)定性 允許通過高速離心 對載體進(jìn)行濃縮 提高了滴度 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中除含有包裝 逆轉(zhuǎn)錄及整合所需的順式序列 還保留 350 bp 的 gag 和 RRE 并在其中插入目的基因或標(biāo)志基因 綠色熒光蛋白 GFP 將載體系統(tǒng)分成三個質(zhì)粒最大的益處是使序列重疊的機(jī)會大大減少 減少載體重組過程 中產(chǎn)生 RCV 的可能性 通過三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞 超速離心后病毒滴度可達(dá) 109IU m l 3 3 四質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)四質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng) 為了減少 HIV 21 包裝結(jié)構(gòu)的序列同源性 進(jìn)一步減少重組成 RCV 的可能性 Dull 等人 將輔助基因去除 但由于 gag2pol 的轉(zhuǎn)運(yùn)需要 rev 因此 在上述的三質(zhì)粒系統(tǒng)的基礎(chǔ)上 構(gòu)建成四質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng) 該系統(tǒng)加上含 rev 的質(zhì)粒減少了產(chǎn)生 RCV 的可能性 而且對非 分裂期細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率無影響 五 慢病毒載體應(yīng)用五 慢病毒載體應(yīng)用 1 將目的基因 RNAi 基因轉(zhuǎn)入難以轉(zhuǎn)染