【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）節(jié)瘤擬桿菌早期鑒別診斷—PCR檢測方法的建立與應(yīng)用野生動植物保護(hù)與利用碩士論文

密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 節(jié)瘤擬桿菌早期鑒別診斷 測方法的 建立與應(yīng)用 of a to of ,II in an of in I 摘 要 腐蹄病是危害反芻動物養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要疾病之一，瘤擬桿菌 (引起牛、羊、鹿等反芻動物腐蹄病的原發(fā)性病原菌，為指導(dǎo)疫苗預(yù)防需要建立 研究根據(jù)節(jié)瘤擬桿菌特有保守序列設(shè)計引物，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ 立了一種簡單區(qū)分該菌菌群的檢測方法。（ 1）比對纖毛蛋白基因相關(guān)序列，依據(jù) I， 計了可區(qū)分兩大菌群的三條引物，其中上游引物共用，下游引物分別對兩大菌群特異。（ 2）對可能影響 素進(jìn)行了較詳細(xì)的研究，選擇了適宜 樣離心分離細(xì)菌， 21%100 煮沸裂解細(xì)菌，離心取上清作模板；用 凝血樣，溫和裂解紅細(xì)胞，離心沉淀細(xì)菌，以后操作同病樣處理。對 3個因素 、引物、 3個水平， 9 個反應(yīng)組合，選出最佳反應(yīng)條件， 95 2 分鐘； 94 35 秒， 60 30 40 秒 ,70 30 35 秒， 35 個循環(huán)； 70 5分鐘。 253050物 50系）， 1U（ 30系）， 25系）， 應(yīng)體系用帶有 (敏度最高可檢測 30個菌 /30 3）驗證引物特異性試驗：設(shè)計用鹿、牛、羊等健康群體的環(huán)境存在菌（鮮糞，圈泥及其 氧培養(yǎng)物）制備模板擴(kuò)增，用鹿、牛、羊等健康血樣制備基因組核酸作模板擴(kuò)增，及以上模板同時摻入已知節(jié)瘤擬桿菌基因組核酸，觀察到摻入的擴(kuò)增陽性，未摻入的直接用上述模板擴(kuò)增陰性，重復(fù)實驗，結(jié)果一致，證明引物對節(jié)瘤 擬桿菌是特異的。（ 4） 有 16個臨床病樣擴(kuò)增陽性，其余樣品擴(kuò)增陰性，重復(fù) 驗，擴(kuò)增結(jié)果一致。向陰性反應(yīng)體系摻入節(jié)瘤擬桿菌基因組核酸，摻入擴(kuò)增陽性； 20 份臨床病樣中 13 份直接 樣培養(yǎng)物 1例與病樣直接 樣涂片鏡檢疑有 樣 11 例與病樣直接 性結(jié)果吻合，表明床病樣檢測發(fā)現(xiàn)采自趾叉皮炎的 16份病樣與病樣直接 叉皮炎是腐蹄病的初期感染癥狀，表明 測方法適宜腐蹄病的早期診 斷；用病樣對應(yīng)血清與纖毛抗原瓊擴(kuò)實驗，健康動物存在該菌的抗體，表明通過檢測血清抗體間接確定抗原的血清學(xué)方法受抗體產(chǎn)生消退延遲影響不能區(qū)分曾經(jīng)感染和當(dāng)前感染的菌型。此外發(fā)現(xiàn)制約樣部位及病樣處理直接影響 進(jìn)一步驗證擴(kuò)增條帶為目標(biāo)菌序列片段，采用 瘤擬桿菌擴(kuò)增產(chǎn)物和病樣擴(kuò)增陽性產(chǎn)物測序顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物序列一致。 在保證病原采集質(zhì)量，防止實驗操作中交叉污染情況下，本實驗建立的 次實驗還可區(qū)分 I、 清群?？蓪崿F(xiàn)對臨床初期感染病樣中節(jié)瘤擬桿菌快速、靈敏、準(zhǔn)確的直接檢測。 關(guān)鍵詞 ： 節(jié)瘤擬桿菌， 蹄病 is a of or is a he of to a of I in an of in on of of ,II of to ,to I CR as 0ul 1U 95 24 3560 30 400 30 35570 5of of by of to 00 as by To . CR of to be to CR of of in of in of in to be to be . to of NA t CR is . 0ul at 0 . in a 185or I 23or so;of I (+D or +H) in CR CR of in or EB 0 85303 13 of CR CR CR 13 CR is of is CR is to It a to of in an 錄 第一章 引言 . 1 . 1 瘤擬桿菌檢測方法研究進(jìn)展 . 2 離鑒定 . 2 清學(xué)方法 . 2 分子生物學(xué)檢測 . 3 本研究的內(nèi)容和方法 . 4 第二章 實驗材料和方法 . 5 . 5 . 5 . 5 . 5 . 6 . 6 樣品采集及處理 . 6 測體系建立 . 7 . 8 . 9 第三章 試驗結(jié)果 . 10 . 10 . 10 宜退火溫度選定 . 10 . 10 敏度 . 10 物特異性 . 10 床病樣檢測 . 11 . 11 . 12 測結(jié)果 . 13 樣 應(yīng)的可重復(fù)性 . 14 . 14 . 15 第四章 討論與結(jié)論 . 18 . 18 . 18 板制備方法 . 18 . 18 . 19 . 19 床病樣檢測 . 20 樣的 . 21 . 21 . 22 參考文獻(xiàn) . 23 附 錄 . 27 致 謝 . 33 作者簡歷 . 34 V 圖表索引 表 1 環(huán)境樣品不同處理的 果 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 不同方法 對臨床樣本的 檢測結(jié)果 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 第二次臨床病樣診斷結(jié)果 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 臨床病樣 出率 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 測與臨床病樣涂片對應(yīng)關(guān)系 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 臨床病樣直接或其培養(yǎng)物的 出率 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 臨床病樣 測方法的符合率 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 蹄病動物血清纖毛抗原瓊脂擴(kuò)實驗 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 測陽性病樣涂片中的疑似節(jié)瘤擬桿菌 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 退火溫度探測電泳圖片 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 退火溫度探測電泳圖片 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 驗電泳圖片 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 F 型的靈敏度實驗 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 血樣 應(yīng)電泳圖片 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 壞死桿梭菌等菌株 應(yīng)電泳圖片 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 圖 9 第二次病樣直接 泳圖 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 第二次病樣直接 性病樣摻入實驗電泳 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 環(huán)境培養(yǎng)菌及陽性臨床病樣 應(yīng)電泳圖片 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 病樣 應(yīng)電泳圖片 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 圖 12 病樣 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 環(huán) 境 培 養(yǎng) 菌 應(yīng) 電 泳 圖片 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 環(huán)境培養(yǎng)菌 應(yīng)電泳圖片 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 環(huán)境培養(yǎng)菌摻入 酸 應(yīng)電泳圖片 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 圖 16 環(huán)境培養(yǎng)菌 應(yīng)電泳圖片 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 病樣 應(yīng) 電 泳 圖片 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 病樣 應(yīng)電泳圖片 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 病樣同時摻入 酸 應(yīng)產(chǎn)物電泳圖片 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 圖 20 病樣 應(yīng)產(chǎn)物摻 入 酸再擴(kuò)增電泳圖片 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 圖 21 厭氧運(yùn)送后 氧培養(yǎng)物 物 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 圖 22 石蠟油密封 養(yǎng)物 物 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 引言 1 第一章 引言 究的意義及 目的 腐蹄病是由多種細(xì)菌聯(lián)合感染引起的，以蹄部炎癥為主要特征的高度接觸性傳染病，該病多發(fā)生在炎熱潮濕的季節(jié)。目前從腐蹄病病樣已分離出：節(jié)瘤擬桿菌、壞死梭桿菌、變形桿菌、螺旋體及其它化膿性細(xì)菌 22、 27、 28、 42、 52、 54、 56。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，節(jié)瘤擬桿菌可分泌彈性蛋白酶，在炎熱潮濕條件下，反芻動物蹄部軟化，這類彈性蛋白酶會分解軟化蹄角質(zhì)，造成蹄部淺表炎癥，為其它細(xì)菌的侵入打開通道，因而確認(rèn)節(jié)瘤擬桿菌是腐蹄病的原發(fā)性病菌 23、 24、55 。 節(jié)瘤擬桿菌 (引起牛、羊、鹿等反芻動 物腐蹄病的原發(fā)性病原菌，該菌于 1938年首先于患腐蹄病綿羊的病灶中發(fā)現(xiàn)，伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊中， 屬擬桿菌科（ 桿菌屬 (光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)菌一端，兩端或多處膨大若結(jié)瘤，平直或略彎曲的革蘭氏陰性桿菌， 1 3 6織或培養(yǎng)呈多形態(tài)；活體呈翻轉(zhuǎn)運(yùn)動，電鏡下可觀察到周生纖毛。該菌為專性厭氧的革蘭氏陰性桿菌，生長緩慢，需要有蹄粉的培養(yǎng)基上才可生長。在雨量中度、洼地放牧、氣溫適宜時，節(jié)瘤擬桿菌繁殖并分泌彈性蛋白水解酶水解軟 化的蹄角質(zhì)蛋白。菌株的毒力愈強(qiáng)，彈性蛋白酶的分泌能力愈強(qiáng)；引起羊、牛蹄部發(fā)病，發(fā)病初期出現(xiàn)趾叉皮炎，蹄冠紅腫，進(jìn)而蹄膿腫，動物表現(xiàn)為跛行，導(dǎo)致反芻動物生產(chǎn)力嚴(yán)重下降。節(jié)瘤擬桿菌離開動物組織后，不能在自然界長期生存，只能保持毒力數(shù)天；它僅存在于感染蹄，可在其中保持活力數(shù)月，易造成反復(fù)感染，這也是腐蹄病難以消滅的原因之一。節(jié)瘤擬桿菌與壞死梭桿菌協(xié)同作用可導(dǎo)致惡性腐蹄病，發(fā)病率、死亡率增高。對我國反芻動物腐蹄病流行病學(xué)初步調(diào)查表明，其發(fā)病率在 8% 20%，羊的發(fā)病率較高 。國內(nèi)部分地區(qū)調(diào)查表明，在降水量中等偏高，低洼地放牧地區(qū)腐蹄病易發(fā)生，發(fā)病高峰集中在夏季和秋初；五月份氣溫回升，放牧牛、羊開始零散發(fā)病， 6月初開始大量發(fā)病，群發(fā)病率在 20 %以上，有的高達(dá) 80%； 9月份氣溫下降時，發(fā)病率也隨之降低。節(jié)瘤擬桿菌存在多個血清型，在全世界范圍內(nèi)分布不一，一個動物群體內(nèi)可能存在該菌的多個血清群。目前腐蹄病已成為危害反芻動物養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要疾病之一，世界許多畜牧業(yè)發(fā)達(dá)國家也將此病作為重要的傳染病進(jìn)行防治。 由于腐蹄病呈慢性經(jīng)過，早期不易發(fā)現(xiàn)，濫用抗生素使病原菌產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致藥物治療 收效甚微；隨著腐蹄病免疫防制研究的突破，針對腐蹄病主要流行型的全菌滅活苗和菌體亞單位疫苗已研制成功并推廣使用，有效地控制了腐蹄病的流行。節(jié)瘤擬桿菌流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)流行不同血清型，同一地區(qū)不同時期出現(xiàn)不同的血清型，一個群體同時存在多個血清型，甚至一份病樣中可分離到多個血清型 25、 38、 65。對病原體進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，纖毛蛋白可發(fā)生變異，不同血清型的纖毛蛋白亞單位基因間可進(jìn)行重組而產(chǎn)生新的血清型 38、 41、66 。目前控制反芻動物腐蹄病較有效的方法是疫苗免疫接種，由于腐蹄病病原 節(jié)瘤擬桿菌血清型 較多，各血清型之間交叉免疫差，使用主要流行型疫苗才能收到較好效果，因此各地中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 引言 2 區(qū)進(jìn)行腐蹄病免疫接種前需要了解本地區(qū)的流行血清型。為快速確定某地區(qū)流行的菌型，提高疫苗預(yù)防效果，應(yīng)建立節(jié)瘤擬桿菌快速特異的鑒別和分型方法。 瘤擬桿菌檢測方法研究進(jìn)展 離鑒定 采集病樣，進(jìn)行病原菌分離培養(yǎng)及分離菌株生理生化鑒定，是確診 腐蹄病的 最基本方法，目前該方法仍是 腐蹄病病原學(xué)研究的常規(guī)技術(shù)。同時 分菌株的毒力需要依靠生物學(xué)方法鑒定。由于腐蹄病病原節(jié)瘤擬桿菌培養(yǎng)條件苛刻因而 分離較困難 ； 鑒定工作繁瑣耗時，需要花費至 少兩周的時間，才能確定細(xì)菌屬種。同時病原分離鑒定不能進(jìn)行流行型調(diào)查。目前病原分離鑒定臨床意義不大。 清學(xué)方法 許多學(xué)者進(jìn)行了節(jié)瘤擬桿菌血清學(xué)檢測方法的探索。菌體外膜蛋白抗原、纖毛抗原檢測血清中節(jié)瘤擬桿菌的抗體是腐蹄病病原流行型調(diào)查常用的血清學(xué)方法。國內(nèi)外學(xué)者相繼建立了 管凝集試驗、瓊脂擴(kuò)散試驗、對流免疫電泳、 方法檢測發(fā)病群體中血清抗體 25、 32、 36、 46、 50、 58、 60、 61 。針對菌體不同抗原成分建立了 用雜交瘤技術(shù) 制備菌體不同抗原成分的單克隆抗體，可對分離菌株進(jìn)行細(xì)致分型。 通過對菌體免疫保護(hù)性成分的研究發(fā)現(xiàn)，一種熱不穩(wěn)定血清型特異的表面抗原或 59，這種抗原具有凝集反應(yīng)性質(zhì)，易于脫落；結(jié)合菌體結(jié)構(gòu)的顯微觀察，確定這種抗原是纖毛蛋白。研究發(fā)現(xiàn)各型菌株纖毛蛋白具有不同的抗原性，交叉反應(yīng)較小，纖毛蛋白研究為節(jié)瘤擬桿菌的鑒定和分型奠定了基礎(chǔ)。 K 凝集試驗用于檢測血清中節(jié)瘤擬桿菌抗體及血清分型，該方法特異性較強(qiáng)，但敏感性差 32，目前主要用于新分離菌株的血清分型。利用多個血清型節(jié)瘤擬桿菌標(biāo) 準(zhǔn)菌株制備抗原建立了瓊脂擴(kuò)散試驗用于檢測不同菌株的混合感染。對流免疫電泳較瓊擴(kuò)所需時間更短。采用節(jié)瘤擬桿菌的細(xì)胞質(zhì)膜、脂多糖、外膜蛋白（ 理提取）、分泌性蛋白酶四種不同抗原成分建立 現(xiàn)外膜蛋白（ 理提取）為抗原的 鑒別發(fā)病群體是否被 屬特異性較好 61； 9、 34特異性最強(qiáng) ,但敏感性差，在動物人工感染兩周，發(fā)展為蹄嚴(yán)重病變時，檢出率可達(dá) 90%以上，但 能區(qū)分發(fā)病個體曾經(jīng)感染 和當(dāng)前感染產(chǎn)生的抗體。 血清學(xué)方法操作簡便，在 于 且抗原、抗體制備技術(shù)較煩瑣，在檢測方法的特異性和靈敏度方面需要提高。 節(jié)瘤擬桿菌引起動物局部淺表損害，病程緩慢，機(jī)體抗體反應(yīng)延遲，抗體產(chǎn)生量少，血清學(xué)檢測抗體的方法在時間和敏感性上受到限制。該菌屬嚴(yán)格厭氧菌，營養(yǎng)要求苛刻，部分培養(yǎng)基需要進(jìn)口，價格昂貴；另外菌體生長緩慢，產(chǎn)生纖毛蛋白的量不穩(wěn)定。制備纖毛分型抗原技術(shù)要求高，如純度不夠，血清學(xué)檢測特異性就會降低。自然感染痊愈后，該菌可 在損傷部位存在數(shù)月，獲得對某一菌型免疫力的個體，被該菌其它菌型感染的血清學(xué)檢測常常呈現(xiàn)多個血清中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 引言 3 型；作為分型依據(jù)的纖毛抗原在自然狀態(tài)下存在重組變異 38、 41、 65 ,為血清學(xué)方法確定當(dāng)前主要流行血清型增加困難。因而建立病原菌節(jié)瘤擬桿菌的早期檢測方法是非常必要的。 分子生物學(xué)檢測 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展， 檢測獲得了進(jìn)一步的發(fā)展，相繼建立了單克隆抗體雜交技術(shù)、核酸探針雜交技術(shù)、 16S 于菌株鑒別、分型以及毒力菌株鑒定。 采用分 子生物學(xué)技術(shù)， 制備了 毛蛋白的單克隆抗體，采用術(shù) 對分離菌株開展細(xì)致的菌株分型 35、 50、 53、 63。 基因組和大量功能基因被分離和鑒定，尤其作為血清學(xué)分型依據(jù)的纖毛蛋白基因研究報道較多，并且已有大量的纖毛蛋白基因序列發(fā)布，為利用核酸技術(shù)進(jìn)行 過比較 選特異性序列制備基因探針進(jìn)行病原檢測與分型。目前已有報道采用分泌性蛋白酶特定基因序列為核酸探 針，通過 交進(jìn)行 45、 49、 57。 16S 因也用于探針制備對分離菌株進(jìn)行基因分型。 根據(jù)不同菌株某一基因序列的比較，找出群特異性序列設(shè)計引物（引物序列保守），建立廣泛用于 44、 47、 48、 57。依據(jù)病原菌種特異性的 16S 43 ，已用于直接檢測病樣中的 據(jù)病原外膜蛋白、16S 用 法擴(kuò) 增片段并進(jìn)行酶切片段長度多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)分離菌株酶切圖譜可分為有限的種類，該方法可用做菌株分型 33、 64。通過纖毛蛋白和相應(yīng)基因序列比較分析，發(fā)現(xiàn)各血清型纖毛基因序列存在保守區(qū) 37、 51 ；依據(jù)保守區(qū)設(shè)計引物，建立多聯(lián)組合 39、 40，將血清分型與基因分型結(jié)合起來，直接檢測病樣中的 確定血清型；其中以澳大利亞悉尼大學(xué) P 等設(shè)計的血清群特異多聯(lián)組合 30；美國林肯大學(xué) 設(shè)計的單管多聯(lián) 物來 擴(kuò)增不同血清型的纖毛蛋白基因可變區(qū)，結(jié)合反向斑點雜交技術(shù)進(jìn)一步可確定每個菌群中存在的亞型67。 術(shù)優(yōu)勢還體現(xiàn)在對病樣中存在的非目標(biāo)菌無反應(yīng)，不存在血清學(xué)檢測時常見雜菌非特異性干擾問題，可用于 實驗室對新分離菌株的鑒別和分型提供了一種快捷的方法，可快速檢測生產(chǎn)纖毛抗原的轉(zhuǎn)基因菌基因轉(zhuǎn)移是否成功及轉(zhuǎn)基因菌的遺傳穩(wěn)定性。 細(xì)菌核酸序列信息資源的積累，為利用菌種核酸序列鑒定與分型提供了廣闊的途徑。在診斷腐蹄病時，由于壞死梭桿菌能與節(jié)瘤擬桿菌協(xié)同感染引發(fā)惡性化膿性腐蹄 病，因此設(shè)計有節(jié)瘤擬桿菌與壞死梭桿菌單管多聯(lián) 病原基因序列檢測與血清學(xué)檢測方法相比，基因序列的檢測可避免蛋白表型發(fā)生變異的影響，選擇病原基因序列的保守區(qū)設(shè)計引物建立 病樣中存在的非目標(biāo)菌無反應(yīng)，不存在血清學(xué)檢測時常見雜菌對目標(biāo)菌檢測的干擾，檢測特異性強(qiáng)；另一方面，采用血清學(xué)方法對節(jié)瘤擬桿菌進(jìn)行檢測和分型，周期較長，而 術(shù)具有快速、特異、敏感等特點， 敏度高，可實現(xiàn)腐蹄病病原菌的鑒別診斷和早期檢中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 引言 4 測，因此 采用 本研究的內(nèi)容和方法 由于纖毛蛋白是菌體的主要保護(hù)性抗原，是血清型分群的依據(jù)，因而針對纖毛蛋白開展的工作較多，對纖毛蛋白亞單位核酸序列數(shù)據(jù)的比較分析 37、 51 研究，為多種目標(biāo)設(shè)計的 前為止 檢索 血清群 A、 B、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 M66歸類來自不同菌株的纖毛蛋白基因序列被測序和注釋，進(jìn)入核酸數(shù)據(jù)庫，豐富了纖毛序列的核酸序列 數(shù)據(jù)，為通過序列比較分析，準(zhǔn)確設(shè)計保守性引物，開展 P 分別用 功進(jìn)行了 3167，說明利用纖毛基因序列建立 在我國，建立在基因基礎(chǔ)上的腐蹄病快速診斷尚未見報道。目前 、 B、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 血清群下又分出許多血清型，亞型，對不同地區(qū)開展流行型普 查，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)新的血清型和亞型。由于各血清型纖毛蛋白的基因序列存在差異，因而要想快速、全面的了解某一地區(qū)流行的 清型，建立 試驗擬用已知纖毛蛋白基因序列，經(jīng)同源性序列比對，找出同源性高的序列并歸類，設(shè)計每群的保守引物建立 行 清群流行病學(xué)調(diào)查，為實驗室對新分離菌株的群確定提供了一種快捷的方法。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 實驗材料和方法 5 第二章 實驗材料和方法 料 株及環(huán)境菌群 節(jié)瘤擬桿菌（ 實驗室保存）； 壞死梭桿菌 、 氣莢膜梭菌 ，（本實驗室保存），銅綠假單胞菌（購自中國醫(yī)學(xué)微生物保藏中心），產(chǎn)氣莢膜梭菌 源）、產(chǎn)氣莢膜梭菌 源）（購自中國獸醫(yī)藥監(jiān)察所），變形桿菌（購自中國醫(yī)學(xué)微生物保藏中心）； 腸菌群、土壤菌群、水體菌群（從反芻動物新鮮糞便，圈泥，環(huán)境水體分離或培養(yǎng)得到）， 口腔菌群（人口腔分離或培養(yǎng)得到）。 樣 鹿、牛、羊 劑與主要儀器： 改良 養(yǎng)基 :8g,酵母提取物 5g,精氨酸 胱氨酸 蛋白胨 10g,用 1調(diào)到 21滅菌 200 備用。 厭氧菌運(yùn)送培養(yǎng)基： 脂 50餾水后，冷至 50加入 天青 125121滅菌 20 分鐘，備用。 10 1 220 2 100: 100 2100: 100 0 1 10 750 5 ),200 上樣緩沖液： 溴酚藍(lán) 加雙蒸水 10 500入已溶解的溴酚藍(lán)溶液中，搖勻定容至 100 0度 10mg/ 50 2427 100容至 1L。 美公司）， ， 蛋白酶 K（ 凍 離心機(jī)， 534X 和 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 實驗材料和方法 6 血細(xì)胞記數(shù)板， 厭氧罐（沈陽醫(yī)療器械廠）， 三恒多用電泳儀 北京市六一儀器廠 ), 凝膠紫外分析