【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）小麥不同外植體農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系研究作物遺傳育種碩士論文

密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士學(xué)位論文 小麥不同外植體農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系研究 摘 要 目前為止，小麥幼胚是利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功轉(zhuǎn)化小麥的唯一外植體， 常用的基因型，不但小麥幼胚的取材受季節(jié)的嚴(yán)格限制，而且存在著基因型單一、轉(zhuǎn)化效率不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。篩選對(duì)農(nóng)桿菌敏感的小麥基因型，建立或完善農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化小麥成熟胚、幼穗和幼胚的技術(shù) 體系，同時(shí)將一些與性狀改良有關(guān)的功能基因?qū)胄←?，?duì)于小麥新品種選育和功能基因組研究具有重要意義。本研究選用來(lái)自全國(guó)各地的 91 個(gè)小麥基因型，分別以其成熟胚、幼穗和幼胚為受體材料進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，通過(guò) 因的瞬間表達(dá)篩選對(duì)農(nóng)桿菌敏感的小麥基因型，通過(guò)對(duì)受體材料處理方式和共培養(yǎng)方式的比較等技術(shù)環(huán)節(jié)的研究，將高分子量麥谷蛋白亞基編碼基因 154X、 154Y、 標(biāo)記基因 I、報(bào)告基因 入小麥。 通過(guò)農(nóng)桿菌侵染后 因瞬間表達(dá)，從 80 個(gè)小麥品種中篩選到了 97選 208、豫麥 66、揚(yáng) 麥 6號(hào)等基因型，其幼胚對(duì)農(nóng)桿菌感染非常敏感， 從 83 個(gè)小麥品種中篩選到京冬 8 號(hào)、 農(nóng) 2611、京冬 11 等基因型的幼穗經(jīng)對(duì)農(nóng)桿菌感染比較敏感， 因瞬間表達(dá)率達(dá)到了 多數(shù)基因型的幼穗對(duì)農(nóng)桿菌感染不敏感。對(duì)小麥?zhǔn)荏w組織與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)方式進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，濾紙上共培養(yǎng)方式更有利于農(nóng)桿菌對(duì)小麥三種不同外植體的侵染，濾紙上共培養(yǎng)方式 因表達(dá)率平均比固體培養(yǎng)基共培養(yǎng)方式高 對(duì)小麥成熟胚在農(nóng)桿菌感染前采用了三種不同的 處理方法，結(jié)果表明，成熟胚縱切成兩半后直接進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化更有利于農(nóng)桿菌的侵染和抗性愈傷組織誘導(dǎo)、再生，首次利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化小麥成熟胚獲得了小麥轉(zhuǎn)基因植株。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化小麥幼胚也獲得了轉(zhuǎn)基因植株，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化小麥幼穗獲得了抗性再生植株。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了 測(cè)、測(cè)和 測(cè)，并對(duì) 轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了遺傳分析，對(duì) 轉(zhuǎn)基因材料和轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行了跟蹤檢測(cè)。 關(guān)鍵字：小麥，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，成熟胚，幼胚，幼穗，基因型篩選，分子檢測(cè) n of to is is of of by as it is to to of by to to 83 in 154X 54Y. by US by of 9, 611, 1 to US , , 706 to US , . to on it on as US T, 154X, by as be to It at of by as by as CR by of 1 錄 第一章 緒論 . 1 麥遺傳轉(zhuǎn)化的主要方法 . 2 因槍法介導(dǎo)的小麥轉(zhuǎn)化 . 2 桿菌介導(dǎo)的小麥轉(zhuǎn)化 . 3 它方法介導(dǎo)的小麥轉(zhuǎn)化 . 4 麥農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化研究現(xiàn)狀 . 5 子葉植物農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化回顧 . 5 麥農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展 . 6 響農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化小麥的因素 . 7 麥植株生長(zhǎng)條件控制 . 8 麥基因型 . 8 植體類型 . 8 桿菌菌株和載體 . 8 種預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)的條件 . 9 擇標(biāo)記基因 . 10 麥農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化存在的問(wèn)題 . 11 研究的意義、主要內(nèi)容及技術(shù)路線 . 12 題意義 . 12 究?jī)?nèi)容 . 12 術(shù) 路線 . 13 第二章 小麥成熟胚農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系研究 .驗(yàn)材枓 . 14 源基因、質(zhì)粒載體及其農(nóng)桿菌菌系 . 14 麥材料 . 14 劑及耗材 . 15 器設(shè)備 . 16 物 . 16 究方法 . 16 桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化小麥成熟胚 . 16 麥抗性再生植株 取 . 19 粒 . 19 段的回收與純化 . 20 織化學(xué)染色檢測(cè) . 20 性再生植株的 . 20 抗性再生植株的 . 21 基因植株的 析 . 21 果與分析 . 22 傷組織誘導(dǎo)結(jié)果 . 22 織化學(xué)染色結(jié)果 . 23 0代轉(zhuǎn)基因植株獲得 . 24 0代轉(zhuǎn)基因植株 . 25 1代轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)和遺傳分析 . 27 2代轉(zhuǎn)基因植株跟蹤檢測(cè) . 28 基因植株 測(cè) . 31 題討論 . 32 于成熟胚外植體的處理方法和轉(zhuǎn)化效率 . 32 于 果不一致的原因 . 32 1代植株分離比例不符合 3:1 的可能原因 . 33 于高分子量麥谷蛋白亞基基因在小麥中的表達(dá) . 33 第三章 小麥幼胚農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系研究 .驗(yàn)材枓 . 34 源基因、質(zhì)粒載體及農(nóng)桿菌菌系 . 34 麥材料 . 35 劑及耗材 . 36 器設(shè)備 . 36 物 . 36 究方法 . 36 桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化小麥幼胚 . 36 性再生植株 . 38 織化學(xué)染色檢測(cè) . 38 性再生植株的 . 38 性再生植株的 . 38 果與分析 . 39 同小麥基因型幼胚農(nóng)桿菌敏感性差異 . 39 性再生植株獲得 . 42 0代抗性再生植株 . 42 論 . 44 于農(nóng)桿菌敏感性小麥基因型篩選 . 44 于小麥與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)方式 . 44 于誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基的改進(jìn) . 45 第四章 小麥幼穗農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系研究 . V 驗(yàn)材枓 . 46 源基因、質(zhì)粒載體及其農(nóng)桿菌菌系 . 46 麥材料 . 47 劑及耗材 . 47 器設(shè)備 . 47 究方法 . 47 桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化小麥幼穗 . 47 麥植株 . 48 織化學(xué)染色檢測(cè) . 48 性再生植株的 . 48 果與分析 . 49 傷組織誘導(dǎo)結(jié)果 . 49 織化學(xué)染色結(jié)果 . 49 性再生植株的獲得 . 52 性再生植株 測(cè) . 52 題討論 . 52 第五章 結(jié)論 .考文獻(xiàn) . 謝 .者簡(jiǎn)歷 . 文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶 牛血清白蛋白 (第五組分 ) 基對(duì) 2,4,42,4聯(lián)免疫吸附測(cè)定法 種抗生素 花蓮?fù)庠茨?潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 養(yǎng)基名稱 -(2-(乙磺酸 養(yǎng)基名稱 萘乙酸 新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 二烷基硫酸鈉 羥甲基氨基甲烷和乙二氨四乙酸鈉鹽 （羥甲基）氨基甲烷 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 1 第一章 緒論 組技術(shù)的創(chuàng)立使分子生物學(xué)研究由理論進(jìn)入實(shí)踐，基因工程技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面，植物基因工程育種技術(shù)為植物產(chǎn)量提高和品質(zhì)改良開辟了廣闊的前景。 20 世紀(jì)80年代初 1985年 服了利用植物原生質(zhì)體、懸 浮細(xì)胞等作為外源基因受體所帶來(lái)的再生困難，直接用 植 物的組織塊進(jìn)行轉(zhuǎn)化大大簡(jiǎn)化了試驗(yàn)程序。利用這一轉(zhuǎn)化技術(shù)，馬鈴薯、番茄、擬南芥等雙子葉模式植物相繼轉(zhuǎn)基因獲得成功。此后，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)迅速發(fā)展，先后建立了除農(nóng)桿菌介導(dǎo)法以外的 導(dǎo)法、電激穿孔法、病毒介導(dǎo)法、基因槍法、顯微注射法、花粉管通道法、超聲波法等。經(jīng)過(guò)多年的實(shí)踐和優(yōu)勝劣汰，多數(shù)轉(zhuǎn)化方法已被逐步放棄，形成了以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍介導(dǎo)法占主導(dǎo)地位的兩大植物轉(zhuǎn)基因體系，通過(guò)這兩種方法獲得成功的報(bào)道占轉(zhuǎn)基因總數(shù)的 90%，其中農(nóng)桿菌法獲得的轉(zhuǎn)基因植物占轉(zhuǎn)基因 植物總數(shù)的 85%左右。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法主要用于雙子葉植物，基因槍介導(dǎo)法主要用于單子葉植物。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍介導(dǎo)法，很多植物的轉(zhuǎn)基因研究獲得了成功，涉及 35個(gè)科的 50 多個(gè)物種，共 120 多種植物。眾所周知，世界上一半以上的食物來(lái)源于禾谷類作物，而禾谷類作物的遺傳轉(zhuǎn)化研究一度進(jìn)展緩慢。 1988 年 利用基因槍介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化玉米懸浮細(xì)胞系，獲得了可育的轉(zhuǎn)基因植株。 1994 年 以水稻成熟胚愈傷組織和未成熟幼胚為受體，獲得了較多有嚴(yán)格分子生物學(xué)證據(jù)的轉(zhuǎn)基因水稻植株，并對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻的影響因素進(jìn)行 了詳細(xì)研究，建立了比較成熟的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻的技術(shù)體系，為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化單子葉植物開辟了先河。 隨著轉(zhuǎn)基因體系的建立和成熟，科學(xué)家們業(yè)已將一些功能基因轉(zhuǎn)入了主要農(nóng)作物，培育了轉(zhuǎn)基因作物新品種，如抗蟲轉(zhuǎn)基因棉花、抗除草劑轉(zhuǎn)基因大豆、抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米、抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜等。自 1986 年轉(zhuǎn)基因植物首次獲準(zhǔn)進(jìn)入田間試驗(yàn)、 1994 年轉(zhuǎn)基因番茄在美國(guó)批準(zhǔn)上市以來(lái)， 2000 年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積 4,420 萬(wàn)公頃， 2004 年達(dá) 8,100 萬(wàn)公頃， 2005年達(dá) 9,000 萬(wàn)公頃，比 2004 年增加了 11%。與 2000 年相比， 2005 年不僅轉(zhuǎn)基因作物種植面積有所增加，而且種 植 的國(guó)家也趨向多元化，除美國(guó)、阿根廷、加拿大、巴西、中國(guó)等種植大國(guó)外，巴拉圭、南非、烏拉圭、澳大利亞、印度、羅馬尼亞、西班牙、墨西哥、菲律賓、哥倫比亞、保加利亞、洪都拉斯、德國(guó)、印度尼西亞、伊朗、葡萄牙、捷克等也有一定種植面積。 據(jù)統(tǒng)計(jì)， 2005 年全球轉(zhuǎn)基因作物中的 38種植在發(fā)展中國(guó)家，而且其發(fā)展趨勢(shì)呈現(xiàn)持續(xù)增長(zhǎng)勢(shì)頭。在發(fā)展中國(guó)家，人口增長(zhǎng)和食物短缺的矛盾日益尖銳，同時(shí)伴隨著耕地減少、生物種植和生存環(huán)境的惡化，轉(zhuǎn)基因技術(shù)是解決這些問(wèn)題的最有效途徑。在發(fā)達(dá)國(guó)家，轉(zhuǎn)基 因作物的種植已經(jīng)產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。 2005 年全球轉(zhuǎn)基因作物的交易額達(dá)到 美元，預(yù)計(jì) 2010 年達(dá) 到 100 億美元。人類對(duì)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、抗病抗逆生物的需要，以及對(duì)低成本高產(chǎn)出的追求，無(wú)疑將促使轉(zhuǎn)基因技術(shù)的深入研究和轉(zhuǎn)基因生物的大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化。我國(guó)科學(xué)家在世中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 2 界上率先將抗蟲基因、抗除草劑基因和抗白葉枯病基因?qū)肓怂?，目前正在進(jìn)行環(huán)境釋放和生產(chǎn)試驗(yàn)，有望近幾年實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。 麥遺傳轉(zhuǎn)化的主要方法 世界上小麥種植面積約占耕地面積的 17，小麥?zhǔn)侨祟悢z取熱量與蛋白質(zhì)的主要來(lái)源之一，還提供重要的維生素和礦 物質(zhì)，如維生素 B 和 E，含鎂和磷的物質(zhì)，以及纖維類物質(zhì)。傳統(tǒng)小麥育種方法育種周期長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展為小麥育種提供了一種新的遺傳改良手段，并且彌補(bǔ)了傳統(tǒng)育種方法的不足，不僅可以增加產(chǎn)量，還可以改良品質(zhì)，提高抗性。但是在糧食作物中，小麥屬于遺傳轉(zhuǎn)化最為困難的作物，加上轉(zhuǎn)基因研究起步較晚，基因工程育種進(jìn)程明顯落后于其它作物。在諸多轉(zhuǎn)基因方法中，小麥轉(zhuǎn)基因研究主要采用了基因槍和農(nóng)桿菌介導(dǎo)兩種轉(zhuǎn)化方法。 因槍法介導(dǎo)的小麥轉(zhuǎn)化 基因槍法也稱為粒子轟擊 (近幾年來(lái)大量采用的有效方法。其原理是將載有外源 鎢（金）等顆粒加速后射入受體細(xì)胞，加速的動(dòng)力是通過(guò)火藥爆炸或高壓氣體或高壓放電加在粒子上的瞬時(shí)沖量，目前主要應(yīng)用的是壓縮氣體驅(qū)動(dòng)的基因槍，如以氦氣、氫氣、氮?dú)獾闰?qū)動(dòng)的 1000 系統(tǒng)，影響基因轉(zhuǎn)化的主要因素包括： (1)基因槍轟擊參數(shù)。如粒子速度，射入深度，阻擋板至樣品室高度，轟擊次數(shù)，上樣方式，射彈的理化特性， 純度及濃度， 亞精胺濃度等。(2)生物因子。如外植體的種類 ，細(xì)胞生理狀態(tài)，轟擊前后的培養(yǎng)條件，以及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境對(duì)外源 運(yùn)的影響等。目前為止，基因槍轉(zhuǎn)化成功的植物已達(dá) 20 多種，包括大豆、煙草、水稻、小麥、棉花、玉米、甘蔗等。但基因槍介導(dǎo)法存在轉(zhuǎn)化效率比較低，插入外源 拷貝整合比較多，容易發(fā)生基因沉默現(xiàn)象，不能導(dǎo)入大片段 缺點(diǎn)，而且成本高，操作比較復(fù)雜。在實(shí)際應(yīng)用中有一定局限性。 1992 年 利用基因槍介導(dǎo)法將 因?qū)肓诵←?，獲得了世界上第一例小麥轉(zhuǎn)基因植株。 1993 年 、 利用基因槍介導(dǎo)法分別將 因、 因?qū)肓诵←?，建立了基因槍法轉(zhuǎn)化小麥的技術(shù)體系。在隨后的幾年內(nèi)，小麥轉(zhuǎn)基因研究基本上借助 于基因槍介導(dǎo)法。 1994 年 利用基因槍介導(dǎo)法將 因和 因?qū)肓诵←湥@得了轉(zhuǎn)基因植株。 1995 年 利用基因槍介導(dǎo)法將 因和 因?qū)肓诵←?，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。 1996 年 、 、 、 利用基因槍介導(dǎo)法分別將 因、 因、 因和 因轉(zhuǎn)入了小麥，完善了基因槍法轉(zhuǎn)化小麥的技術(shù)體系。 (1996)、張曉 東等 (1997)、陳梁鴻 (1997)、 (1998)分別利用基因槍法將編碼高分子量谷蛋白亞基 因?qū)肓诵←溣着吆陀姿?，獲得了穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。徐惠君等 (2001)利用基因槍介導(dǎo)法將 制酶基因?qū)肓诵←湥飙偡嫉?(2001)、梁輝等 (2004)分別利用基因槍介導(dǎo)法將 因?qū)肓诵←湥D(zhuǎn)基因小麥對(duì)黃花葉病毒病、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 3 蚜蟲表現(xiàn)較強(qiáng)抗性，目前已進(jìn)入環(huán)境釋放階段。（表 1 表 1因槍法轉(zhuǎn)化小麥情況 w b y bo 外源基因 Ex 轉(zhuǎn)化結(jié)果 來(lái)源 株 (1992) 株 張 嘵 東 等 (1997) 株 a 等 (1996) 植株 (1995) 株 (1992) 株 (1993) 株 (1996) 株 (1993) 株 (1994) 株 y 等 (1996) 株 (1996) 株 (1996) 愈 傷 組 織 (1991) 株 徐 惠 君 等 (2001) 植株 徐 瓊 芳 等 (2001) 株 梁 輝 等 (2004) 桿菌介導(dǎo)的小麥轉(zhuǎn)化 農(nóng)桿菌是一種革蘭氏陰性土壤桿菌， 1907 年發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌是植物致瘤的起因，植物細(xì)胞 被侵染后，形成腫瘤。能夠誘發(fā)冠癭瘤的稱為根癌農(nóng)桿菌 (誘導(dǎo)毛發(fā)狀根的稱為發(fā)根農(nóng)桿菌 (受感染的細(xì)胞可產(chǎn)生正常細(xì)胞所不能產(chǎn)生的生物堿冠癭堿，被農(nóng)桿菌利用作為自身繁殖所需要的碳源和氮源。致瘤必須有 粒上 因兩部分參與。 有 5端和 3端真核表達(dá)信號(hào)，如 等。 兩端左右邊界各為 25重復(fù)序列，完全保守。盡管 整合進(jìn)植物基因組中，但 因并不與 轉(zhuǎn)移及整合有關(guān)，因?yàn)樗痪幋a使移的產(chǎn)物。 移由質(zhì)粒上的 因區(qū)控制。 因區(qū)大小為 30括B、 C、 D、 E、 G、