免疫組化的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

免疫組化的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)（1）常見問題 生 物 谷 網(wǎng) 站 免疫組織化學(xué)的概念： 免疫組化是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))，對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)。免疫組化實(shí)驗(yàn)中常用的抗體為單克隆抗體和多克隆抗體。免疫組化實(shí)驗(yàn)所用的組織和細(xì)胞標(biāo)本有哪些？實(shí)驗(yàn)所用主要為組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類，前者包括石蠟切片（病理大片和組織芯片）和冰凍切片，后者包括組織印片、細(xì)胞爬片和細(xì)胞涂片。其中石蠟切片是制作組織標(biāo)本最常用、最基本的方法，對(duì)于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對(duì)照觀察；還能長(zhǎng)期存檔，供回顧性研究；石蠟切片制作過程對(duì)組織內(nèi)抗原暴露有一定的影響，但可進(jìn)行抗原修復(fù)，是免疫組化中首選的組織標(biāo)本制作方法。石蠟切片為什么要做抗原修復(fù)？有哪些方法？石蠟切片標(biāo)本均用甲醛固定，使得細(xì)胞內(nèi)抗原形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇，同時(shí)蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽。所以要求在進(jìn)行IHC染色時(shí)，需要先進(jìn)行抗原修復(fù)或暴露，即將固定時(shí)分子之間所形成的交聯(lián)破壞，而恢復(fù)抗原的原有空間形態(tài)。常用的抗原修復(fù)方法有微波修復(fù)法，高壓加熱法，酶消化法，水煮加熱法等，常用的修復(fù)液是pH6.0的0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液。免疫組化常用的染色方法有哪些？根據(jù)標(biāo)記物的不同分為免疫熒光法，免疫酶標(biāo)法，親和組織化學(xué)法，后者是以一種物質(zhì)對(duì)某種組織成分具有高度親合力為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法。這種方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗體)在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平的定位，其中生物素抗生物素染色法最常用?？贵w的保存：抗體儲(chǔ)存容器應(yīng)由不吸附蛋白質(zhì)的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如儲(chǔ)存的抗體中蛋白濃度很低（10-100mg/L），就應(yīng)另加隔離蛋白以減少容器對(duì)抗體蛋白的吸附，隔離蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。絕大多數(shù)已稀釋的抗體應(yīng)存在4-8條件下，以免凍融對(duì)抗體蛋白產(chǎn)生有害效應(yīng)。抗體原液和已分離的免疫球蛋白組分應(yīng)保存于-20條件下，并避免反復(fù)凍融。冷凍的抗體溶液應(yīng)置于室溫中緩慢地解凍，應(yīng)絕對(duì)避免用高溫快速解凍。被細(xì)菌污染的抗體常會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果，應(yīng)將污染的抗體溶液及其他試劑棄之。為防止細(xì)菌污染，可于抗體溶液中加入0.01%疊氮鈉?？贵w經(jīng)真空冷凍干燥后置-20以下可保存3-5年。保存稀釋后的單抗應(yīng)加入0.1%疊氮鈉濃度。大多數(shù)稀釋抗體可進(jìn)行冷凍保存，少數(shù)抗體可能會(huì)丟失抗原活性。大多數(shù)單抗，只要蛋白濃度適當(dāng)，可在4下保存數(shù)月。多聚賴氨酸溶液（Poly-L-Lysine Solution） Cat.No.: SGP8920 Size: 10mlConc.: 0.1% w/v, in water Storage: 18-26Thimerosal, 0.01%, added as preservative多聚賴氨酸溶液是廣泛應(yīng)用的組織切片與玻片黏合劑，該多聚陽離子分子與組織切片上的陰離子相互作用會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的黏合力。適用組織學(xué)，免疫組織化學(xué)，冰凍切片，細(xì)胞涂片，原位雜交等使用的玻片的防脫片處理，以防實(shí)驗(yàn)操作過程中組織掉片。也可用于細(xì)胞培養(yǎng)，增加細(xì)胞貼壁能力。使用說明免疫學(xué)操作步驟（可直接在玻片上涂布）1 滅菌的ddH2O 1:10稀釋該多聚賴氨酸溶液。2 用之前將稀釋的多聚賴氨酸溶液放在室內(nèi)，使其溫度到室溫18-263 將玻片浸在稀釋的多聚賴氨酸溶液5分鐘。注意增加時(shí)間不會(huì)提高包被效果。4在60烘箱1小時(shí)干燥，或室溫18-26過夜干燥待用。注意1 每100mL已稀釋的多聚賴氨酸溶液要包被的玻片40-90張， 超過90張片子將影響其黏合力。2 用之前的玻片必須保持清潔。必要時(shí)用含1% HCl的70%乙醇溶液來清洗。4 釋過的多聚賴氨酸溶液要放在2-8，至少在3個(gè)月