免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)ppt課件

免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 1 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)課件 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 2 中性粒細(xì)胞的吞噬作用 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1 熟悉中性粒細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)的原理和方法 2 通過(guò)本實(shí)驗(yàn)理解機(jī)體的非特異性免疫機(jī)制 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 3 實(shí)驗(yàn)原理 中性粒細(xì)胞具有吞噬殺菌功能 當(dāng)與顆粒性物質(zhì) 如葡萄球菌等 混合孵育一定時(shí)間后 顆粒性物質(zhì)被吞噬殺滅 根據(jù)吞噬率 吞噬指數(shù)可反映該細(xì)胞的吞噬功能 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 4 實(shí)驗(yàn)材料 1 表皮 白色 葡萄球菌菌液 濃度6 10億 ml 2 肝素溶液 25U ml 甲醇 堿性美藍(lán) 或瑞氏 染液 3 血紅蛋白吸管 凹玻片 載玻片 采血針 微量加樣器 濕盒 顯微鏡 恒溫培養(yǎng)箱 75 酒精 棉簽 香柏油 二甲苯等 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 5 實(shí)驗(yàn)方法 1 用微量加樣器 吸取肝素20ul加入潔凈凹玻片凹孔內(nèi) 2 用酒精棉簽消毒手指后 刺破皮膚 以血紅蛋白吸管取血40ul 立即放入盛有肝素的凹玻片凹孔內(nèi) 并充分混勻 3 用微量加樣器取葡萄球菌菌液20ul加入上述凹玻片凹孔內(nèi) 充分混勻 4 將凹玻片置于濕盒內(nèi) 30 溫箱中30min 其間每隔10min搖勻一次 5 取一小滴上述混合液 置于載玻片上 用另一載玻片推成薄血片 待干 6 滴加甲醇固定3min 水洗 7 加堿性美藍(lán)染色1 2min 水洗 印干 8 置油鏡下觀察吞噬和未吞噬的白細(xì)胞并計(jì)數(shù) 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 7 實(shí)驗(yàn)思考 1 在吞噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)細(xì)菌時(shí) 如何區(qū)別吞噬的細(xì)菌和粘附在吞噬細(xì)胞表面的細(xì)菌 2 簡(jiǎn)述機(jī)體非特異性免疫的概念及特點(diǎn) 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 8 凝集反應(yīng) 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1 了解凝集反應(yīng)的原理 基本類(lèi)型及其臨床意義 2 掌握玻片凝集實(shí)驗(yàn) 間接凝集實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果分析 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 9 概述 在一定濃度的電解質(zhì)溶液中 顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后 出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集塊 稱(chēng)為凝集反應(yīng) 凝集反應(yīng)是一種定性的檢測(cè)方法 也可以進(jìn)行半定量檢測(cè) 凝集反應(yīng)可分為直接凝集反應(yīng)和間接凝集反應(yīng) 由于凝集反應(yīng)方法簡(jiǎn)便 目前在臨床檢驗(yàn)中仍被廣泛應(yīng)用 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 10 一 直接凝集反應(yīng)細(xì)菌 細(xì)胞等顆粒性抗原 在適當(dāng)電解質(zhì)參與下可直接與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)凝集 稱(chēng)為直接凝集反應(yīng) 常用的凝集試驗(yàn)有玻片法和試管法兩種 玻片凝集試驗(yàn) ABO血型鑒定玻片凝集試驗(yàn)為定性試驗(yàn) 一般用已知抗體作為診斷血清 與受檢顆?？乖?如菌液或紅細(xì)胞抗原各加一滴在玻片上 混勻 數(shù)分鐘后即可用肉眼觀察凝集結(jié)果 出現(xiàn)凝集顆粒的為陽(yáng)性 此法簡(jiǎn)便 快速 適用于從病人標(biāo)本中分離得到的菌種的診斷或分型 也可用于紅細(xì)胞ABO血型的鑒定 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 11 實(shí)驗(yàn)原理 人類(lèi)ABO血型抗原主要有A和B兩種 根據(jù)紅細(xì)胞表面這兩種抗原的有無(wú)可把血型分為四種 據(jù)此 將抗A和抗B抗體分別與待測(cè)紅細(xì)胞混合 抗A或 和 抗B抗體與紅細(xì)胞表面上的相應(yīng)抗原結(jié)合而引起紅細(xì)胞凝集 據(jù)其凝集情況便可判定出受試者的血型 ABO血型的劃分 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 12 實(shí)驗(yàn)材料 1 ABO血型鑒定試劑盒內(nèi)含抗A分型試劑和抗B分型試劑各1支 2 一次性采血針1枚 潔凈玻片2塊 75 酒精 滅菌棉簽 3 84消毒液 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 13 3 用酒精棉簽消毒被檢者手指尖端 以采血針刺破皮膚 稍加擠壓 使血液流出 用另一載玻片一端取適量血液加入抗抗A分型試劑 并混勻 用另一端再取適量血液加入抗抗B分型試劑 并混勻 用干棉簽止血 4 觀察紅細(xì)胞有無(wú)凝集發(fā)生 如有凝集 可見(jiàn)紅細(xì)胞凝集成塊 無(wú)凝集 紅細(xì)胞呈均勻分散 判定結(jié)果后把玻片放入消毒液中 實(shí)驗(yàn)方法 1 取潔凈載玻片1塊 并標(biāo)記 如圖 2 將抗A B分型試劑分別加1滴于標(biāo)記有A B的玻片兩側(cè) 抗A 抗B 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 14 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 記錄受檢者紅細(xì)胞凝集情況 根據(jù)ABO血型鑒定表 下表 判斷受檢者的血型 ABO血型鑒定表 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 15 二 間接凝集反應(yīng)將可溶性抗原或抗體先吸附于適當(dāng)大小的顆粒性載體表面 這種載體與免疫無(wú)關(guān) 然后與相應(yīng)抗體或抗原結(jié)合 在適量的電解質(zhì)存在下 出現(xiàn)特異性凝集現(xiàn)象 稱(chēng)為間接凝集反應(yīng) 根據(jù)載體的不同可將間接凝集反應(yīng)分為 間接血細(xì)胞凝集試驗(yàn) 間接乳膠凝集試驗(yàn) 及間接乳膠凝集抑制試驗(yàn) 和金黃色葡萄球菌協(xié)同凝集試驗(yàn)等 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 16 間接凝集抑制試驗(yàn) 妊娠試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)原理 可溶性抗原致敏的乳膠顆粒與相應(yīng)抗體作用可使乳膠顆粒凝集 此為間接乳膠凝集試驗(yàn) 若使抗體先與可溶性抗原作用 再加入該抗原致敏的乳膠顆粒 則乳膠凝集被抑制 此為間接乳膠凝集抑制試驗(yàn) 孕婦尿中絨毛膜促性腺激素 HCG 含量明顯增高 HCG與抗HCG抗體先作用后 再加入HCG致敏的乳膠顆粒 不出現(xiàn)凝集反應(yīng) 此為妊娠試驗(yàn)陽(yáng)性 非孕婦尿中HCG含量不足以消耗掉抗HCG抗體 抗體與后加入的HCG致敏乳膠結(jié)合呈現(xiàn)凝集現(xiàn)象 則妊娠試驗(yàn)陰性 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 17 實(shí)驗(yàn)材料 1 妊娠診斷試劑盒 內(nèi)含抗血清 抗HCG 乳膠抗原 HCG致敏 各一支2 待檢尿 孕婦尿 正常尿 3 有格玻片和毛細(xì)吸管等 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 18 實(shí)驗(yàn)方法 1 在玻片的第1 第2和第3格內(nèi)分別加1滴正常尿 待檢尿及孕婦尿 2 每格內(nèi)加入妊娠診斷試劑抗血清1滴 輕輕搖動(dòng)1 2min使其充分混勻 3 每格加入乳膠抗原1滴 輕輕搖動(dòng)玻片3 5min后觀察結(jié)果 記錄各標(biāo)本有無(wú)凝集現(xiàn)象 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 19 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 孕婦尿格呈均勻渾濁乳狀液 無(wú)凝集 妊娠試驗(yàn)陽(yáng)性 正常尿格出現(xiàn)白色細(xì)小凝集物 隨時(shí)間延長(zhǎng)凝集物變成小塊狀 妊娠試驗(yàn)陰性 待檢尿若為乳狀液 妊娠試驗(yàn)陽(yáng)性 若出現(xiàn)凝集 則妊娠試驗(yàn)陰性 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 20 注意事項(xiàng) 1 試驗(yàn)所用診斷試劑用前應(yīng)充分搖勻 而且應(yīng)在有效期內(nèi)使用 2 加樣用的滴管及混勻用的牙簽不能共用 3 加樣不宜太多 玻片應(yīng)始終保持水平 以防兩格之反應(yīng)液相混 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 21 實(shí)驗(yàn)思考 1 記錄血型鑒定試驗(yàn) 乳膠妊娠診斷試驗(yàn)的材料 方法及結(jié)果判定 可用圖示或表格方式表示 2 直接凝集試驗(yàn)與間接凝集試驗(yàn)有何不同 3 在各凝集試驗(yàn)中都設(shè)有相應(yīng)對(duì)照 有何意義 若對(duì)照出現(xiàn)異常如何分析及解決 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 22 沉淀反應(yīng) 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1 掌握對(duì)流免疫電泳的基本原理 方法 2 熟悉瓊脂單向擴(kuò)散 雙向擴(kuò)散的基本原理 方法 結(jié)果分析及臨床用途 3 了解火箭免疫電泳的基本原理 方法 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 23 概述 可溶性抗原如血清 毒素 細(xì)菌浸出液等與相應(yīng)抗體結(jié)合 當(dāng)兩者比例合適 并有適量電解質(zhì)存在時(shí) 形成肉眼可見(jiàn)的沉淀物或沉淀線(xiàn) 稱(chēng)為沉淀反應(yīng) 沉淀反應(yīng)是臨床上最常用 最基本的方法之一 它的種類(lèi)較多 可分為瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 免疫電泳試驗(yàn) 環(huán)狀沉淀試驗(yàn)及絮狀沉淀試驗(yàn)等 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 24 一 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)利用可溶性抗原與相應(yīng)抗體在半固體瓊脂內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)散 當(dāng)兩者比例合適時(shí) 就出現(xiàn)白色沉淀線(xiàn) 為陽(yáng)性反應(yīng) 本試驗(yàn)可在試管內(nèi) 平皿中以及玻片上的瓊脂內(nèi)進(jìn)行操作 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)可分為單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 一 單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 示教 二 雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn) 示教 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 25 二 對(duì)流免疫電泳 實(shí)驗(yàn)原理 帶電的膠體顆?？稍陔妶?chǎng)中移動(dòng) 移動(dòng)方向與膠體顆粒所帶電荷有關(guān) 多數(shù)蛋白質(zhì)抗原在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷 在電泳時(shí)從負(fù)極向正極移動(dòng) 抗體屬球蛋白 在堿性緩沖液只帶微弱的負(fù)電荷 而且相對(duì)分子質(zhì)量較大 電泳力較小 在瓊脂電滲力作用下反而由正極向負(fù)極移動(dòng) 這樣就使抗原和抗體定向?qū)α?在兩孔間相遇時(shí)發(fā)生反應(yīng) 并在比例合適處形成肉眼可見(jiàn)的白色沉淀線(xiàn) 這種將雙向瓊脂擴(kuò)散和電泳技術(shù)結(jié)合在一起的方法稱(chēng)為對(duì)流免疫電泳 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 26 實(shí)驗(yàn)材料 1 電泳緩沖液 pH8 6巴比妥 鹽酸緩沖液 2 抗體 抗AFP 3 抗原 AFP陽(yáng)性血清 待檢病人血清 4 1 瓊脂用pH8 6巴比妥 鹽酸緩沖液配制 冰箱保存?zhèn)溆?5 電泳儀 電泳槽 載玻片 打孔器 10ml吸管 移液器 移液頭 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 27 實(shí)驗(yàn)方法 1 制板2 打孔3 加樣將抗原加入瓊脂板上有標(biāo)記孔側(cè)的小孔中 抗體加入另一側(cè)小孔中 以加滿(mǎn)為度 不可溢出孔外 如圖示 4 電泳將加好樣品的瓊脂板置電泳槽上 抗原側(cè)置陰極端 抗體孔側(cè)置陽(yáng)極端 搭好橋后 接通電源 控制電壓6 10V cm板長(zhǎng) 電泳約30 60min 5 關(guān)閉電源 取出瓊脂板 觀察結(jié)果 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 28 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 將玻片對(duì)著強(qiáng)光源 先觀察AFP陽(yáng)性血清孔與抗體孔之間的白色沉淀線(xiàn) 然后再觀察待檢血清孔與抗體孔之間是否也有沉淀線(xiàn)出現(xiàn) 如有沉淀線(xiàn) 則表示AFP試驗(yàn)陽(yáng)性 否則AFP試驗(yàn)為陰性 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 29 注意事項(xiàng) 1 電泳時(shí)電流不宜過(guò)大 以免蛋白變性 2 抗原和抗體的電極方向不能搞錯(cuò) 3 抗原和抗體的濃度要適當(dāng) 抗原太濃或太稀都不易出現(xiàn)沉淀線(xiàn) 4 電泳所需時(shí)間與孔間距離有關(guān) 距離越大 電泳時(shí)間越長(zhǎng) 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 30 實(shí)驗(yàn)思考 1 單向擴(kuò)散與火箭電泳 雙向擴(kuò)散與對(duì)流免疫電流比較各有何特點(diǎn) 2 對(duì)流免疫電泳中 抗原為何放陰極端 抗體為何放陽(yáng)極端 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 31 外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1 熟悉免疫細(xì)胞分離的常用方法 2 掌握外周血單個(gè)核細(xì)胞分離方法的原理 操作規(guī)程 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 32 實(shí)驗(yàn)原理 人外周血單個(gè)核細(xì)胞 peripheralbloodmononuclearcell PBMC 包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞 單個(gè)核細(xì)胞的體積 形態(tài)和比重與外周血其他細(xì)胞不同 因此利用一種介于1 075 1 090之間而近于等滲的聚蔗糖 泛影葡胺 ficoll hypaque 混合分離液作密度梯度離心 離心后不同比重的血細(xì)胞在分離液中呈梯度分布 從而分離出PBMC 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 33 實(shí)驗(yàn)材料 1 肝素溶液用生理鹽水將肝素配成125 250U ml的溶液 置4 下保存?zhèn)溆?2 淋巴細(xì)胞分層液市售或自配 20 時(shí)密度應(yīng)為 1 077 0 001 g L 3 Hanks平衡鹽溶液 HBSS 或磷酸鹽緩沖液 PBS pH7 2 7 4 4 完全RPMI 1640培養(yǎng)液 5 15ml或50ml錐底離心管 6 水平離心機(jī) 顯微鏡 7 玻璃吸管 滴管 細(xì)胞計(jì)數(shù)板等 8 2 臺(tái)盼藍(lán)染液 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 34 實(shí)驗(yàn)方法 1 采集靜脈血若干毫升 隨需要而定 注入盛有肝素的無(wú)菌小瓶中 每ml全血加0 1ml肝素溶液 加蓋后立即輕輕搖勻 使血液抗凝 2 用吸管加入等體積的室溫HBSS或PBS 使血液等倍稀釋 此步驟亦可省去 3 吸取淋巴細(xì)胞分層液 每10ml稀釋血加5m1分層液 置于15m1或50m1離心管中 然后將離心管傾斜45 角 將稀釋血液在距分層液界面上1cm處沿試管壁緩慢加至分層液上面 應(yīng)注意保持兩界面清晰 勿使血液混入分層液內(nèi) 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 35 4 將離心管置水平式離心機(jī)內(nèi) 在18 20 下 以2000r min離心30min 離心后 管內(nèi)分層如下圖所示 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 36 5 用毛細(xì)吸管輕輕插入灰白色層 沿管壁輕輕吸出該層的單個(gè)核細(xì)胞 盛入另一支離心管中 6 將所得到的PBMC懸液用5倍體積的HBSS或RPMI l640洗滌2次 依次以2000r min 1500r min在室溫 18 25 下離心10min 棄上清 7 用完全RPMI 1640定容細(xì)胞 計(jì)數(shù)細(xì)胞后再調(diào)整細(xì)胞至所需濃度 8 用臺(tái)盼藍(lán)染液檢查所分離細(xì)胞的活性 取2滴細(xì)胞懸液加1滴2 臺(tái)盼藍(lán)染液 5 10min后取樣作濕片高倍鏡檢 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 37 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 臺(tái)盼藍(lán)染液檢查活細(xì)胞不著色 死細(xì)胞染成藍(lán)色 計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞 計(jì)算活細(xì)胞百分率 一般活性應(yīng)在95 以上 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 38 注意事項(xiàng) 1 與血液樣品接觸時(shí)應(yīng)注意安全防護(hù) 避免血源性傳染病傳染 2 操作應(yīng)輕柔 細(xì)胞懸液應(yīng)充分混勻 避免損傷細(xì)胞活性及細(xì)胞丟失 3 細(xì)胞分層液在室溫下應(yīng)為 l 077 0 001 g L 應(yīng)避光4 下保存 取出后逐漸升至室溫后混勻 方可使用 使用中應(yīng)避免細(xì)菌污染 4 稀釋血液可降低紅細(xì)胞的凝集 提高淋巴細(xì)胞收獲量 但如果要保留血漿成分作其他實(shí)驗(yàn)用時(shí) 則不能稀釋血液 以免影響血漿成分 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 39 免疫系統(tǒng)組分的分離及活性檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1 掌握免疫系統(tǒng)組分中胸腺 脾組織結(jié)構(gòu)及淋巴細(xì)胞的功能 2 熟悉淋巴細(xì)胞分離方法 3 建立對(duì)免疫學(xué)的整體概念 加深對(duì)免疫系統(tǒng)組成和功能及重要性的理解 提高學(xué)習(xí)興趣及主動(dòng)性 4 培養(yǎng)學(xué)生在實(shí)際工作中動(dòng)手 動(dòng)腦 觀察和分析與解決問(wèn)題的能力 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 40 一 小鼠胸腺 脾摘除術(shù) 實(shí)驗(yàn)原理 小鼠的胸腺和脾是研究T細(xì)胞和B細(xì)胞特性與功能最主要的材料來(lái)源 觀察其組織結(jié)構(gòu) 細(xì)胞數(shù)目及活性等 可進(jìn)一步了解該機(jī)體的免疫狀況 是目前探討免疫學(xué)理論及與其有關(guān)疾病的最好模型之一 故摘除胸腺和脾是進(jìn)行研究的前提 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 41 實(shí)驗(yàn)材料 1 昆明種小鼠20 24g 2 75 酒精 無(wú)菌棉簽 3 小手術(shù)臺(tái) 大頭針 眼科鑷子 剪子 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 42 實(shí)驗(yàn)方法 1 取小鼠一只以眼球采血 抗凝備用 處死 2 小鼠用大頭針固定在小手術(shù)臺(tái)上 位置擺正 3 用75 的酒精消毒小鼠皮膚 4 打開(kāi)腹腔及分離胸骨后軟組織 5 用眼科剪從腹部向上沿正中線(xiàn)剪開(kāi)胸骨到頸部 6 暴露胸腺后輕輕剝離兩葉胸腺 7 在上腹部剝離脾 剪除結(jié)締組織被膜 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 43 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 觀察胸腺 脾組織結(jié)構(gòu)及其是否完整 有時(shí)間可在電子天秤稱(chēng)重 注意事項(xiàng) 1 剝離胸腺時(shí)要特別小心 以保證兩葉完整性 2 剝離胸腺 脾時(shí)要完全去掉其他組織 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 44 二 小鼠淋巴細(xì)胞分離及活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)原理 材料 方法及結(jié)果略 與前述外周血單個(gè)核細(xì)胞分離基本相同 不同之處 1 小鼠淋巴細(xì)胞的密度為1 098g ml 故分層液的密度不同 2 取胸腺 脾經(jīng)200目鋼絲網(wǎng)過(guò)篩的細(xì)胞懸液 用分離層液分離淋巴細(xì)胞 3 取眼球血液用分層分離淋巴細(xì)胞 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 45 實(shí)驗(yàn)思考 1 為什么取胸腺和脾制備淋巴細(xì)胞 可了解機(jī)體的免疫功能 2 如何理解機(jī)體免疫系統(tǒng)各組成部分功能正常的重要性 3 分離淋巴細(xì)胞的意義何在 4 為進(jìn)一步了解機(jī)體免疫功能還需進(jìn)行哪些檢測(cè) 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 46 免疫酶技術(shù) 免疫酶技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶的高效催化作用有機(jī)結(jié)合的一種方法 它以酶作為標(biāo)記物 與抗體 或抗原 聯(lián)結(jié) 與相應(yīng)的抗原 或抗體 作用后 通過(guò)底物的顏色反應(yīng)作抗原抗體的定性和定量 亦可用于組織中抗原或抗體的定位研究 即酶免疫組織化學(xué)技術(shù) 目前應(yīng)用最多的免疫酶技術(shù)是酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) ELISA 它是將可溶性抗原 或抗體 吸附于固相載體上 加入酶標(biāo)抗體 或抗原 與吸附在載體上的抗原 或抗體 結(jié)合 形成酶標(biāo)記復(fù)合物 再加入酶底物時(shí) 即可顯色 顏色反應(yīng)的深淺與相應(yīng)的抗體或抗原量相關(guān) 常用的酶有辣根過(guò)氧化物酶 HRP 和堿性磷酸酶 AP 相應(yīng)的底物分別是鄰苯二胺 OPD 和對(duì)硝基苯磷酸鹽 實(shí)驗(yàn)方法有間接法 夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 47 一 ELISA夾心法檢測(cè)HBsAg 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1 熟悉ELISA的原理 夾心法 2 了解免疫標(biāo)記技術(shù)的原理 實(shí)驗(yàn)原理 采用多克隆抗 HBS包被反應(yīng)板 加入待測(cè)標(biāo)本 同時(shí)加入單克隆抗 HBs HRP 如待測(cè)標(biāo)本中含有HBsAg時(shí)就與包被抗 HBs 抗 HBs HRP結(jié)合形成復(fù)合物 加入TMB底物產(chǎn)生顯色反應(yīng) 反之就無(wú)顯色反應(yīng) 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 48 實(shí)驗(yàn)材料 1 乙肝病毒HBsAg酶聯(lián)免疫診斷試劑盒 由廠商供應(yīng) 預(yù)包被微孔條 用純化的抗 HBs包被 酶聯(lián)試劑 用HRP標(biāo)記的抗HBs HBsAg陽(yáng)性對(duì)照 HBsAg陰性對(duì)照 洗滌液 濃縮液 顯色劑A B 終止液 2mol LH2SO4 2 微量加樣器 混合振蕩器 酶標(biāo)測(cè)定儀 恒溫箱 吸水紙 蒸餾水等 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 49 實(shí)驗(yàn)方法 1 配液濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水25倍稀釋使用 2 編號(hào)將微孔條固定于支架 按序編號(hào) 3 加樣分別用加樣器加待檢血清和陰 陽(yáng)性對(duì)照50 1 1滴 于相應(yīng)孔中 設(shè)空白對(duì)照孔 加50 1洗滌液 4 加酶除空白對(duì)照外 每孔加酶聯(lián)試劑50 l 1滴 5 溫育振蕩混勻 置37 30min后取出 6 洗滌甩去孔內(nèi)液體 扣干 用洗滌液注滿(mǎn)各孔 靜置2s 甩干 重復(fù)5次后拍干 7 顯色每孔加顯色劑A B各50 l 1滴 振蕩混勻 37 暗置15min 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 50 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1 目測(cè)在白色背景下觀察各孔顯色情況 有明顯藍(lán)色者為陽(yáng)性 無(wú)色者為陰性 2 酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔加終止液50 l 1滴 混勻 用酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)測(cè)各孔A值 計(jì)算P N值 結(jié)果判斷 P N值 2 1者為陽(yáng)性 2 1者判為陰性 陰性對(duì)照孔A值小于0 05時(shí)以0 05計(jì) 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 51 注意事項(xiàng) 1 試劑盒應(yīng)于4 存放 在有效期內(nèi)使用 2 微孔條須密封防潮 從冷藏環(huán)境中取出時(shí) 應(yīng)在室溫中平衡至潮氣盡干后方可開(kāi)封啟用 余者及時(shí)封存 3 滴加試劑前應(yīng)將瓶搖勻 使液體混勻 滴加時(shí)瓶身應(yīng)保持垂直 以使滴量準(zhǔn)確 注意勿將試劑滴在孔壁上 4 洗滌時(shí)各孔均須加滿(mǎn) 防止孔口內(nèi)有游離酶未能洗凈 5 待測(cè)標(biāo)本不可用NaN3防腐 所有樣品都應(yīng)按傳染源處理 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 52 ELISA競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)抗 HBc 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1 熟悉ELISA的原理 方法 2 了解免疫標(biāo)記技術(shù)的原理 實(shí)驗(yàn)原理 采用基因工程重組HBcAg