實(shí)驗(yàn) __DNA的粗提取與鑒定

生物選修三 學(xué)案 編審教師：邢秀芝 班級(jí)： 姓名： 序號(hào)： 實(shí)驗(yàn) DNA的粗提取與鑒定教學(xué)目的1 初步掌握DNA粗提取和鑒定的方法。2 觀察提取出來(lái)的DNA物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)原理1 DNA在NaCl溶液中的溶解度是隨NaCl的濃度變化而改變的。DNA在014mol/L的NaCl溶液中的溶解度最低，據(jù)此可使DNA充分溶解而使雜質(zhì)沉淀或DNA沉淀而雜質(zhì)溶解。2 DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中某些物質(zhì)可以溶于酒精溶液，據(jù)此可提取雜質(zhì)較少的DNA。3 DNA對(duì)蛋白酶、高溫和洗滌劑（可以溶解細(xì)胞的細(xì)胞膜，除去脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，而對(duì)DNA沒(méi)有影響）都具有較好的耐性。4 DNA二苯胺藍(lán)色（用于DNA的鑒定）實(shí)驗(yàn)材料： 雞血細(xì)胞液（5-10ml），體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精溶液（冷卻），蒸餾水，質(zhì)量濃度為0.1g/ml的檸檬酸鈉溶液(抗凝劑)，物質(zhì)的量濃度分別為2mol/l和0.015mol/l的氯化鈉溶液，二苯胺試劑實(shí)驗(yàn)步驟1材料制備0.1g/ml檸檬酸鈉100ml 置于500ml燒杯內(nèi)玻璃棒攪拌1000r/min離心2min吸去上清液即得雞血細(xì)胞液（也可將上述燒杯置于冰箱中，靜置一天使雞血細(xì)胞自行沉淀）活雞血180ml 思考為什么要除去血液中的上清液？2方法步驟 取血細(xì)胞液5-10ml20ml蒸餾水，玻璃棒沿一個(gè)方向快速攪拌，使血細(xì)胞加速破裂，紗布過(guò)濾，濾液中含DNA和其他核物質(zhì)，如蛋白質(zhì)（1）提取雞血細(xì)胞的細(xì)胞核物質(zhì) 原理：血細(xì)胞吸水脹破，玻璃棒快速攪拌機(jī)械加速血細(xì)胞破裂（2）溶解核內(nèi)DNA：濾液2mol/LNaCl溶液40ml，玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌（3）析出含DNA的粘稠物：向上述溶液中緩緩加入蒸餾水，并輕輕地沿一個(gè)方向攪拌，出現(xiàn)絲狀物，當(dāng)絲狀物不再增加時(shí)，停止加水（此時(shí)NaCl溶液相當(dāng)于稀釋到014mol/L）（4）濾取含DNA的粘稠物：用多層紗布過(guò)濾，含DNA的粘稠物留在紗布上（5）DNA粘稠物再溶解： 在50ml的燒杯中注入20ml 2mol/L的NaCl溶液，緩慢攪拌3 min使上述粘稠物盡量多的溶解在溶液中。 （6）過(guò)濾含DNA的2mol/LNaCl溶液：用2層紗布過(guò)濾，濾液中含DNA（7）提取含雜質(zhì)較少的DNA：上述溶液冷卻的95%的酒精50ml，緩慢攪拌，出現(xiàn)乳白色絲狀物，用玻璃棒將絲裝物卷起。（8）DNA鑒定：【思考】1.上述過(guò)程中兩次加入蒸餾水，兩次加入的作用一樣嗎？為什么？ 2.用紗布過(guò)濾了幾次？每次的目的是什么？（你要保留濾液還是紗布上的物質(zhì)）3.有幾個(gè)步驟中用到了攪拌？每一次的目的是什么？4. DNA的直徑約為2nm，實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的絲狀物的粗細(xì)是否就表示一個(gè)DNA分子直徑的大小？【實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵】 本實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵是獲取較多、較純凈的DNA，因此應(yīng)注意：1充分?jǐn)嚢桦u血細(xì)胞液。DNA存在于雞血細(xì)胞核中。將雞血細(xì)胞與蒸餾水混合以后，應(yīng)用玻璃棒沿一個(gè)方向快速攪拌，使血細(xì)胞加速破裂，并釋放出DNA2沉淀DNA必須用冷酒精。實(shí)驗(yàn)前必須準(zhǔn)備好大量95%的酒精，并在冰箱中（5以下）至少存放24小時(shí)。3正確攪拌含有懸浮物的溶液。在第（3）、（5）步驟，玻璃棒不要直插燒杯底部，且攪拌要輕緩，以便獲得較完整的DNA分子。在步驟（7），要將玻璃棒插入燒杯溶液中間，用手緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)5-10min?！狙a(bǔ)充】.也可使用菜花或洋蔥做實(shí)驗(yàn)材料，只不過(guò)實(shí)驗(yàn)成功率較低，實(shí)驗(yàn)效果與研磨液關(guān)系密切。（1）取新鮮植物組織（菜花）放置于冰箱中冷卻12天（2）取30克植物組織,切碎,置于研體中,倒入10ml研磨液,充分研磨10分鐘（3）將研磨液置于離心管中，在1000r/min的轉(zhuǎn)速下離心23分鐘，取上清夜置于冰箱中冷卻幾分鐘（4）取1倍體積的上清液，加入2倍體積的95%的冷酒精當(dāng)中，用玻棒輕輕攪拌，沉淀35分鐘后可見(jiàn)白色絮狀DNA纏繞于玻棒末端。（5）鑒定（略）【思考】用菜花代替雞血作為實(shí)驗(yàn)材料，其實(shí)驗(yàn)操作步驟完全相同嗎？為什么？2.在學(xué)生實(shí)際的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，在水浴后15分鐘內(nèi)出現(xiàn)明顯實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的比例往往非常低，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)整個(gè)班級(jí)沒(méi)有明顯鑒定結(jié)果的現(xiàn)象。根據(jù)實(shí)際操作的結(jié)果，很可能的原因是：在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)纏繞于玻璃棒末端的DNA的量過(guò)少的情況，如果溶解于氯化鈉溶液中的DNA的量過(guò)少的話，與過(guò)量的二苯胺試劑共熱時(shí)，出現(xiàn)的藍(lán)色會(huì)比較淺?！究偨Y(jié)】1.提取生物大分子的基本思路是：選用一定的物理或化學(xué)的方法分離具有不同物理化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。2.破碎細(xì)胞獲取DNA濾液的方法有：在雞血細(xì)胞溶液中加入蒸餾水，用玻璃棒攪拌，過(guò)濾后收集濾液；或者在切碎的洋蔥中加入洗滌劑和食鹽，進(jìn)行充分的攪拌和研磨，過(guò)濾后收集研磨液3.去除DNA濾液中雜質(zhì)的方法有：通過(guò)控制NaCI溶液的濃度去除雜質(zhì)；直接在含有DNA的濾液中加入嫩肉粉(含有木瓜蛋白酶，將蛋白質(zhì)水解)；或者將濾液放在60-75的恒溫水浴箱保溫一段時(shí)間（高溫使蛋白質(zhì)變性后與DNA分離）【鞏固練習(xí)】1在“DNA的粗提取與鑒定”的實(shí)驗(yàn)中分別使用2molL、014molL、2molL、0015molL的氯化鈉溶液，其作用分別是（ ）A溶解、析出、溶解、溶解 C溶解、溶解、析出、溶解B析出、溶解、析出、溶解 D溶解、析出、溶解、析出2下列圖示中能反映DNA溶解度與NaCI溶液濃度之間關(guān)系的是（ ）3在“DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)”中：（1）實(shí)驗(yàn)中兩次使用蒸餾水，第一次目的是 ，第二次目的是 。（2）說(shuō)明不同濃度的NaCl溶液的作用：2mol/L NaCl的作用 ；0.14mol/L NaCl的作用 ；0.015 mol/L NaCl的作用 ；（3）提純DNA的原理是 ，所用試劑為 。攪拌要 ，目的 。（4）能否用哺乳動(dòng)物血液代替？簡(jiǎn)述理由。 3.（1）使血細(xì)胞吸水破裂，溶解細(xì)胞核內(nèi)的DNA；降低NaCl溶液的濃度，降低DNA分子在NaCl溶液中的溶解度析出D