丙型肝炎病毒核酸定量檢測標準作業(yè)指導書

丙型肝炎病毒核酸定量檢測標準作業(yè)指導書1. 目的采用PCR技術、實時熒光探針技術，用于臨床血清或血漿標本中的丙型肝炎病毒核酸的定性檢測，適用于丙型肝炎病毒感染的輔助診斷。2. 范圍適用于丙型肝炎病毒核酸定量檢測。3. 職責3.1 操作人員：負責標本制備檢測、儀器操作、報告發(fā)送。3.2 專業(yè)組組長：負責本組耗材的請購，監(jiān)督本組標本檢測、儀器操作、報告發(fā)送、質(zhì)控管理等各方面工作。3.3 實驗室主任：負責監(jiān)督和指導實驗室各方面工作。4. 原理采用熒光PCR技術，以丙型肝炎病毒基因編碼區(qū)的高度保守區(qū)為靶區(qū)域，設計特異性引物及熒光探針，進行一步法RT-PCR擴增，并檢測熒光信號，儀器軟件系統(tǒng)自動繪制出實時擴增曲線，根據(jù)閾循環(huán)值(CT)實現(xiàn)對未知樣本的檢測。另外，本試劑盒帶有內(nèi)標物質(zhì)，用于對核酸提取的整個過程進行監(jiān)控，減少假陰性結果的出現(xiàn)。5. 樣本要求5.1 適用標本類型：血清5.2 標本采集用一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血2 ml，注入無菌的真空采血管中（未加抗凝劑），室溫（22-25）放置30-60min血標本可自發(fā)完全凝集析出血清，或直接使用水平離心機，1500rpm離心5min；吸取上層血清，轉移至1.5ml滅菌離心管。5.3 標本保存和運送所采集的標本可立即用于測試或長期保存于-70，也可保存于-20待測，保存期為3個月，標本應避免反復凍融。標本運送采用干冰（或者冰袋）保持低溫，運輸時間不應超過4天。5.4 拒收標本：拒絕重度溶血樣本、肝素抗凝的血漿。6. 儀器和試劑6.1 設備AB7500核酸擴增儀、恒溫金屬浴、生物安全柜、低溫離心機等。6.2 試劑生產(chǎn)廠家：中山大學達安基因股份有限公司產(chǎn)品標準批號：YZB/國 7271-2013最低檢出量：最低檢出量為500 IU/ml試劑各組分見表1：表1 試劑盒組分表組 分 名 稱規(guī) 格數(shù) 量核酸提取試劑RNA提取液A200 ul/管1RNA提取液B5 ml/瓶2DEPC H2O3 ml/瓶1PCR 檢測試劑HCV內(nèi)標溶液100 ul/管1HCV反應液A270 ul/管1HCV反應液B30 ul/管1質(zhì)控品陰性質(zhì)控品200 ul/管1HCV強陽性質(zhì)控品200 ul/管1HCV臨界陽性質(zhì)控品200 ul/管17. 操作步驟7.1試劑準備（試劑儲存和準備區(qū)）7.1.1 進入試劑準備區(qū)，打開通風設備，按照消毒清潔程序擦拭實驗臺面，并在檢驗流程記錄表上做相應記錄。7.1.2 PCR反應液配制7.1.2.1 取出HCV反應液A、HCV反應液AB，室溫溶化后振蕩混勻，8000rpm離心數(shù)秒后使用。7.1.2.2取出N個（N = 待測樣本數(shù)+ 4個HCV陽性定量標準品+HCV強陽性質(zhì)控品+HCV臨界陽性質(zhì)控品+陰性質(zhì)控品+空白孔）PCR反應管，HCV單人份擴增體系配制見表2：表2 PCR反應液配置表組分HCV反應液AHCV反應液B總體積用量/人份27 ul3 ul30 ul將各組分充分混勻，混合好后進行短時離心將管壁上的液體全部離心至管底，之后將30 ul擴增體系分裝到PCR反應管，反應液分裝時盡量避免產(chǎn)生氣泡，蓋緊管蓋，經(jīng)傳遞窗傳遞到標本制備區(qū)。7.1.3 75%乙醇配制：取2.25 ml的DEPC H2O，加入6.75ml的無水乙醇，振蕩混勻，配制成75%乙醇，蓋緊蓋子，經(jīng)傳遞窗傳遞到標本制備區(qū)。7.2 RNA提?。吮局苽鋮^(qū)）7.2.1 進入標本制備區(qū)，從傳遞窗中取出PCR反應管和75%乙醇，放入標本制備區(qū)冰箱冷藏。7.2.2 從冰箱取出待測樣本、陰性質(zhì)控品、強陽性質(zhì)控品、臨界陽性質(zhì)控品、RNA提取液A、RNA提取液B和內(nèi)標液，放入生物安全柜內(nèi)室溫溶解，備用。7.2.3 打開金屬浴，調(diào)節(jié)溫度為65，使儀器自動升溫。7.2.4用鑷子夾取n個1.5 ml滅菌離心管放于安全柜內(nèi)離心管架上。（n= 待測樣本數(shù)+ 3 = 待測樣本數(shù) +HCV強陽性質(zhì)控品+HCV臨界陽性質(zhì)控品+陰性質(zhì)控品）7.2.5 向離心管中各加入10 ul內(nèi)標溶液，再分別加入200ul樣本，800 ul RNA提取液B，蓋緊管蓋，振蕩混勻15s以充分混勻，室溫放置5min（每隔1min旋渦振蕩5s，使裂解更充分，處理結束后瞬時離心。）7.2.6 加入200 ul無水乙醇，蓋緊管蓋，漩渦振蕩混勻15s以充分混勻，瞬時離心，再加入20 ul RNA提取液A，漩渦振蕩混勻5s，室溫靜置1min。8000 rpm離心1min，小心吸棄上清。7.2.7 再加入200 ul RNA提取液B，蓋緊管蓋，充分混勻（用移液槍吹打），室溫下8000 rpm離心1min，小心吸棄上清。7.2.8 加預冷的75%乙醇400ul充分混勻，8000 rpm離心1min，小心吸棄上清。7.2.9加預冷的75%乙醇400ul充分混勻，8000 rpm離心1min，小心吸棄上清。7.2.10 打開管蓋，放入金屬浴，65干燥5 min，使液體揮發(fā)完全。7.2.11 溫育5min后，用鑷子從金屬浴中取出離心管，加入50 ul DEPC H2O，用移液槍吹打混勻，室溫靜置1min后，8000 rpm離心1min。離心管內(nèi)的上清液即為病毒核酸溶液，建議立即使用，如需保存，置于-70。7.2.13 取出已分裝好的PCR反應管，向對應編號的PCR管中加入處理好的的樣品（包括待測標本、陰性質(zhì)控品、強陽性質(zhì)控品、臨界陽性質(zhì)控品）上清液各20 ul，空白對照不加模板，蓋緊反應管。8000rpm離心數(shù)秒，經(jīng)傳遞窗移至擴增檢測區(qū)。（用移液槍小心吸取上清液，盡量不要碰到底層沉淀。）7.3 PCR擴增（擴增區(qū)）7.3.1 從傳遞窗中取出PCR反應管，放入儀器樣品槽內(nèi)。7.3.2 在“Set up”按對應順序設置空白管、陰性質(zhì)控品、陽性室內(nèi)質(zhì)控品、臨界陽性質(zhì)控品、陽性定量參考品及待測標本，并在“sample name”一欄中設置樣本名稱，探針檢測模式設置：Reporter Dye1：FAM，Quencher Dye1：none；Reporter Dye2：VIC，Quencher Dye2：none；Passive Reference：NONE。具體設置方法參考AB 7500核酸擴增儀標準作業(yè)指導書。7.3.3 打開“Run Method”窗口設置循環(huán)條件：50 15 min，1個循環(huán)；95 5min ，1個循環(huán)；94 15s 55 45 s（收集熒光）， 45個循環(huán)；7.3.4 保存文件，運行儀器。8. 結果分析8.1 反應結束后，操作人員可根據(jù)實際情況自行調(diào)節(jié)Baseline的Start值、End值以及Threshold值。Start值可以在3-15，End值可設在5-20。在Log圖譜窗口設置的Threshold的Value值，使閾值線位于擴增曲線指數(shù)期，調(diào)整陰性質(zhì)控品的擴增曲線平直或低于閾值線。點擊Analysis自動獲得分析結果，在Report界面查看結果，記錄樣本數(shù)值（C）。8.2 如果反應體系擴增曲線在FAM檢測通道無明顯對數(shù)增長期，且在VIC檢測通道有對數(shù)增長期，則判定樣品的HCV RNA陰性。8.3 如果反應體系擴增曲線在FAM、VIC檢測通道均有對數(shù)增長期且FAM檢測通道CT45；或者擴增曲線在FAM檢測通道有對數(shù)增長期且CT45 ，在VIC檢測通道無對數(shù)增長期，則判定樣品的HCV RNA陽性性。9. 質(zhì)量控制每次實驗均需檢測陰性質(zhì)控品、HCV 強陽性質(zhì)控品、HCV臨界陽性質(zhì)控品。質(zhì)控品結果滿足質(zhì)量控制要求時方可進行檢測結果的判斷。9.1 試劑盒自帶質(zhì)控（1）陰性質(zhì)控品：FAM檢測通道擴增曲線無明顯對數(shù)增長期，VIC檢測通道擴增曲線有明顯對數(shù)增長期。（2）HCV 陽性質(zhì)控品：FAM檢測通道擴增曲線有明顯對數(shù)增長期，且強陽性質(zhì)控品FAM檢測通道CT30，臨界陽性質(zhì)控品FAM檢測通道36。（3）陽性定量參考品：增長曲線呈S型曲線，且0.97r1。9.2 室內(nèi)質(zhì)控每次實驗應選擇適當?shù)腍CV RNA質(zhì)控品做室內(nèi)質(zhì)控。9.3 以上要求（9.1和9.2）需在同一次實驗中同時滿足，否則，本次試驗無效，需從新進行。10. 干擾因素10.1 環(huán)境中存在RNase，可降解RNA，導致實驗結果假陰性，因此實驗過程應戴手套，帽子，防止皮屑、毛發(fā)等的RNase，實驗用品需高壓滅菌后使用，盡量避免污染。 10.2 臨床標本中內(nèi)源性抑制物：血紅蛋白、免疫球蛋白、白細胞內(nèi)乳鐵蛋白、脂類、等都可抑制PCR反應，標本應避免溶血、脂血、黃疸等。10.3 外源性抑制物：肝素抗凝劑、纖維素和硝酸纖維素、手套上的滑石粉、標本容器上的抑制物等，標本應按采集要求采集，操作中應小心謹慎，標本容器及實驗用具應鑒定合格。10.4 標本的交叉污染：操作過程中應細心認真，防止交叉污染，盡量使用帶鑒定合格的濾芯吸頭，陰性對照品應與標本一起提取，以及時發(fā)現(xiàn)交叉污染。11. 生物參考區(qū)間： 1.0102 IU/ml1.0108 IU/ml12. 警示/危急值：HCV RNA檢測無警示/危急值。13. 異常結果處理如遇HCV RNA檢測結果與臨床診斷或資料，或與近期歷史檢測結果不相符合，應及時與臨床醫(yī)生聯(lián)系、溝通，查找原因并采取措施，于疑問報告發(fā)放處理記錄表中記錄處理過程。如需復查，需及時保存標本。14. 臨床意義HCV感染診斷的指標，指導臨床治療。15. 變異的潛在來源標本保存不當或反復凍融，都會影響檢測結果的準確。16. 注意事項16.1 實驗過程中必須穿專用工作服、戴手套、口罩、帽子、必要時戴防護眼罩，接觸標本后必須及時更換手套。16.2 陽性質(zhì)控品和檢測樣本均應視為具有傳染性物質(zhì)，應避免接觸到皮膚和粘膜。16.3 實驗過程必須嚴格分區(qū)操作，各區(qū)物品均為專用，不得交叉使用。16.4 樣品的處理操作應在生物安全柜內(nèi)進行。16.5所用檢測試劑使用前應完全解凍，瞬時離心后使用，應避免反復凍融。16.6 樣本核酸提取后，建議馬上進行下一步實驗，否則請保存于-20待用（24 h）。16.7 操作過程中應防止交叉污染，盡量使用鑒定合格的濾芯吸頭，陰性對照品應與標本一起提取。16.8 加樣時應使樣品完全落入反應液中，不應有樣品粘附于管壁上，盡快蓋緊管蓋。上機前注意檢查各反應管是否蓋緊，以免熒光物質(zhì)泄露污染儀器。16.9 標本制備區(qū)所用到的試管、吸頭等需打入盛有消毒劑的容器，并與廢物一起滅菌后方可丟棄。16.10 擴增完畢立即取出反應管，密封在專用塑料袋內(nèi)，丟棄于指定地點。16.11 實驗中用過的吸頭請直接打入盛有10%次氯酸鈉的廢物缸內(nèi)，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄。16.12 每次實驗均應有質(zhì)量控制。16.13 實驗完