微生物的生長與控制.ppt

1、第三節(jié) 微生物獨特合成途徑舉例,1 定義： N2 +6H 2NH3,生物固氮,固氮生物,Mg2+ATP,2 固氮生物的種類 (1)自生固氮菌：能獨立進行固氮的微生物 (2)共生固氮菌：與它種生物共生時才能固氮的微生物 (3)聯(lián)合固氮菌：必須生活在植物跟際、葉面或動物腸道等處才能固氮的微生物 從固氮生物在分類上高度分散來推斷，固氮作用應(yīng)是原始生物的基本代謝之一,3 固氮生物的生化機制 (1)固氮的必要條件 ATP供應(yīng) 還原力及其載體 固氮酶 還原底物N2 鎂離子 嚴(yán)格的厭氧微環(huán)境 (2)固氮酶,(3)固氮酶活力測定 定氮法 同位素法 乙炔法(1965年) HC CH H2C CH2 (4)固氮的

2、生化機制,固氮酶,H2,3 固氮菌中對固氮酶的保護 (1)自生固氮菌的保護 呼吸保護作用 構(gòu)象保護作用 (2)藍細(xì)菌固氮酶的保護 還原性異形胞 時空分隔、束狀群體、微氧環(huán)境等等 (3)根瘤菌的抗氧保護 豆血紅蛋白,微生物特有的結(jié)構(gòu)大分子： 細(xì)菌：肽聚糖、磷壁酸、脂多糖、各種莢膜成分等 真菌：葡聚糖、甘露聚糖、纖維素、幾丁質(zhì)等 肽聚糖：絕大多數(shù)原核微生物細(xì)胞壁所含有的獨特成分；在細(xì)菌的生命活動中有重要功能，尤其是許多重要抗生素如青霉素、頭孢霉素、萬古霉素、環(huán)絲氨酸（惡唑霉素）和桿菌肽等呈現(xiàn)其選擇毒力（selective toxicity）的物質(zhì)基礎(chǔ)。是在抗生素治療上有特別意義的物質(zhì)。,三、肽聚糖

3、的合成,合成特點：合成機制復(fù)雜，步驟多，且合成部位幾經(jīng)轉(zhuǎn)移；合成過程中須要有能夠轉(zhuǎn)運與控制肽聚糖結(jié)構(gòu)元件的載體（UDP和細(xì)菌萜醇）參與。 合成過程：依發(fā)生部位分成三個階段： 細(xì)胞質(zhì)階段：合成派克（Park）核苷酸 細(xì)胞膜階段：合成肽聚糖單體 細(xì)胞膜外階段：交聯(lián)作用形成肽聚糖,第一階段：,在細(xì)胞質(zhì)中合成N-乙酰胞壁酸五肽（“Park”核苷酸）。 這一階段起始于N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸，它是由葡萄糖經(jīng)一系列反應(yīng)生成的； 自N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸開始，以后的N-乙酰葡萄糖胺、 N-乙酰胞壁酸，以及胞壁酸五肽，都是與糖載體UDP結(jié)合的；,由葡萄糖合成N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸,“Park”核

4、苷酸的合成,在細(xì)胞膜上由N-乙酰胞壁酸五肽與N-乙酰葡萄糖胺合成肽聚糖單體雙糖肽亞單位。 這一階段中有一種稱為細(xì)菌萜醇(bactoprenol,Bcp)類脂載體參與，這是一種由11個類異戊烯單位組成的C55 類異戊烯醇，它 通過兩個磷酸基與N-乙酰胞壁酸相連，載著在細(xì)胞質(zhì)中形成的胞壁酸到細(xì)胞膜上，在那里與N-乙酰葡萄糖胺結(jié)合，并在L-Lys上接上五肽(Gly)5 ,形成雙糖亞單位。 這一階段的詳細(xì)步驟如圖所示。其中的反應(yīng)與分別為萬古霉素和桿菌肽所阻斷。,第二階段：,肽聚糖單體的合成,UDP UDP- G ,UDP UDP - M,桿菌肽,萬古霉素,5 甘氨酰-tRNA 5 tRNA,插入至膜外

5、肽 聚糖合成處,肽聚糖單體的合成細(xì)菌萜醇,細(xì)菌萜醇（bactoprenol）：又稱類脂載體；運載“Park”核苷酸進入細(xì)胞膜，連接N-乙酰葡糖胺和甘氨酸五肽“橋”，最后將肽聚糖單體送入細(xì)胞膜外的細(xì)胞壁生長點處。 結(jié)構(gòu)式： CH3CH3 CH3 CH3C=CHCH2(CH2C=CHCH2)9CH2C=CHCH2OH 功能：除肽聚糖合成外還參與微生物多種細(xì)胞外多糖和脂多糖的生物合成， 如：細(xì)菌的磷壁酸、脂多糖， 細(xì)菌和真菌的纖維素， 真菌的幾丁質(zhì)和甘露聚糖等。,已合成的雙糖肽插在細(xì)胞膜外的細(xì)胞壁生長點中，并交聯(lián)形成肽聚糖。 這一階段分兩步： 第一步：是多糖鏈的伸長雙糖肽先是插入細(xì)胞壁生長點上作為引

6、物的肽聚糖骨架（至少含68個肽聚糖單體分子）中，通過轉(zhuǎn)糖基作用（transglycosylation)使多糖鏈延伸一個雙糖單位； 第二步：通過轉(zhuǎn)肽酶的轉(zhuǎn)肽作用（transpeptitidation)使相鄰多糖鏈交聯(lián)轉(zhuǎn)肽時先是D-丙氨酰-D-丙氨酸間的肽鏈斷裂，釋放出一個D-丙氨酰殘基，然后倒數(shù)第二個D-丙氨酸的游離羧基與相鄰甘氨酸五肽的游離氨基間形成肽鍵而實現(xiàn)交聯(lián)。,第三階段：,肽聚糖的生物合成與某些抗生素的作用機制,一些抗生素能抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，但是它們的作用位點和作用機制是不同的。 -內(nèi)酰胺類抗生素（青霉素、頭孢霉素）： 是D-丙氨酰-D-丙氨酸的結(jié)構(gòu)類似物，兩者相互競爭轉(zhuǎn)肽酶的活性中

7、心。當(dāng)轉(zhuǎn)肽酶與青霉素結(jié)合后，雙糖肽間的肽橋無法交聯(lián)，這樣的肽聚糖就缺乏應(yīng)有的強度，結(jié)果形成細(xì)胞壁缺損的細(xì)胞，在不利的滲透壓環(huán)境中極易破裂而死亡。 桿菌肽： 能與十一異戊烯焦磷酸絡(luò)合，因此抑制焦磷酸酶的作用，這樣也就阻止了十一異戊烯磷酸糖基載體的再生，從而使細(xì)胞壁（肽聚糖）的合成受阻。,微生物次生代謝物是指某些微生物生長到穩(wěn)定期前后，以結(jié)構(gòu)簡單、代謝途徑明確、產(chǎn)量較大的初生代謝物作前體，通過復(fù)雜的次生代謝途徑所合成的各種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化學(xué)物。 與初生代謝物不同的是，次生代謝物往往具有分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜、代謝途徑獨特、在生長后期合成、產(chǎn)量較低、生理功能不很明確(尤其是抗生素)以及其合成一般受質(zhì)?？刂频忍攸c。

8、一般地說，形態(tài)構(gòu)造和生活史越復(fù)雜的微生物(如放線菌和絲狀真菌)，其次生代謝物的種類也就越多。,四、微生物次生代謝物的合成,微生物次生代謝物合成途徑主要有4條： 糖代謝延伸途徑，由糖類轉(zhuǎn)化、聚合產(chǎn)生的多糖類、糖苷類和核酸類化合物進一步轉(zhuǎn)化而形成核苷類、糖苷類和糖衍生物類抗生素； 莽草酸延伸途徑，由莽草酸分支途徑產(chǎn)生氯霉素等；,氨基酸延伸途徑，由各種氨基酸衍生、聚合形成多種含氨基酸的抗生素，如多肽類抗生素、-內(nèi)酰胺類抗生素、D-環(huán)絲氨酸和殺腺癌菌素等； 乙酸延伸途徑，又可分2條支路，其一是乙酸經(jīng)縮合后形成聚酮酐，進而合成大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、灰黃霉素類抗生素和黃曲霉毒素；另一分支是經(jīng)甲羥戊酸而合成

9、異戊二烯類，進一步合成重要的植物生長刺激素赤霉素或真菌毒素隱杯傘素等。,作業(yè),試述肽聚糖的生物合成過程,Chapter 6 Microbial Growth and Its Control 微生物的生長繁殖及其控制,第 一 節(jié),生長的定義及測定方法,微生物生長(Growth)：是指細(xì)胞物質(zhì)有規(guī)律地、不可逆增加的生物過程。 微生物繁殖(Reproduction)：是微生物生長到一定階段由于細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)制和重建導(dǎo)致產(chǎn)生新的生命個體，即引起生命個體數(shù)量增加的整個生物學(xué)過程。微生物生長一般指群體生長,一、測生長量,（一）直接法： 測體積法； 稱干重法 （二）間接法 1、比濁法 2、生理指標(biāo)法

10、,1.比濁法,原理是在一定范圍內(nèi)，菌懸液中的細(xì)胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌數(shù)越多，光密度越大。因此，借助于分光光度計，在一定波長下測定菌懸液的光密度，就可反應(yīng)出菌液的濃度。,特點：快速、簡便；但易受干擾。,1、比濁法,菌液濃度,吸光值（OD值）,2.生理指標(biāo)測定法,測含氮量法 蛋白質(zhì)總量=含氮量 6.25 細(xì)胞總量=蛋白質(zhì)總量/（50%80%（或65%）=蛋白總量1.54 測含碳量以及測磷、DNA、RNA、ATP、DAP（二氨基庚二酸）、幾丁質(zhì)等。 產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、耗氧、粘度和產(chǎn)熱等。,二、計繁殖數(shù),1、直接計數(shù)法 2、間接計數(shù)法,1、直接計數(shù)法：指用計數(shù)板在光學(xué)顯微鏡下直接觀察細(xì)胞

11、并進行計數(shù)的方法。,原理：將1cm20.1mm的薄層空間劃分為400小格，從中選取80或100小格，計數(shù)其中的細(xì)胞數(shù)目，換算成單位體積中的細(xì)胞數(shù)。 適用范圍：個體較大細(xì)胞或顆粒，如血球、酵母菌等。不適用于細(xì)菌等個體較小的細(xì)胞，因為（1）細(xì)菌細(xì)胞太小，不易沉降；（2）在油鏡下看不清網(wǎng)格線，超出油鏡工作距離。 特點：快速，準(zhǔn)確，對酵母菌可同時測定出芽率，或在菌懸液中加入少量美藍可以區(qū)分死活細(xì)胞。,血球計數(shù)板法,2.涂片染色法,應(yīng)用：可同時計數(shù)不同微生物的菌數(shù)，適 于土壤、牛奶中細(xì)菌計數(shù)。 方法：用鏡臺測微尺計算出視野面積；取 0.1ml菌液涂于1cm2面積上，計數(shù)后代 入公式： 每ml原菌液含菌數(shù)

12、 =視野中平均菌數(shù)涂布面積/視野面積100 稀釋倍數(shù),2、間接計數(shù)法,（1）平板菌落計數(shù)法 （2）膜過濾法,（1）平板菌落計數(shù)法,平板菌落計數(shù)法：澆注平板或涂布平板,平板菌落計數(shù)法,技術(shù)要求：樣品充分混勻，操作熟練快速（1520min完成操作），嚴(yán)格無菌操作； 注意事項：每一支吸管只能用于一個稀釋度，樣品混勻處理，傾注平板時的培養(yǎng)基溫度； 適用范圍：中溫、好氧和兼性厭氧、能在營養(yǎng)瓊脂上生長的微生物， 誤差：多次稀釋造成的誤差是主要來源，其次還有由于樣品內(nèi)菌體分布不均勻、以及不當(dāng)操作,A standard plate count (viable count) reflects the numbe

13、r of viable microbes and assumes that each bacterium grows into a single colony; plate counts are reported as number of colony-forming units (CFU) per ml (CFU/ml) or per g (CFU/g) of sample.,（2）薄膜過濾計數(shù)法,常用該法測定含菌量較少的空氣和水中的微生物數(shù)目。 將定量的樣品通過薄膜（硝化纖維素薄膜、醋酸纖維薄膜）過濾，菌體被阻留在濾膜上，取下濾膜進行培養(yǎng)，然后計算菌落數(shù)，可求出樣品中所含菌數(shù)。,膜過濾法,

14、第二節(jié)、微生物的生長規(guī)律,一、純培養(yǎng)技術(shù) 1、純培養(yǎng)的定義： 純培養(yǎng)(Pure culture)：微生物學(xué)中將在實驗室條件下從一個細(xì)胞或一種細(xì)胞群繁殖得到的后代稱為純培養(yǎng),2、獲得純培養(yǎng)的技術(shù),1) 稀釋平皿分離法 2) 平皿劃線分離法 3) 單細(xì)胞挑取法,1）pour plate method （稀釋倒平板法）,10-1,10-2,10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9,2)spread plate method（涂布平板法）,3）streak plate method（平板劃線分離法）,3.單細(xì)胞挑取法,接種針,解剖鏡,. . ,同步培養(yǎng)：是一種培養(yǎng)方法，它能

15、使群體中不同步的細(xì)胞轉(zhuǎn)變成能同時進行生長或分裂的群體細(xì)胞。 同步生長：以同步培養(yǎng)方法使群體細(xì)胞能處于同一生長階段，同時進行分裂的生長方式稱為同步生長。 同步細(xì)胞或同步培養(yǎng)物：通過同步培養(yǎng)方法獲得的細(xì)胞稱。 同步培養(yǎng)物常被用來研究在單個細(xì)胞上難以研究的生理與遺傳特性和作為工業(yè)發(fā)酵的種子，它一種理想的材料。,二、微生物的個體生長和同步生長,1、機械篩選方法 （1）離心方法 （2）過濾分離法 （3）硝酸纖維素濾膜法 2、環(huán)境條件控制技術(shù) （1）溫度 （2）培養(yǎng)基成分控制 （3）其他,（1）離心方法 （2）過濾分離法 （3）硝酸纖維素濾膜法,2、環(huán)境條件控制技術(shù) （1）溫度：通過適宜與不適宜溫度的交替

16、處理之后，通過培養(yǎng)可獲得同步細(xì)胞。 （2）培養(yǎng)基成分控制：將不同步的細(xì)菌在營養(yǎng)不足的條件下培養(yǎng)一段時間，然后轉(zhuǎn)移至營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，能獲得同步細(xì)胞。 （3）其他：光照與黑暗交替培養(yǎng)獲得光合細(xì)菌的同步細(xì)菌；加熱殺死芽孢桿菌獲得芽孢桿菌的同步細(xì)胞。 環(huán)境條件控制獲得同步細(xì)胞的機理不完全了解。這種處理可能是導(dǎo)致胞內(nèi)某些物質(zhì)合成，它合成和積累可導(dǎo)致細(xì)胞分裂，從而獲得同步細(xì)胞。,三、單細(xì)胞微生物的典型生長曲線,回憶： 一步生長曲線(one-step growth curve),這種用來測定噬菌體侵染和成熟病毒體釋放的時間間隔，并用以估計每個被侵染的細(xì)胞釋放出來的新的噬菌體粒子的數(shù)量的生長曲線，稱為

17、一步生長曲線。,潛伏期 隱晦期 胞內(nèi)積累期 裂解期 平穩(wěn)期,將少量單細(xì)胞純培 養(yǎng)接種到一恒定容 積的新鮮液體培養(yǎng) 基中，在適宜的條 件下培養(yǎng)，定時取 樣測定其細(xì)菌含量， 可以看到以下現(xiàn)象： 開始有一短暫時間， 細(xì)菌數(shù)量并不增加， 隨之細(xì)菌數(shù)目增加 很快，既而細(xì)菌數(shù)又趨穩(wěn)定，最后逐漸下降。如果以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，以細(xì)菌數(shù)目的對數(shù)或生長速度為縱坐標(biāo)作圖，可以得到一條曲線，稱為繁殖曲線，通常又稱為生長曲線。,（一） 延滯期停滯期、調(diào)整期、適應(yīng)期（Lag phase） 少量細(xì)菌接種到新鮮培養(yǎng)基后，一般不立即進行繁殖，生長速度近于零。因此在開始一段時間，細(xì)菌數(shù)幾乎保持不變，甚至稍有減少。這段時間被稱為延

18、遲期，又稱為遲緩期、調(diào)整期或滯留適應(yīng)期。,1、延滯期出現(xiàn)原因 2、延滯的特點 3、影響延滯期限長短的因素 4、縮短延滯期的意義及方法,A、微生物接種到一個新的環(huán)境，暫缺乏足夠的能量和必需的生長因子； B、“種子”老化（即處于非對數(shù)生長期）或未充分活化。 C、接種時造成的損傷,1、延滯期出現(xiàn)原因,2、延滯期的特點,特點： 1）生長速率常數(shù)為零；細(xì)菌數(shù)量不增加或增加很少。 2）細(xì)胞形態(tài)變大或增長，許多桿菌可長成絲狀。 3）細(xì)胞內(nèi)的RNA尤其是rRNA含量增高，原生質(zhì)呈嗜堿性。 3）合成代謝十分活躍，核糖體、酶類和ATP的合成加速，易產(chǎn)生各種誘導(dǎo)酶。 4） 對外界不良條件如NaCl溶液、溫度和抗生素

19、等理、理化因素反應(yīng)敏感。,3、影響延滯期時間長短的因素,B、接種齡:以對數(shù)期接種齡的種子接種，延滯期短,C、接種量:發(fā)酵工業(yè)上通常采用種子：發(fā)酵培養(yǎng)基=1：10,D、培養(yǎng)基成分:一般要求發(fā)酵培養(yǎng)基的成分或種子培養(yǎng)基的成分盡量接近，且應(yīng)適當(dāng)豐富些。,A、菌種特性,4、縮短延滯期的意義及方法 （1）意義： 可以縮短生產(chǎn)周期，提高設(shè)備利用率 （2）縮短延滯期的方法 A、通過遺傳學(xué)方法改變種的遺傳特性使遲緩期 縮短 B、接種對數(shù)生長期的菌種，采用最適菌齡 C、盡量使接種前后所使用的培養(yǎng)基組成不要相 差太大 D、加大接種量,（二） Exponential phase （指數(shù)期） 對數(shù)期又稱指數(shù)期。這一階段突出特點是細(xì)菌數(shù)以幾何級數(shù)增加，代時穩(wěn)定，細(xì)菌數(shù)目的增加與原生質(zhì)總量的增加，與菌液混濁度的增加均呈正相關(guān)性。,1、特點 1）生長速率常數(shù)R最大代時最短，生長速度最快； 2）細(xì)胞穩(wěn)定（平衡）生長：細(xì)胞內(nèi)各種物質(zhì)按比例生長，菌體成分均勻； 3）酶系活躍，代謝旺盛 。,（2）三個重要參數(shù)： 繁殖代數(shù)，生長速率常數(shù)，代時 A 繁殖代數(shù)（n） X2=X12n 取對數(shù)表示,2,2,生長速率常數(shù)：單位時間內(nèi)繁殖的代數(shù),代時（G）：細(xì)胞每分裂一次所需的 時間,(三）Sta