8.PCT主要生產工藝及反應體系的研究資料

1、廣州鴻琪光學儀器科技有限公司.廣州鴻琪光學儀器科技有限公司降鈣素原（PCT）檢測試劑盒（膠體金法）主要生產工藝及反應體系的研究資料膠體金免疫檢測技術是目前臨床快速檢測的常用方法之一。廣州鴻琪光學科技有限公司結合國內外對降鈣素原檢測試劑盒在臨床診斷中的應用情況開發(fā)了降鈣素原（PCT）定量檢測試劑盒（膠體金法），結合鴻琪公司開發(fā)的免疫膠體金讀數(shù)儀對血清、血漿和全血標本中的降鈣素原（PCT）進行定量檢測。一、 反應原理描述人降鈣素原（PCT）檢測試劑（膠體金法）是一種不需要任何儀器設備的全血/血清/血漿檢測法，采用膠體金免疫層析技術，試劑盒含有被預先包被在玻璃纖維上的膠體金標記的抗PCT單克隆抗體(

2、mAb1)以及固定于膜上測試區(qū)（T）的抗PCT單克隆抗體(mAb2)和質控區(qū)（C）的相應抗體。測試時，將標本滴入試劑盒加樣孔（S）內, 標本中如含有人降鈣素原（PCT），則標本中的人降鈣素原（PCT）分別與預先包被在玻璃纖維上的抗PCT單克隆抗體(mAb1)結合，結合物在毛細效應下向上層析，隨后會被固定在膜上相應測試區(qū)的抗PCT單克隆抗體(mAb2)結合捕獲，從而在相應測試區(qū)出現(xiàn)紫紅色條帶。如是陰性標本，則相應測試區(qū)內將沒有紫紅色條帶出現(xiàn)。無論標本中是否存在人降鈣素原（PCT），一條紫紅色條帶都會出現(xiàn)在質控區(qū)（C）內。質控區(qū)（C）內所顯現(xiàn)的紫紅色條帶是判定是否有足夠標本，層析過程是否正常的標準

3、，同時也作為試劑的內控標準。通過金標免疫分析儀檢測測試區(qū)（T）顯色深度，再經過保存在卡殼上二維碼上的定標曲線計算得到檢測結果。膠體金標記的基本原理是膠體金在弱堿環(huán)境下帶負電荷，可與蛋白質分子的正電荷基團形成牢固的結合，由于這種結合是靜電結合，所以不影響蛋白質的生物特性。膠體金標記所用的主要原輔料有：抗PCT單克隆抗體(mAb1)、氯金酸、檸檬酸三鈉，玻璃纖維。NC膜包被的基本原理是蛋白首先通過靜電作用和硝酸素纖維膜結合，然后靠H鍵和疏水作用維持長時間結合。NC膜包被所用的主要原輔料有：硝酸素纖維膜、抗PCT單克隆抗體(mAb2)和羊抗鼠IgG。二、主要生產工藝的各主要工序流程圖藍色工序在10萬

4、級潔凈區(qū)內進行，其他工序在普通生產區(qū)。領 料配包被用液體配標記用液體配包被溶液標記包 膜稀釋金標交聯(lián)溶液噴 金晾 干 干 燥No不合格品控制不合格品控制半成品檢驗半成品檢驗NOYesYes入 庫入 庫組 裝NO o放 行成品檢驗不合格品控制總 裝定 標Yes三、主要工序所用主要原輔料、具體步驟即每一步驟的具體實現(xiàn)方法該產品的生產工藝包括各種工作溶液的配置，膠體金標記物、包被抗原或抗體等濃度確定，膠體金標記物制備，檢測線及質控線的制備等步驟，并通過產品的半成品檢驗和成品檢驗兩個質控過程來保證其質量符合產品質量標準。（一）各種工作溶液的配置1 配標記用液體：膠體金制備：0.01%氯金酸（HAuCl

5、4），水溶液100ml加熱至沸騰，加入1%檸檬酸三鈉1ml，混勻，煮沸5分鐘，待膠體金溶液顏色由藍經紫變紅后，冷卻即可。2 配金標記物干燥基礎液包被緩沖液為10mM Tris-HCl，1.0%BSA, 0.01% NaN3，2%蔗糖。3 配包被用液體包被緩沖液為10mM Tris-HCl，2%蔗糖。4 配包被溶液對照線包被羊抗鼠IgG,包被濃度1.0mg/ml檢測線分別包被抗PCT單克隆抗體(mAb2)，包被濃度均為1.0mg/ml噴量1.0l/cm，電機速度511HZ，。（二）膠體金標記物、包被抗原或抗體等濃度確定1、膠體金標記物：分別以20ug/ml最終濃度將抗PCT單克隆抗體(mAb1)

6、加入膠體金溶液中進行標記。2、檢測線包被抗原濃度：用包被緩沖液稀釋抗PCT單克隆抗體(mAb2)，終濃度均為1.0mg/ml。3、對照線包被濃度：用包被緩沖液稀釋羊抗鼠IgG，終濃度為1.0mg/ml。（三）膠體金標記物的制備采用枸櫞酸三鈉還原法制備膠體金，選擇30nm膠體金顆粒用于標記，分別以20mg/ml最終濃度抗PCT單克隆抗體(mAb1)加入膠體金溶液中?？焖贁嚢?分鐘，再慢速攪拌15分鐘。分別加入20%BSA，攪拌5分鐘，離心6分鐘（4000轉），吸去上清，沉淀以金標記物干燥基礎液（原膠體金溶液體積的1/10）重新懸浮。置2-8保存，在規(guī)定的保存期內使用。以金標記物干燥基礎液對金標抗

7、PCT單克隆抗體(mAb1)進行按一定比例稀釋， 然后利用噴金儀噴到玻璃纖維上，噴量1.0l/cm，噴筆口徑為10mm，將噴好的玻璃纖維放置烘房中，372，干燥24小時。（四）檢測線及質控線的制備 取抗PCT單克隆抗體(mAb2)終濃度分別為1.0mg/ml，噴量1.0l/cm，電機速度511在硝酸纖維素膜上制備檢測線，室溫干燥；取已確定使用的用包被緩沖液稀釋羊抗鼠IgG，終濃度為1.0mg/ml，用同樣方法制備控制線。檢測線與控制線在NC膜上之間的距離約3.5+0.5mm，線的寬度約0.8-1.0mm；前后均勻；并置溫度1526；溫度30%；干燥24小時以上。（五）半成品檢驗按批號抽取一定數(shù)

8、量的半成品檢測，對所抽樣的半成品做準確性、最低檢出量、線性、精密性、穩(wěn)定性等性能方面的檢測，應符合質量標準。（六）貼板、切條、裝卡 在溫度1530；濕度25%條件下，將標記好的玻璃纖維、硝酸纖維膜、聚紙板、吸水紙、樣品墊（經特殊處理，可過濾紅細胞）等物組裝，要求材料附著牢固，膜條切割應寬為4.01.0mm，然后裝塑料殼。（七）定標利用公司內部校準品對試劑進行定標，定標曲線保存到二維碼中。(八)組裝1）把二維碼貼到試劑卡殼上，并將干燥劑、吸管等裝入鋁箔袋，封口。2）裝盒。（九）成品檢驗成品做準確性、最低檢出量、線性、精密性、穩(wěn)定性等性能方面的檢測，應符合質量標準。四、主要工藝的確定1 檢測線包被

9、濃度試驗設計：固定加液量（噴量1.0l/cm，電機速度511HZ），用包被緩沖液調整抗PCT單克隆抗體(mAb2)的包被濃度分別為0.3 mg/ml、0.5 mg/ml、1.0 mg/ ml、2.0 mg/ ml，分別進行包被，晾干后按正常生產工藝組裝試劑條，分別以降鈣素原最低檢出量參考品0.1ng/ml和零濃度參考品加樣測試，每個濃度參考品平行測試20次，。計算零濃度參考品測試的吸光值平均數(shù)分別為M0及計算它們的標準差SD，計算0.1ng/ml參考品的測試平均值為M1，若M1M0+2SD，表明最低檢測限0.1ng/ml（95%置信區(qū)間）。試驗結果：包被濃度M0+2SDM10.3mg/ml0.

10、5mg/ml1.0mg/ml2.0mg/ml2.5mg/ml結論：當包被濃度分別達到1.0mg/ml， 最低檢測限0.1ng/ml，而進一步提高包被濃度，這個項目的靈敏度沒有明顯的改變。最終確定這個項目檢測線包被濃度均為1.0 mg/ml。2 對照線包被濃度試驗設計：固定加液量（噴量1.0l/cm，電機速度511HZ），用包被緩沖液調整羊抗鼠IgG抗體濃度為0.4 mg/ml、0.8 mg/ml、1.0 mg/ml、1.4 mg/ml、1.8mg/ml，分別進行包被，晾干后按正常生產工藝組裝試劑條，以陰性標本加樣比較不同包被濃度對照線顯色時間。試驗結果：羊抗鼠IgG對照線顯色時間0.5mg/m

11、l超過4 min0.8mg/ml超過4 min1.0mg/ml2min1.5mg/ml2min2.0mg/ml2min結論：包被濃度達到1.0mg/ml,，對照線即在2 min內清晰可辯，符合設計要求。最終確定對照線包被濃度1.0mg/ml。3 膠體金標記抗PCT單克隆抗體(mAb1)的制備3.1膠體金與標記蛋白用量之比的確定試驗設計：將膠體金分裝15管，每管1ml，每個項目5管。將抗PCT單克隆抗體(mAb1)分別以5g/ml、10g/ml、20g/ml、30g/ml、40g/ml濃度加入上列膠體金溶液中，快速攪拌1分鐘，再慢速攪拌15分鐘。加20%BSA，攪拌5分鐘，離心6分鐘（10000

12、轉），吸去上清，沉淀以金標記物干燥基礎液重新懸浮。以金標記物干燥基礎液對金標抗PCT單克隆抗體(mAb1)進行按一定比例稀釋， 然后利用噴金儀噴到玻璃纖維上，噴量1.0l/cm，噴筆口徑為10mm，將噴好的玻璃纖維放置烘房中，372，干燥24小時。按正常生產工藝組裝試劑條。分別進行包被，晾干后按正常生產工藝組裝試劑條，分別以降鈣素原最低檢出量參考品0.1ng/ml和零濃度參考品加樣測試，每個濃度參考品平行測試20次。計算零濃度參考品測試的吸光值平均數(shù)分別為M0及計算它們的標準差SD，計算0.1ng/ml參考品的測試平均M1，若M1M0+2SD，表明最低檢測限0.1ng/ml（95%置信區(qū)間）。

13、比較不同標記蛋白用量的靈敏度高低。包被濃度M0+2SDM10.3mg/ml0.5mg/ml1.0mg/ml2.0mg/ml2.5mg/ml結論：當標記濃度分別達到20g/ml, 試劑盒能滿足最低檢出量參考品0.1ng/ml檢出要求，而進一步提高包被濃度，這三個項目的檢測線顯色程度沒有明顯的改變。最終確定標記濃度均為20g/ml。3.2金標抗PCT單克隆抗體(mAb1)稀釋濃度的確定試驗設計：將抗PCT單克隆抗體(mAb1)用金標記物干燥基礎液按1：1、1：2、1：3比例進行稀釋，稀釋好后按固定噴金參數(shù)，將金標抗PCT單克隆抗體(mAb1)噴在 玻璃纖維上，干燥，按正常生產工藝組裝試劑條，分別以

14、降鈣素原最低檢出量參考品0.1ng/ml和零濃度參考品加樣測試，每個濃度參考品平行測試20次。計算零濃度參考品測試的吸光值平均數(shù)分別為M0及計算它們的標準差SD，計算0.1ng/ml參考品的測試平均M1，若M1M0+2SD，表明最低檢測限0.1ng/ml（95%置信區(qū)間）。比較不同標記蛋白用量的靈敏度高低。稀釋濃度M0+2SDM11:11:21:3結論：只有當稀釋度達到1：1時，最低檢測限0.1ng/ml，符合設計要求。最終確定金標單抗稀釋度為1：1。4 設計定型通過以上實驗，我們確定采用的生產工藝為：（1） NC膜包被：檢測線：用包被緩沖液稀釋抗PCT單克隆抗體(mAb2)到終濃度為1.0m

15、g/ml。對照線：用包被緩沖液稀釋羊抗鼠IgG，終濃度為1.0mg/ml。包膜參數(shù)：噴量1.0l/cm，電機速度511HZ。將包被好的NC膜放置烘房中，372，干燥24小時。（2）膠體金標記：以20mg/ml最終濃度將抗PCT單克隆抗體(mAb1)加入膠體金中。快速攪拌1分鐘，再慢速攪拌15分鐘。加20%BSA，攪拌5分鐘，離心6分鐘（4000轉），吸去上清，沉淀以金標記物干燥基礎液重新懸浮。然后用金標記物干燥基礎液分別按1：1進行稀釋，然后利用噴金儀噴到玻璃纖維上，噴量1.0l/cm，噴筆口徑為10mm，將噴好的玻璃纖維放置烘房中，372，干燥24小時。按正常生產工藝組裝試劑條。成品檢驗方案

16、：組裝成的試劑條是否在15分鐘內檢出降鈣素原最低檢出量參考品0.1ng/ml。成品檢驗結果：組裝成的試劑條能在15分鐘內檢出降鈣素原最低檢出量參考品0.1ng/ml。結論：該生產工藝生產出來的試劑條符合我們的產品要求，確認為以后采用的生產工藝。五、質控標準及內部質控品的確立1. 企業(yè)標準的制定的緣由由于目前人降鈣素原的檢測尚無一個統(tǒng)一的國家標準或國際標準，我們參考已上市的人降鈣素原檢測試劑盒產品的性能指標，設計了本品的企業(yè)內部標準，制定了內部校準品和質控品。2.質控標準2.1 準確性標準：取PCT零濃度參考品，作為基礎樣本，將其等體積分為4份，在任意3份中添加PCT純分析物，使加入濃度分別為5

17、ng/ml、15ng/ml、40ng/ml，制成3份回收樣本，分別計算其回收率，然后計算平均回收率，平均回收率應95%。2.2 最低檢測限標準分別以降鈣素原最低檢出量參考品0.1ng/ml和零濃度參考品加樣測試，每個濃度參考品平行測試20次。計算零濃度參考品測試的吸光值平均數(shù)分別為M0及計算它們的標準差SD，計算0.1ng/ml參考品的測試平均M1，若M1M0+2SD，表明最低檢測限0.1ng/ml（95%置信區(qū)間）。最低檢測限必須0.1ng/ml。2.3線性標準用50ng/ml的高濃度參考品和0.1ng/ml的低濃度參考品，混合成8個稀釋濃度（Xi），每個濃度測定3次，分別求出檢測結果均值即

18、為實測值（Yi）。以稀釋濃度（Xi）為自變量，以檢測結果實測值（Yi）為因變量求出線性回歸方程。計算線性回歸的相關系數(shù)（r）及線性相對偏差，要求線性相關系數(shù)r0.975，線性相對偏差不超過15%。2.4精密性標準批內：用同一批次試劑盒分別對企業(yè)內部1ng/ml和40ng/ml PCT參考品進行檢測，各平行測定10次，批內變異系數(shù)CV15%。批間：取三個不同批次的產品，分別測定企業(yè)內部1ng/ml和40ng/ml PCT參考品，每個批號重復檢測10次，批間變異系數(shù)CV20%。3. 內部質控品的制備3.1 最低檢出量質控品的制備和驗證3.1.1 降鈣素原零濃度質控品的制備和驗證 制備方法：10份經確認PCT為陰性、無肉眼可見的溶血、黃疸、乳糜顆粒，HIV抗體、HBV抗原、HCV抗體檢測均為陰