濃縮膠和分離膠

1、濃縮膠和分離膠的PH值不同，前者主要表現(xiàn)為濃縮效用，后者表現(xiàn)為電荷效用和分子篩效用。濃縮效應(yīng)主要在濃縮膠中完成，濃縮膠的pH6.8，在這個pH條件下，緩沖液中的HCl的Cl離子幾乎全部解離，Gly的等電點為6.0，僅少數(shù)解離為負離子，在電場中移動速度很慢。酸性蛋白質(zhì)在此pH下解離為負離子，三類離子的遷移速率為Cl一般蛋白質(zhì)Gly，電泳開始后，Cl離子泳動快，在其后留下一個低離子濃度區(qū)。Gly在電場中移動很慢，造成移動離子的缺乏，于是快慢離子間就形成了一個缺少離子的高壓區(qū)，在高壓區(qū)內(nèi)所有的負離子都會加速移動，當(dāng)移到Cl離子區(qū)域時，高電壓消失，蛋白質(zhì)的移動速度慢下來，當(dāng)以上穩(wěn)定狀態(tài)建立后，蛋白質(zhì)樣

2、品在快慢離子間被濃縮形成一個狹小的之間層，并按蛋白質(zhì)所帶負電荷量的多少依次排列成帶，濃縮樣品，從濃縮膠進入分離膠后，膠的pH升高，Gly的離解度增大，泳動率上升，又因為它分子小，故超過所有的蛋白質(zhì)分子，緊跟在Cl離子后，Cl離子遷移后，低離子濃度不再存在，形成了恒定的電場強度，因此，蛋白質(zhì)樣品在分離膠中的分離主要取決于它的電荷性質(zhì)，分子大小和形狀，分離膠的孔徑有一定大小，對不同相對質(zhì)量的蛋白質(zhì)來說，通過時收到的滯阻作用不同，即使靜電荷相等的顆粒，也會由于這種分子篩的效應(yīng)，把不同大小的蛋白質(zhì)相互分開。10和12膠的差別：根據(jù)你目的蛋白分子量而定，如果說是分子量較大的蛋白（60KD以上），可以用1

3、0的膠，分子量在6030KD之間的可以用12的膠，低于30KD的我一般都是用15的膠了。主要在于指示線剛好跑出膠底的時候，你的目的蛋白能夠恰好處于膠的中間部分。凝膠的濃度大小不同所對應(yīng)的凝膠孔徑大小也不同，濃度小的孔徑大，濃度大的孔徑小，一般分離膠用12%的，濃縮膠用5%的，因為濃縮膠的目的就是將所有的蛋白濃縮在同一起跑線上，然后一塊進入分離膠分離。 據(jù)蛋白大小定。Western Blot轉(zhuǎn)膜在電流的作用下，使蛋白質(zhì)從膠轉(zhuǎn)移至固相載體（膜）上。膜的選擇：印跡中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龍膜、PVDF等。我們選用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理強度，以及具有更

4、好的化學(xué)兼容性。 有兩種規(guī)格：Immobilon-P（0.45um）和Immobilon-PSQ(0.2um for MW20kDa)。A 半干法即將凝膠夾層組合放在吸有轉(zhuǎn)印緩沖液的濾紙之間，通過濾紙上吸附的緩沖液傳導(dǎo)電流，起到轉(zhuǎn)移的效果。因為電流直接作用在膜膠上，所以其轉(zhuǎn)移條件比較嚴酷，但是其轉(zhuǎn)移時間短，效率高。1 實驗條件的選擇電流1mA-2mA/cm2，我們通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、膠濃度選擇轉(zhuǎn)移時間具體可以根據(jù)實際適當(dāng)調(diào)整。目的蛋白分子大小(kDa) 膠濃度 轉(zhuǎn)移時間80-140 8% 1.5-2.025-80 10% 1.51540 12% 0.75=膜=膠。2）濾紙

5、、膠、膜之間千萬不能有氣泡，氣泡會造成短路。3）因為膜的疏水性，膜必須首先在甲醇中完全浸濕。而且在以后的操作中，膜也必須隨時保持濕潤（干膜法除外）。4）濾紙可以重復(fù)利用，上層濾紙（靠膜）內(nèi)吸附有很多轉(zhuǎn)移透過的蛋白質(zhì)，所以上下濾紙一定不能弄混，在不能分辨的情況下，可以將靠膠濾紙換新的。5）轉(zhuǎn)移時間一般為1.5 小時，( 1mA-2mA/cm2，10% gel)，可根據(jù)分子量大小調(diào)整轉(zhuǎn)移時間和電流大小。1)在疊膜、膠、紙三明治時候，操作于盛有轉(zhuǎn)膜Buffer的大平皿中進行，疊好后，再將三者平行轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)膜裝置，切勿再移動，因為在buffer中操作，已經(jīng)完全排除了氣泡存在的可能，無需再趕氣泡2)關(guān)于轉(zhuǎn)膜時間：半干轉(zhuǎn)的話，20 V30min即可B 濕法我們基本上不用此方法，這里暫不做介紹。C 轉(zhuǎn)移后效果的鑒定1染膠用考馬斯亮蘭染色經(jīng)destain脫色后，看膠上是否還有蛋白來反映轉(zhuǎn)移的效果。2染膜有兩類染液選擇，可逆的和不可逆的?？赡娴挠衟onceau-s red 、Fastgreen FC、CPTS等，這