SSR實(shí)驗(yàn)操作流程

1、SSR實(shí)驗(yàn)操作流程比較功能基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)室一、試劑配制0.2%親水binding silence（現(xiàn)配現(xiàn)用）1500L95%乙醇，7L冰醋酸，再加入3L binding silence，混勻后使用。注：硅烷可因吸入、咽下或皮膚吸收而損害健康。特別易燃，要遠(yuǎn)離熱、火花和明火。其揮發(fā)的氣霧對(duì)粘膜和上呼吸道組織、眼睛和皮膚有刺激作用。戴合適的手套和安全眼鏡、始終在化學(xué)通風(fēng)櫥里使用。0.5%疏水repel silence（購(gòu)買后可直接使用）TBE母液（5TBE）Tris Base 54g硼酸 27.5gEDTA(0.5M pH8.0) 20ml攪拌溶化，定容至1000ml，無(wú)需滅菌，室溫保存，母液的pH

2、值應(yīng)保持在8.3左右。注：如果用得比較多，可以配成10倍或者20倍的備用。UreaTBE(一塊膠板用量)： 5TBE 12ml尿素 27g加雙蒸水溶解后定容至51ml，使用濾紙過(guò)濾。注：冬天配制時(shí)可以用微波爐加熱使之迅速溶解，最好立即趁熱過(guò)濾，使用時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，盡量在3周內(nèi)用完。尿素可因吸入、咽下或皮膚吸收而損害健康，戴合適的手套和安全眼鏡。40丙稀酰胺丙稀酰胺 380g甲叉雙丙稀酰胺 20g加熱至37使之溶解，加水定容至1000ml，用濾紙過(guò)濾，棕色瓶避光保存于室溫。注：丙烯酰胺（未聚合的）是一種強(qiáng)的神經(jīng)毒素并可通過(guò)皮膚吸收（其效應(yīng)是累加的）。當(dāng)稱量粉末狀丙烯酰胺和亞甲基雙丙烯酰胺時(shí)，要佩戴

3、合適的手套和防護(hù)面具，在通風(fēng)櫥內(nèi)操作。人們多數(shù)認(rèn)為多聚丙烯酰胺是無(wú)毒的，但亦應(yīng)小心操作，因?yàn)榭赡芎猩倭课淳酆系谋０贰?0APS（過(guò)硫酸銨）超純過(guò)硫酸銨 2g超純水 18ml溶解后，4保存，一個(gè)月之內(nèi)用可以不放4保存。注：過(guò)硫酸銨對(duì)粘膜和上呼吸道組織、眼睛和皮膚有極大的危害性。操作時(shí)戴合適的手套、安全眼鏡和防護(hù)服。始終在通風(fēng)櫥內(nèi)操作，操作完后徹底洗手。TEMED（購(gòu)買后可直接使用）電泳級(jí)的TEMED可購(gòu)自Bio-Rad，Sigma或其他供應(yīng)商。注：TEMED對(duì)粘膜和上呼吸道組織、眼睛和皮膚有極大的危害性，吸入和致命。長(zhǎng)時(shí)間接觸可引起嚴(yán)重的刺激或灼傷，操作時(shí)戴合適的手套、安全眼鏡和防護(hù)服。始

4、終在通風(fēng)櫥內(nèi)操作，操作完成后徹底洗手。TEMED揮發(fā)的氣體能傳到相當(dāng)遠(yuǎn)的火源并引起花光四閃。切勿靠近熱、火花和明火。Loading buffer：去離子甲酰胺 100ml0.5M EDTA(pH8.0) 2ml二甲苯腈藍(lán)cyanol 0.05g溴酚藍(lán) 0.05g混勻后置于4保存。注：購(gòu)買蒸餾的去離子化甲酰胺，分裝成小份充氮貯存于-20，或購(gòu)買去離子化試劑級(jí)的甲酰胺。許多批號(hào)的試劑級(jí)甲酰胺已足夠的純，無(wú)須進(jìn)一步處理即可使用。但是，如果呈現(xiàn)黃色，則必須進(jìn)行去離子化處理。處理方法見(jiàn)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南。甲酰胺是一種致畸劑，其揮發(fā)的氣霧對(duì)粘膜、上呼吸道組織、眼睛和皮膚有刺激作用?？梢蛭?、咽下或皮膚吸收而

5、損害健康。戴合適的手套和安全眼鏡。當(dāng)用濃的甲酰胺工作時(shí)，要始終在化學(xué)通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行，工作液盡可能的遮蓋。固定液：無(wú)水乙醇50ml，冰醋酸2.5ml，水447.5ml。配制成終濃度為10 乙醇，0.5% 冰醋酸的固定液。染色溶液(ACS 試劑)：無(wú)水乙醇50ml，冰醋酸2.5ml，水447.5ml，AgNO3 1g。配制成終濃度為10 乙醇，0.5% 冰醋酸，0.2% AgNO3的染色液。注：染色液配置用雙蒸水。AgNO3是一種很強(qiáng)的氧化劑，要謹(jǐn)慎操作。它可因吸入、咽下或皮膚吸收而損害健康，避免接觸皮膚、戴合適的手套和安全眼鏡。與其他物質(zhì)接觸可引起爆炸。顯影溶液：15g NaOH，0.5ml 甲醛

6、，水500ml。終濃度為3NaOH，0.1%甲醛。注：顯影液可以用自來(lái)水配置，每次用時(shí)重新加甲醛，甲醛有很大的毒性并揮發(fā)，也是一種致癌劑。很容易通過(guò)皮膚吸收，對(duì)粘膜和上呼吸道組織、眼鏡和皮膚有刺激損傷作用。避免吸入其揮發(fā)的氣霧。戴合適的手套和安全眼鏡，始終在化學(xué)通風(fēng)櫥內(nèi)使用，遠(yuǎn)離熱、火花和明火。二：實(shí)驗(yàn)步驟1、玻璃板清洗準(zhǔn)備：1）用洗滌劑把玻璃反復(fù)擦洗干凈，瀝干備用。在疏水玻璃板上均勻涂上300-500L的0.5%的疏水劑Binding Silane?？煞胚^(guò)夜。2）配制凝膠前，在親水玻璃板上均勻涂上2的親水劑Repel Silane，保證玻璃板的每個(gè)地方都涂上親水劑，晾干至少5min，可以用酒

7、精輕輕擦拭以去掉多余的親水劑。3）玻璃板徹底干燥后進(jìn)行玻璃板組裝。兩塊玻璃板兩邊邊緣割傷配套的硬紙條，橡皮夾子夾住兩邊，在橡皮夾子里加上硬紙片可以保證玻璃板的水平，可以有效地防止條帶跑歪。下邊套上有旋鈕的塑料套，旋緊旋鈕，以防止底下漏膠在插入梳子的位置插入一個(gè)硬紙條以保證上方凝膠界面水平且整齊。4）將裝好的玻璃板水平放置于桌面上，親水玻璃板置于下面，而帶電極的疏水玻璃板朝上，保證玻璃板的水平。以上是進(jìn)口一起的操作，國(guó)產(chǎn)六一操作差不多，在玻璃板組裝上熟練了可以不用封透明膠條，夾緊兩邊并邊控制平衡邊灌膠，最后迅速插上平衡膠面的梳子，自己摸索注意事項(xiàng)：1） 用洗滌劑及無(wú)水乙醇清洗玻璃板后要保證玻璃板

8、上無(wú)油漬，以避免凝膠中產(chǎn)生氣泡。2） 涂布疏水劑時(shí)最好在上一次電泳完成后進(jìn)行，因?yàn)檫@時(shí)候疏水板還是熱的，尤其是在冬天，疏水劑特別容易凝固。若疏水劑已凝固，可用電吹風(fēng)邊吹邊抹。3） 涂布親水劑時(shí)要保證玻璃板的每個(gè)部位都涂上，并且要等其晾干，晾干時(shí)間至少為3-5min，這樣能保證玻璃板與凝膠充分粘連。4） 操作過(guò)程中，要防止親水玻璃和疏水玻璃板的相互污染。5） 帶有膠的親水板提前泡好，加上一定量的NaOH，濃度不定，多加水，泡的時(shí)間越長(zhǎng)越容易洗。2、聚丙烯酰胺凝膠的制備1）每一塊膠的用量配制如下：（大膠）UreaTBE 51ml40%丙稀酰胺 9ml10%APS 200lTEMED 30l共計(jì) 約

9、60ml2）加完APS輕輕搖勻，然后再加TEMED，再搖勻，這樣在夏天可以有效防止由于局部地方APS過(guò)高在未灌膠之前就凝固了。注意不要用力攪拌，會(huì)使膠里產(chǎn)生氣泡，混勻后立即灌膠。3）將混合液導(dǎo)入大注射器中，將導(dǎo)管中氣泡擠出，迅速將導(dǎo)管口插入灌膠口，在重力作用下，混合液流入兩塊玻璃板之間，人為控制流速以防止氣泡產(chǎn)生。4）灌膠完成后，聚合時(shí)間約1小時(shí)。注意事項(xiàng)：1） 由于丙烯酰胺有毒性，配置時(shí)應(yīng)戴手套。2） 灌制凝膠前大注射器的導(dǎo)管中擠出氣泡，以防止氣泡產(chǎn)生。3） 凝膠中丙烯酰胺的濃度根據(jù)所要分離的DNA片段大小來(lái)確定，具體見(jiàn)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，其中，含5%丙烯酰胺的凝膠的分離范圍為80-500bp

10、。4） 若凝膠要放置過(guò)夜，則須在凝膠兩頭鋪上濕報(bào)紙或濕抹布以防止凝膠變干。如果時(shí)間很緊可以通過(guò)多加APS或者TEMED加速凝固，但是兩者最好不要同時(shí)多加，尤其是夏天，凝固速度會(huì)特別快。3、凝膠電泳1）將凝固的板子梳子拔掉并徹底清洗上面多余的凝膠，組裝到電泳儀上，正極槽（底下）中加入600ml的1TBE緩沖液，負(fù)極槽上加入800ml的0.5TBE緩沖液直至覆蓋了凝膠上方。2）將凝膠上方多余的膠用槍沖洗干凈，并將氣泡清除。3）預(yù)電泳10-20min，保持在恒定功率55W（相當(dāng)于電壓1441V，電流38mA）。4）預(yù)電泳完成后，關(guān)閉電源，用槍將凝膠上方多余的氣泡和膠清除干凈，插入梳子，再用槍將梳子中

11、的氣泡清除干凈。5）加入3l已由loading buffer處理過(guò)的樣品DNA，每塊板子可點(diǎn)1-3個(gè)Marker，55W恒定功率電泳1.5h，至第一條Loading buffer指示帶（二甲苯青帶，約相當(dāng)于260bp雙鏈DNA）跑至膠板的2/3處（距底部1/3處）時(shí)停止電泳。6）通過(guò)帶電極玻璃板中部的出水孔排出0.5TBE緩沖液，剩余的0.5TBE緩沖液直接倒掉，緩沖液可反復(fù)使用幾次。7）小心的分開兩塊玻璃板，這時(shí)凝膠會(huì)粘連在涂有親水劑的玻璃板上。注意事項(xiàng)：1） 插入梳子時(shí)可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求調(diào)整柱子的插入深度，一般只需要插入1-2mm即可（太深條帶會(huì)很彎，太淺點(diǎn)樣時(shí)會(huì)往旁邊滲），滿足點(diǎn)樣量為3l的

12、需求。2） 預(yù)電泳的作用包括：使氣泡升至凝膠上方，使電泳系統(tǒng)預(yù)熱，因而預(yù)電泳很重要。3） 樣品DNA上樣前加入等體積的Loading buffer，95變性3-5min。4） 在6-8%的變性聚丙烯酰胺凝膠中，溴酚藍(lán)遷移速率約與125bp的單鏈DNA相同（自己可以試驗(yàn)，根據(jù)預(yù)計(jì)的片段大小選擇合適的電泳時(shí)間，一般使目標(biāo)條帶跑到板子的上1/3處條帶比較好讀，但是如果條帶分子量特別大，跑到1/2處），在0.5TBE瓊脂糖凝膠電泳中溴酚藍(lán)遷移速率約與長(zhǎng)300bp的線狀雙鏈DNA相同，而二甲苯青FF約與長(zhǎng)4000bp的DNA相同。在含5.0%丙烯酰胺的凝膠的有效分離范圍為80-500bp，溴酚藍(lán)遷移速率

13、約與65bp的雙鏈DNA相同，而二甲苯青FF約與長(zhǎng)260bp的雙鏈DNA相同。5） 根據(jù)需要點(diǎn)marker，一般多態(tài)性較高就多點(diǎn)幾個(gè)marker，而且最好不要點(diǎn)到最邊上的兩個(gè)孔。6） 電泳時(shí)產(chǎn)熱過(guò)多可導(dǎo)致DNA條帶的“微笑”現(xiàn)象和其他問(wèn)題的出現(xiàn)。7） 有時(shí)凝膠會(huì)吸附在硅化的玻璃板上，這時(shí)，將玻璃板翻轉(zhuǎn)，從上取下未硅化的玻璃板。4、銀染1）將帶凝膠的玻璃板浸在固定液（10 乙醇，0.5% 冰醋酸）中20min，凝膠朝下放置，玻璃板位于上方，如果能夠立即讀取數(shù)據(jù)或者拍照可以不用固定這一步。2）將玻璃板取出，染色液中染色8-15min，凝膠朝下放置，玻璃板位于上方，并用硬條墊著使膠充分接觸染色液。3）用自來(lái)水短時(shí)間快速?zèng)_洗玻璃板兩面，玻璃板須離水近些，沖洗干凈，否則凝膠容易變黑。4）將凝膠浸在顯影液（3NaOH，0.1%甲醛）中，直至帶紋出現(xiàn)，一般15-30分鐘，凝膠朝上放置。5）用自來(lái)水沖洗干凈。6）室溫下自然干燥，干燥后的膠板覆