生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗：土豆酪氨酸酶的純化及活性測定

1、酶活力 enzyme activity - 指酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的能力 - 反應(yīng)速率愈大，活力愈高 反應(yīng)速率愈小，活力愈低 酶的活性 在優(yōu)化的條件下（pH、離子強(qiáng)度、溫度），1 min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 mol底物所需要的酶量。可用底物消耗量或產(chǎn)物生成量進(jìn)行計算： = (A/t)V 106,其中，A為測試管與空白對照管之間的吸光度值差，t為實際反應(yīng)時間（單位為min），V為反應(yīng)總體積（單位為L,= 3700Lmol-1cm-1,酶的比活力 在特定條件下，單位重量（mg）酶所具有的酶活力單位數(shù)，一般用酶活力單位/mg 酶表示,一般情況下，酶的活力隨著提取過程會不斷喪失，酶的比活力隨著提取分離過程中酶的不斷

2、純化而提高,如何獲得好的實驗結(jié)果 低溫操作：實驗全程冰上操作，包括酶活力測定的配制樣品期間等（注意垂直放置離心管并保證酶液完全浸入）；避免體溫接觸；長期儲存于-80 oC。 精確控制反應(yīng)時間，L-DOPA避光冷藏 刮取出來的粗酶應(yīng)盡量完全溶解（用緩沖液多次沖洗玻棒頭及移液槍吹打、渦旋,酶學(xué)實驗 II. 土豆酪氨酸酶的純化及活性測定,生物化學(xué)實驗四,層析法又稱為色層分析法或色譜法，該法是基于被分離物質(zhì)的物理、化學(xué)及生物學(xué)特性的不同，使它們在某種基質(zhì)中移動速度不同而進(jìn)行分離和分析。 物理、化學(xué)及生物學(xué)特性指的是樣品的溶解度、吸附能力、立體化學(xué)特性、分子大小、帶電情況及能發(fā)生特異生物學(xué)反應(yīng)等特點,凝

3、膠層析是生物化學(xué)中一種常用的分離手段，它具有設(shè)備簡單、操作方便、樣品回收率高、實驗重復(fù)性好、特別是不改變樣品生物學(xué)活性等優(yōu)點，因此廣泛用于蛋白質(zhì)（包括酶）、核酸、多糖等生物分子的分離純化，同時還應(yīng)用于蛋白質(zhì)分子量的測定、脫鹽、去除小分子雜質(zhì)、取出熱源物質(zhì)、樣品濃縮等,酶標(biāo)儀實際上就是一臺變相的專用光電比色計或分光光度計，其基本工作原理與主要結(jié)構(gòu)和光電比色計基本相同。 盛裝待測比色液的容器不再使用比色皿，而是使用塑料微孔板（96/384 -孔板，酶標(biāo)板）。微孔板常用透明的聚乙烯材料制成，對抗原抗體有較強(qiáng)的吸附作用，故用它作為固相載體。 由于盛樣本的塑料微孔板是多排多孔的，光線只能垂直穿過，因此酶

4、標(biāo)儀的光束都是垂直通過待測溶液和微孔板的，光束既可是從上到下，也可以是從下到上穿過比色液,粗酶樣品,分別用2ml PBS緩沖溶解，兩次離心（常溫）取上清,過柱純化,收集有活性的，合并,測酶活力,裝柱（Sephadex G-50,Bradford法定量,1）裝柱（視頻演示） （2）樣品制備：上次實驗得到的兩管粗酶，分別用2 ml pH7.0的PBS緩沖液溶解，12000 rpm, 2min兩次離心取上清。 （3）其中一管全部上樣于凝膠層析柱中。（操作演示） （4）洗脫與收集：每20滴收集一管（記錄上樣體積），收集20管 （5）各收集組份酶活力測定：各取收集管中溶液100 L按順序加入酶標(biāo)板中，收集結(jié)束后由助教統(tǒng)一加入100 L的 L-DOPA，37oC放置3 min（自行計時），于酶標(biāo)儀中記錄480nm處光吸收值。以洗脫體積為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，作洗脫曲線。 （6）將有酶活性的組份合并即為純酶,7）按照下表往12聯(lián)管中加入試劑，在37oC烘箱內(nèi)反應(yīng)3 min，在480 nm處測吸光度，（注意精確計時?。┳鳂?biāo)準(zhǔn)曲線，擬合后在線性范圍內(nèi)的任意點取點，分別求粗酶及純化酶的活力和比