高中生物 第1章 微生物培養(yǎng)技術 第3節(jié) 測定微生物的數(shù)量學案 中圖版選修1

1、第三節(jié) 測定微生物的數(shù)量一、測定微生物數(shù)量的方法測定微生物數(shù)量的方法可分為兩類：直接計數(shù)法和間接計數(shù)法。前者常用的是顯微鏡直接計數(shù)法，這種方法是先將待測樣品制成懸液，然后取一定量的懸液放在顯微鏡下進行計數(shù)。該方法適用于純培養(yǎng)懸浮液中各種單細胞菌體的計數(shù)。后者最常用的是稀釋平板計數(shù)法，需要將待測樣品配制成均勻的系列稀釋液并使其均勻分布于平板中的培養(yǎng)基內，經培養(yǎng)后統(tǒng)計培養(yǎng)基中出現(xiàn)的菌落數(shù)，從而推算出樣品中的活菌數(shù)。利用血球計數(shù)板測出的菌體數(shù)與平板計數(shù)法相比哪個多些？【提示】血球計數(shù)板測出的是全部菌體數(shù)，而平板計數(shù)法只能測出活菌數(shù)，而且比實際數(shù)偏少。二、間接計數(shù)法的實驗設計1制備土壤稀釋液取土壤表層

2、510 cm處的土樣。準確稱取1 g土樣，放入盛有99 mL無菌水的錐形瓶中，振蕩20 min后制成102倍的稀釋液。然后進行系列稀釋，得到103、104、105、106倍的系列稀釋菌液。2取樣及倒平板3培養(yǎng)4觀察記錄(1)計數(shù)時對于細菌、放線菌以每個培養(yǎng)皿內有30300個菌落為宜，霉菌以每個培養(yǎng)皿內有10100個菌落為宜。(2)計算每克樣品菌數(shù)公式為：每克土壤樣品菌數(shù)稀釋倍數(shù)。預習完成后，請把你認為難以解決的問題記錄在下面的表格中問題1問題2問題3問題4一、微生物生長量的測定 1.測重量法 干重法：將單位體積待測的培養(yǎng)液離心后，用清水洗滌15次，放入干燥器中加熱干燥，加熱溫度一般在10010

3、5 之間，再稱重。以細菌為例，一個細胞一般重約10121013g，也可在較低溫度(如40 )下進行真空干燥。 濕重法：將一定量的菌懸液離心或過濾，得到菌體，反復洗滌后稱濕重，干重一般為濕重的20%25%。2計數(shù)法(1)直接計數(shù)法這種方法是利用特定細菌計數(shù)板或血球計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。此法的缺點是不能區(qū)分死菌與活菌。計數(shù)板是一塊特制的載玻片，上面有一個特定的面積1 mm2和高0.1 mm的計數(shù)室，在1 mm2的面積里又被劃分成25個(或16個)中格，每個中格進一步劃分成16個(或25個)小格，但計數(shù)室都是由400個小格組成。將稀釋的樣品滴在計數(shù)板上，蓋上蓋玻片，然后

4、在顯微鏡下計數(shù)45個中格的細菌數(shù)，并求出每個小格所含細菌的平均數(shù)，再按下面公式求出每毫升樣品所含的細菌數(shù)。每毫升原液所含細菌數(shù)每小格平均細菌數(shù)4001 000稀釋倍數(shù)(2)間接計數(shù)法(活菌計數(shù)法)稀釋平板涂布法，常用來統(tǒng)計樣品中的活菌數(shù)。此法是根據微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個菌落是由一個單細胞繁殖而成的現(xiàn)象進行的，也就是說一個菌落即代表一個單細胞。計數(shù)時先將待測樣品做一系列稀釋，再取一定量的稀釋菌液接種到培養(yǎng)皿上，使其均勻分布于平板中的培養(yǎng)基內，經培養(yǎng)后，由單個細胞生長繁殖形成菌落，統(tǒng)計菌落數(shù)目，即可換算出樣品中的含菌數(shù)。說明：為了保證結果準確，一般選擇菌落數(shù)在30300的平板上進行計數(shù)。

5、將待測樣品經一系列10倍稀釋，然后選擇三個稀釋度的菌液，分別取0.1 mL接種到已制備好的平板上，然后用無菌涂布器將菌液涂布整個平板表面，放入適宜的溫度下培養(yǎng)計算菌落數(shù)。為使結果接近真實值可將同一稀釋度加到三個或三個以上的平板中，經涂布、培養(yǎng)計算出菌落平均數(shù)。統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目低。這是因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。因此，統(tǒng)計結果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)來表示。涂布平板法所選擇倒平板的稀釋度很重要，一般以三個稀釋度中的第二個稀釋度倒平板所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個左右為最好。每克樣品中的菌落數(shù)(CV)M，其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V

6、代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(mL)，M代表稀釋倍數(shù)。二、測定土壤中的微生物數(shù)量土壤中生活的微生物種類和數(shù)量是極其豐富的，這些數(shù)量眾多的微生物對提高土壤肥力有重要作用。因此，測定土壤的含菌量可以作為判定土壤肥力的一個重要指標。1實驗原理平板菌落計數(shù)法是將待測定的微生物樣品按比例作一系列稀釋后，將其中的微生物充分分散成單個細胞，吸取一定量某幾個稀釋度的菌液接種到平板上，培養(yǎng)一段時間后，每個單細胞生長繁殖形成單個菌落，根據稀釋倍數(shù)、取樣接種量和菌落數(shù)即可換算出樣品的含菌數(shù)。2材料用具土壤樣品：尿素，酵母粉，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鈉、酚紅、瓊脂，1 mol/L NaOH溶液，無菌吸管，盛有9 mL

7、無菌水的試管，盛有90 mL無菌水并帶有玻璃珠的錐形瓶，試管架，無菌培養(yǎng)皿，記號筆，燒杯等。3方法步驟(1)制備尿素固體培養(yǎng)基準確稱取尿素20 g，酵母粉0.1 g，磷酸二氫鉀9.1 g，磷酸氫二鈉9.5 g，酚紅0.01 g，瓊脂20 g，依次加入盛有900 mL蒸餾水的燒杯中，加熱溶解后，用1 mol/L NaOH溶液調pH至7.27.4，補加蒸餾水至1 000 mL。(2)制備土壤樣品稀釋液稱取土樣10 g，放入盛有90 mL無菌水并帶有玻璃珠的錐形瓶中，振蕩約20 min，使土樣和水充分混合，將土壤懸液制成101、102、103、104、105、106不同稀釋度的稀釋液。制備土壤樣品稀

8、釋液時應注意每個吸管只能接觸一個濃度的稀釋液，且取樣前需充分搖勻。(3)加樣取10套無菌培養(yǎng)皿，取104、105和106每種稀釋度做3個重復平板，留下一個平板作空白對照。分別用1 mL無菌移液管精確吸取104、105、106三個稀釋度菌懸液各0.2 mL，加至相應編號的無菌培養(yǎng)皿中(如圖)。微生物數(shù)量測定的流程圖(4)倒平板將菌液移入培養(yǎng)皿后立即倒入溶化并冷卻至45 左右的尿素培養(yǎng)基(倒入量約15 mL)，隨即快速晃動培養(yǎng)皿，使菌液和培養(yǎng)基充分混勻后平置，待凝。(5)培養(yǎng)待平板完全凝固后，倒置于恒溫箱中37 培養(yǎng)。(6)統(tǒng)計菌落數(shù)培養(yǎng)48 h后取出平板，統(tǒng)計各皿中的菌落數(shù)，將結果記錄在表格中，

9、計算結果時，應選取每皿菌落數(shù)在30300(如圖)的一組平板為代表進行統(tǒng)計。每皿菌落數(shù)示意圖(7)計算樣品中菌數(shù)的公式每克樣品的菌數(shù)同一稀釋度的菌落平均數(shù)0.2稀釋度10直接計數(shù)法統(tǒng)計菌數(shù)在探究培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量變化的實驗中，需利用計數(shù)板對微生物細胞進行直接計數(shù)。計數(shù)板是一個特制的可在顯微鏡下觀察的玻片，樣品就滴在計數(shù)室內。計數(shù)室由2516400個小室組成，容納液體總體積為0.1 mm3。某同學操作時將1 mL酵母菌樣品加99 mL無菌水稀釋，用無菌吸管吸取少許使其自行滲入計數(shù)室，蓋上蓋玻片并用濾紙吸去多余菌液，進行觀察計數(shù)。(1)在實驗中，某同學的部分實驗操作過程是這樣的：從靜置試管中吸取

10、酵母菌培養(yǎng)液加入計數(shù)板進行計數(shù)，并記錄數(shù)據；把酵母菌培養(yǎng)液放置在冰箱中；第七天再取樣計數(shù)，記錄數(shù)據，統(tǒng)計分析繪成曲線。請糾正該同學實驗操作中的3處錯誤：_。_。_。(2)在實驗前應該對計數(shù)板、吸管等器具進行_處理。(3)如果一個小方格內酵母菌過多，難以數(shù)清，應采取的措施是_。(4)如果觀察到如圖所示a、b、c、d、e 5個大格共80個小室內共有酵母菌48個，則上述1 mL酵母菌樣品中約有酵母菌_個；要獲得較為準確的數(shù)值，減少誤差，你認為該怎么做？_。【解析】對各小題逐項分析如下題號分析(1)在從試管中吸取酵母菌之前，應將試管輕輕振蕩幾次，目的是使酵母菌在培養(yǎng)液中均勻分布。酵母菌的培養(yǎng)液應置于適

11、宜條件下，并且每隔24小時就要統(tǒng)計一次菌落數(shù)目(2)為了避免雜菌污染，實驗中所用吸管、計數(shù)板等器具需進行滅菌處理(3)(4)解答時要注意以下兩點：統(tǒng)一單位；注意體積的變化。400個小室共容納液體總體積為0.1 mm3，則80個小格容納體積為：2102 mm3，含酵母菌48個，又因酵母菌培養(yǎng)液總體積為100 mL，統(tǒng)一單位后即可求出酵母菌個數(shù)【答案】(1)應將試管輕輕振蕩幾次再吸取酵母菌培養(yǎng)液進行計數(shù)應將酵母菌培養(yǎng)液放置在適宜溫度下培養(yǎng)應連續(xù)七天，每天觀察、取樣計數(shù)并記錄數(shù)據(2)滅菌(3)適當稀釋(4)2.4108多次計數(shù)，求平均值1上題中某同學用一支移液管連續(xù)三次取1 mL菌液進行稀釋，(過

12、程如圖)中間忘記沖洗移液管，計數(shù)結果將()A偏低B偏高C不變 D無法判斷【解析】由于移液管未沖洗，下一次使用時會帶有上次的高濃度菌液，使計數(shù)結果偏高?！敬鸢浮緽土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)圖甲是從土壤中篩選產脲酶細菌的過程，圖乙是脲酶基因轉錄的mRNA部分序列。(1)圖中選擇培養(yǎng)基應以_為唯一氮源；鑒別培養(yǎng)基還需添加_作指示劑，產脲酶細菌在該培養(yǎng)基上生長一段時間后，其菌落周圍的指示劑將變成_色。(2)在5個細菌培養(yǎng)基平板上，均接種稀釋倍數(shù)為105的土壤樣品溶液0.1 mL，培養(yǎng)一段時間后，平板上長出的細菌菌落數(shù)分別為13、156、462、178和191。該過程采取的接種方法是_，每克土壤樣

13、品中的細菌數(shù)量為_108個；與血細胞計數(shù)板計數(shù)法相比，此計數(shù)方法測得的細菌數(shù)較_。(3)現(xiàn)有一菌株的脲酶由于基因突變而失活，突變后基因轉錄的mRNA在圖乙箭頭所示位置增加了70個核苷酸，使圖乙序列中出現(xiàn)終止密碼(終止密碼有UAG、UGA和UAA)。突變基因轉錄的mRNA中，終止密碼為_，突變基因表達的蛋白含_個氨基酸?！緦忣}導析】【精講精析】(1)脲酶能夠催化尿素水解釋放出氨和二氧化碳，因此選擇培養(yǎng)基中應以尿素為唯一氮源。挑取單菌落接種到加有酚紅指示劑的鑒別培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一段時間后，菌落周圍的氨增加，pH升高，酚紅指示劑將變紅。(2)該過程采取的接種方法為稀釋涂布平板法。利用稀釋涂布平板計數(shù)法

14、對細菌進行計數(shù)時，應選擇菌落數(shù)在30300的平板，因此平板上長出的細菌菌落平均數(shù)為(156178191)3175個。每克土壤樣品中的細菌數(shù)為1750.11051.75108。血細胞計數(shù)板計數(shù)法能將死細胞計算在內，而稀釋涂布平板計數(shù)法只能計數(shù)活細胞(只有活細胞才能在平板上生長)，故一般血細胞計數(shù)板計數(shù)法要比稀釋涂布平板計數(shù)法的結果大。(3)箭頭處插入70個核苷酸，箭頭后密碼子的解讀方式為*AG，UGA，GAA對比3種終止密碼可發(fā)現(xiàn)，此處的終止密碼為UGA。從起始密碼到終止密碼之前共有27372個堿基，因此突變基因表達的蛋白含115個氨基酸?！敬鸢浮?1)尿素酚紅紅(2)稀釋涂布平板法1.75少(

15、3)UGA115稀釋平板計數(shù)法的誤差分析(1)稀釋時移液管不沖洗，偏大；(2)平板中菌落數(shù)太多，(可能重復)偏??；(3)稀釋時未混合均勻，可能大可能小。2在做土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)實驗時，甲組實驗用氮源只含尿素的培養(yǎng)基，乙組實驗用氮源除含尿素外還含硝酸鹽的培養(yǎng)基，其他成分都相同，在相同條件下操作、培養(yǎng)與觀察，則乙組實驗屬于()A空白對照B標準對照 C相互對照 D條件對照【解析】本實驗甲組為實驗組，乙組為對照組，給實驗組某種處理，給對照組另一條件的處理，為條件對照?！敬鸢浮緿1噬菌斑(如圖1)是在長滿細菌的培養(yǎng)基上，由一個噬菌體侵染細菌后不斷裂解細菌產生的一個不長細菌的透明小圓區(qū)，它是

16、檢測噬菌體數(shù)量的重要方法之一。 現(xiàn)利用培養(yǎng)基培養(yǎng)并連續(xù)取樣的方法， 得到噬菌體在感染大腸桿菌后數(shù)量的變化曲線(如圖2)，對該曲線的敘述正確的是()A曲線ab段噬菌體數(shù)量不變，說明噬菌體還沒有開始侵染細菌B曲線ab段，細菌內正旺盛地進行細菌DNA的復制和有關蛋白質的合成C曲線bc段所對應的時間內噬菌體共繁殖了10代D限制cd段噬菌斑數(shù)量增加的因素最可能是絕大部分細菌已經被裂解【解析】圖中ab段噬菌斑已有一定數(shù)量，說明噬菌體已開始侵染細菌。bc段噬菌斑增加了10倍，說明噬菌體數(shù)約增加了10倍，而噬菌體繁殖10代，噬菌體數(shù)目應增加到210倍。cd段噬菌斑數(shù)目增加減緩，很可能由于絕大多數(shù)宿主細菌細胞已被裂解?！敬鸢浮緿2菌種鑒定的重要依據是()A細菌的大小、形狀和顏色B菌落的大小、形狀、顏色C有無鞭毛D培養(yǎng)基的不同【解析】不同種類的細菌所形成的菌落在大小、形狀、光澤度、顏色、硬度、透明度等方面