質(zhì)粒分子生物學與質(zhì)粒技術(shù).ppt

1、質(zhì)粒分子生物學與質(zhì)粒技術(shù),第1講 質(zhì)粒分子生物學概論,什么是質(zhì)粒 質(zhì)粒的復制分配和不相容性 質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移 細菌質(zhì)?？刂频谋硇?抗性質(zhì)粒 毒力質(zhì)粒 降解質(zhì)粒 共生質(zhì)粒,1 什么是質(zhì)粒 1.1 定義和命名 質(zhì)粒是染色體以外能自主復制的遺傳因子，不具有胞外期，對寄主細胞來說是非必需的，符合這三條標準的染色體外DNA或RNA分子都可以稱為質(zhì)粒。狹義的質(zhì)粒一般是指細菌染色體外的環(huán)狀DNA分子。質(zhì)粒的命名：一個小寫字母 p 加 2-3 個大寫字母和數(shù)字，如 pJP4，pDTG1,1.2 細菌質(zhì)粒,細菌細胞中染色體以外的共價閉合環(huán)狀DNA分子 (cccDNA)，其大小在1-1700 kb之間。根據(jù)質(zhì)粒控制

2、的性狀，可以把細菌質(zhì)粒分成抗性質(zhì)粒、降解質(zhì)粒、毒力質(zhì)粒和共生質(zhì)粒等類型,1.3 真核生物的DNA質(zhì)粒,環(huán)狀DNA質(zhì)粒：酵母2mm質(zhì)粒，植物線立體中的環(huán)狀DNA質(zhì)粒，人和動物的核DNA質(zhì)粒等，它們都是不知其功能的隱蔽質(zhì)粒。 線狀DNA質(zhì)粒：乳酸克魯維酵母的嗜殺線狀DNA質(zhì)粒，植物線粒體中與雄性不育有關(guān)的線狀DNA質(zhì)粒,1.4 真核生物的RNA質(zhì)粒,有殼體的dsRNA質(zhì)粒：由蛋白質(zhì)殼體包裹，存在于某些真菌和植物細胞中，由于它們酷似病毒，所以也常被稱作真菌病毒和植物隱蔽病毒，或稱類病毒顆粒，典型代表是釀酒酵母的嗜殺dsRNA質(zhì)粒。與RNA病毒的主要區(qū)別是它們不具有感染性 無殼體的dsRNA質(zhì)粒：存在

3、于脂質(zhì)小囊中的栗疫菌減毒dsRNA質(zhì)粒，玉米線粒體中與雄性不育有關(guān)的dsRNA質(zhì)粒,2 質(zhì)粒的復制、分配和不相容性 2.1 復制 (Replication) 質(zhì)粒的復制起始和拷貝數(shù)是由質(zhì)粒DNA序列控制的。質(zhì)粒分子中為質(zhì)粒復制所必需的最小區(qū)段稱為基本復制子，它由兩部分組成，一是復制原點(ori)，二是調(diào)節(jié)復制起始的基因（編碼蛋白質(zhì)或RNA,2.3 不相容性 (Incompatibility) 兩種質(zhì)粒不能在同個寄主細胞中共存的現(xiàn)象，叫質(zhì)粒的不相容性。質(zhì)粒之間的不相容性，是由于它們存在種或幾種與質(zhì)粒復制或分配有關(guān)的相同因子，如基本復制子中的反向轉(zhuǎn)錄區(qū)(ColE1質(zhì)粒的RNA)，ori區(qū)中的重復子

4、(Iteron)，與分配蛋白結(jié)合的分配位點。不相容性是質(zhì)粒分類的理想標準。腸道細菌質(zhì)粒分別屬于30多個不相容組，用Inc表示,3 質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移 通過細胞與細胞之間的接觸，使DNA從一個細胞轉(zhuǎn)移到另外一個細胞的現(xiàn)象叫接合(Conjugation)。這一過程由接合性質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移 (tra) 基因區(qū)編碼。被轉(zhuǎn)移的DNA可以是接合質(zhì)粒本身，也可以是染色體或可誘動的非接合性質(zhì)粒。得到供體DNA的受體細胞稱為接合體或接合子。每個供體細胞所產(chǎn)生的接合體數(shù)稱為接合頻率,3.1 F質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移機制 F質(zhì)粒的分子大小為100 kb，編碼接合轉(zhuǎn)移功能的tra基因區(qū)位于遺傳和物理圖譜的66.6100 kb 位置，編

5、碼37個蛋白質(zhì)和1個反義RNA，這些分子分別負責性菌毛的合成和裝配，雜交對的穩(wěn)定，表面排斥，DNA轉(zhuǎn)移，以及tra區(qū)基因表達的調(diào)節(jié),圖1-10 F質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移區(qū)的結(jié)構(gòu)（66.6-100 kb區(qū)） traA：性菌毛亞基；traN和traG：雜交對穩(wěn)定； traS和traT：表面排斥；traM：轉(zhuǎn)移信號； traY：缺口酶；traI：DNA解旋酶； traD：驅(qū)動單鏈DNA轉(zhuǎn)移；traJ、finO、finP：調(diào)節(jié)基因,3.2 細菌染色體的誘動 細菌的染色體與質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移原點oriT序列共價連接，染色體作為質(zhì)粒DNA的延伸部分被轉(zhuǎn)移?？梢岳眠@一功能定位染色體基因，以及獲得含有染色體片段的質(zhì)粒,3.3

6、 非接合質(zhì)粒的誘動 許多天然質(zhì)粒雖然是非接合性的，但仍然含有一個oriT位點和轉(zhuǎn)移基因，當與它共存的接合質(zhì)粒提供一個接合系統(tǒng)時，也能進行有效的轉(zhuǎn)移，稱之為誘動 (Mobilization,4 細菌質(zhì)?？刂频谋硇?4.1 抗性質(zhì)粒 包括抗菌素抗性（R）質(zhì)粒和金屬抗性質(zhì)粒。R質(zhì)粒的進化、轉(zhuǎn)移和擴散給抗菌素治療帶來很大麻煩，是醫(yī)學所面臨的重大問題之一。R質(zhì)粒與轉(zhuǎn)座子（Transposon）和整合子（Integron）的相互作用，使細菌耐藥性問題更加嚴重,4.2 毒力質(zhì)粒 許多細菌的致病力和毒性與質(zhì)粒有關(guān)，如大腸桿菌腸毒素和定居抗原，破傷風毒素，炭疽毒素，溶血毒素，蘇云金芽孢桿菌的殺蟲晶體蛋白，植物冠

7、癭病（Ti質(zhì)粒）和發(fā)根?。≧i質(zhì)粒,4.3 降解質(zhì)粒 許多環(huán)境污染物的降解途徑由質(zhì)粒基因編碼，降解基因組成幾個操縱子，操縱子的表達受調(diào)節(jié)基因控制。目前，已經(jīng)測定全序列并注釋基因的降解質(zhì)粒有10余種，分別是尼龍寡聚體降解質(zhì)粒pOAD2，芳香烴降解質(zhì)粒pNL1，除草劑阿特拉津降解質(zhì)粒pADP-1，甲苯降解質(zhì)粒pWWO，煙堿降解質(zhì)粒pAO1，咔唑降解質(zhì)粒pCAR1, 異丙基苯降解質(zhì)粒pBD2，鹵乙酸降解質(zhì)粒pUO1，2,4-D降解質(zhì)粒pJP4，萘降解質(zhì)粒pND6-1和pDTG1,The catabolic plasmids that complete sequence has been determ

8、inedPlasmid Substrates Strain Size (bp) Catabolic References genespOAD2 Nylon Flavobacterium K172 45519 nylA Microbiology oligomers nylBC 1995,141:2585pNL1 Biphenyl,naphthalene Sphingomonas 184457 pbh, xyl, J. Bacteriol. m-xylene, p-cresol aromaticivorans F199 nah, pch 1999,181:1585pADP-1 Atrazine P

9、seudomonas ADP 108845 atzA,atzB J. Bacteriol. atzC,atzDEF 2001,183:5684pWWO Xylene,Toluene P. putida mt-2 116580 xyl Envi. Microbiol. 2002,4:856pAO1 Nicotine Arthrobacter 165137 ndh, 6hlno J. Bacteriol. nicotinovorans kdh, dhph 2003,185:1976pCAR1 Carbazole P. resinovorans CA10 199035 carABCDEF J. Mo

10、l. Biol. antABC 2003,326:21pBD2 Isopropylbenzene Rhodococcus 210205 ipbA1A2A3A4 J. Bacteriol. Erythropolis BD2 2003,185:5269pUO1 Haloacetates Delfitia 67066 dehH1, dehH2 J. Bacteriol. Acidovorans B 2003,185:6741pJP4 2,4-D Ralstonia 87688 tfdA, tfdB Envi.Microbiol. 3-chlorobenzoate eutropha JMP134 tf

11、dCDEF 2004,6:655pND6-1 naphthalene Pseudomonas ND6 101858 nah Gene 2004,336:231pDTG1 naphthalene P. putida 83042 nah J. Mol. Biol. NCIB 9816-4 2004,341:753,4.4 共生質(zhì)粒 在許多根瘤菌屬細菌中存在與結(jié)瘤和固氮有關(guān)的共生質(zhì)粒，質(zhì)粒的大小在1000 kb以上，與細菌染色體基因一起行使固氮功能。Sinorhizobium meliloti 的豆科共生復合基因組由3部分組成：染色體為3654135 bp，pSymA為1354226 bp（結(jié)瘤和固

12、氮），pSymB為1683333 bp,中華苜蓿根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）1021的基因組組成 性質(zhì) 染色體 pSymA pSymB 基因組 長度(bp) 3654135 1354226 1683333 6691694 蛋白基因 3341 1293 1570 6204 tRNA基因 51 2 1 54 rRNA操縱子 3 0 0 3 共生功能 菌毛合成 菌毛合成 表面多糖 結(jié)瘤，固氮 表面多糖 固氮,第2講 質(zhì)粒技術(shù)1. 質(zhì)粒的分離和純化2. 質(zhì)粒的拷貝數(shù)測定3. 質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化4. 細菌雜交實驗5. 質(zhì)粒的限制酶作圖6. 質(zhì)粒基因定位7. 質(zhì)粒測序和基因注釋8.

13、質(zhì)?？寺≥d體,1 質(zhì)粒的分離和純化 分離：SDS溫和裂解法；堿SDS室溫裂解法；堿SDS加熱 (5065) 裂解法；煮沸裂解法；堿SDS蛋白酶裂解法。 純化: CsClEB密度梯度離心法 (角轉(zhuǎn)頭：40000rpm, 40h；近垂直轉(zhuǎn)頭：78000rpm, 4.5h)；低熔點瓊脂糖凝膠回收法；凝膠凍溶法；凝膠透析袋回收法；凝膠透析膜回收法；純化kit,細胞裂解物進行瓊脂糖凝膠電泳，熒光掃描染色體DNA帶和質(zhì)粒DNA帶，根據(jù)峰面積計算質(zhì)粒占總DNA的百分數(shù)(RP)。 RP = (1.36質(zhì)粒峰面積)(染色體峰面積+1.36質(zhì)粒峰面積) 測定一個細胞中總DNA的含量 (Mc = DNA的g數(shù)細胞數(shù)

14、)。 計算一個質(zhì)粒的質(zhì)量： MP = 質(zhì)粒 bp 數(shù)6601.6510-24 g 計算質(zhì)粒拷貝數(shù)：CP = (MCRP)MP,2 質(zhì)粒的拷貝數(shù)測定（凝膠帶熒光光密度測定法,3 質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化主要有3種方法：鈣誘導的感受態(tài)轉(zhuǎn)化，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，電穿孔轉(zhuǎn)化。影響轉(zhuǎn)化的因素：質(zhì)粒的大小、純度、濃度、構(gòu)型、穩(wěn)定性和是否被修飾；受體細胞的菌齡、用量、限制-修飾系統(tǒng)和重組功能，是否有不相容性質(zhì)粒，與質(zhì)粒原來寄主的親源關(guān)系；篩選藥物的濃度。 轉(zhuǎn)化頻率（transformation frequency）：每個活細胞產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子數(shù)，測定時使用飽和DNA濃度。 轉(zhuǎn)化效率（transformation ef

15、ficiency）：每 mg DNA產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子數(shù)，測定時使用亞飽和DNA濃度,4 細菌雜交實驗 濾膜雜交：混合供體和受體菌培養(yǎng)物，用孔徑為0.45mm的濾膜過濾，帶菌的濾膜在營養(yǎng)平板上培養(yǎng)過夜，用無菌水洗下膜上的細菌，涂選擇平板，篩選接合體。 平板雜交：在選擇平板上涂布供體菌和受體菌的混合物或分別劃線受體菌和供體菌，培養(yǎng)過夜，長出的菌落為接合體。 液體雜交：靜止培養(yǎng)供體菌和受體菌的混合物，然后涂選擇平板，篩選接合體。 例：PpG378 (Leu-Nah+) PpG376 (Leu+Nah,5 質(zhì)粒的限制酶作圖 制作質(zhì)粒限制圖的方法主要有直接酶切法、重疊片段克隆法和測序法。直接酶切法是通過限制

16、酶的完全消化和部分消化，確定各種限制酶切割位點在質(zhì)粒中的位置，適用于小質(zhì)粒；重疊片段克隆法是先進行限制片段的克隆，確定每個克隆片段的限制酶位點，以及各克隆片段在質(zhì)粒中的排列順序，最后得到整個質(zhì)粒的限制圖，適合于較大的質(zhì)粒。最理想的方法是先測定質(zhì)粒的核苷酸序列，然后根據(jù)限制酶的識別序列用計算機作圖，適合于所有質(zhì)粒，特別是巨型質(zhì)粒,pND1.860質(zhì)粒的限制酶作圖 （重疊片段克隆法） 作圖策略： Hind、EcoR和Xba單酶消化：測定限制片段大小和切點數(shù)。 Hind完全消化片段克隆Hind + EcoR消化：確定Hind片段中的EcoR位點 Hind部分消化片段克?。?Hind消化，確定Hind

17、片段排列順序 EcoR消化，確定EcoR位點 EcoR+ Xba消化，確定Xba位點,6 質(zhì)?；蚨ㄎ唬恨D(zhuǎn)座子插入突變法 把攜帶轉(zhuǎn)座子的質(zhì)粒引入含有待測質(zhì)粒的細胞中，篩選并收集含有插入突變的細胞，通過限制酶分析確定插入位點，然后測定含有轉(zhuǎn)座子插入的細胞其待測基因是否失活，從而確定基因的大概位置,圖2-10 阿特拉津氯水解酶基因atzA的定位,7 質(zhì)粒測序和基因注釋(annotation) 質(zhì)粒測序：用鳥槍克隆法，將純化的質(zhì)粒用超聲波打碎，用瓊脂糖凝膠電泳分離 1-kb片段，補平片段末端，與平末端pUC18連接，電轉(zhuǎn)化 E. coli DH5，篩選有插入片段的轉(zhuǎn)化子，測定克隆片段的序列，根據(jù)測序結(jié)果拼接質(zhì)粒序列，空缺部分用PCR方法補齊并測序。 質(zhì)?；蜃⑨專合騁enBank注冊質(zhì)粒序列，報告每個編碼序列（CDS，或稱ORF）的基因名稱、位置、功能和翻譯產(chǎn)物,哺乳動物細胞表達載體 載體的類型： 自主復制的瞬時表達載體：帶有真核病毒復制子。 與寄主基因組整合的表達載體：不含病毒復制子,哺乳動物細胞表達載體的功能元件： 原核細胞復制原點和篩選基因 (抗生素抗性)。