熒光定量PCR之絕對(duì)定量分析——標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1、熒光定量PCR之絕對(duì)定量分析一一標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制1. 絕對(duì)定量定義絕對(duì)定量是用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)推算未知樣品的量將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至不同濃度，作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù) 的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以測(cè)得的CT值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)未知樣品進(jìn)行 定量時(shí)，根據(jù)未知樣品的CT值，即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到樣品的拷貝數(shù)。* Log（起始濃度）與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過(guò)已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo) 準(zhǔn)曲線，即得到該擴(kuò)增反應(yīng)存在的線性關(guān)系*由樣品CT值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量2. 絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品的一些標(biāo)準(zhǔn)*必須用與擴(kuò)增目的基因相同的引物進(jìn)行擴(kuò)增，并且擴(kuò)增效率相同*標(biāo)準(zhǔn)品必須是經(jīng)過(guò)準(zhǔn)

2、確定量的（我們通常用的是ASP-3700紫外光/可見(jiàn)光微量分光光度計(jì)）*標(biāo)準(zhǔn)品必須是標(biāo)準(zhǔn)化的（例如，同一化的細(xì)胞數(shù)）*在每組實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須用相同的閾值設(shè)定來(lái)確定 CT值標(biāo)準(zhǔn)品可以是含有目的基因的線性化的質(zhì)粒 DNA，也可以是比擴(kuò)增片 段長(zhǎng)的純化后的PCR產(chǎn)物，當(dāng)然也可以是基因組 DNA，甚至cDNA，但前提是 所有的作為標(biāo)準(zhǔn)品的核酸都必須保證穩(wěn)定。3. 標(biāo)準(zhǔn)品的制備RNA- dNAPCR*4K哼/ *一般一條標(biāo)準(zhǔn)曲線取四到五個(gè)點(diǎn)，濃度范圍要能覆蓋樣品的濃度區(qū)間，以保 證定量的準(zhǔn)確性。一般一個(gè)點(diǎn)重復(fù)三至五次，對(duì)于常期穩(wěn)定使用的標(biāo)準(zhǔn)品可以適 當(dāng)減少重復(fù)的次數(shù)。倍比梯度稀釋方法：1v原液(標(biāo)準(zhǔn)品i)

3、+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品ii1v標(biāo)準(zhǔn)品ii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iii1v標(biāo)準(zhǔn)品iii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iv1v標(biāo)準(zhǔn)品iv+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品v 依次倍比稀釋拷貝數(shù)的計(jì)算：詳見(jiàn)核酸拷貝數(shù)的計(jì)算4. 實(shí)例標(biāo)準(zhǔn)品的制作：將標(biāo)準(zhǔn)品依次進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)珹SP-3700測(cè)得其拷貝數(shù)1.55X810 copy /ul標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制(1cycle=1mi n)設(shè)置對(duì)照：濃度為1.55X107、1.55X106、1.55X105、1.55X104、1.55X103、1.55X 102、1.55X 101的標(biāo)準(zhǔn)樣品各一個(gè)，設(shè)空白對(duì)照PCR反應(yīng)：以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品作為模板標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線標(biāo)準(zhǔn)品的

4、溶解曲線標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖亠 U-UO*EA POU31U5-34.29-3 23xS r 0.2l533fi50 r r th彌頤軸,.XLog7654321YCT值12.0114.8917.9221.1824.5627.8931.25擴(kuò)增效率（E）計(jì)算：E=10-1/斜率=10-1/-3.23=2.04, E%=（2.04-1）X 100%=104%若未知樣本的CT值為19.11，將CT值代入線性方程：即 19.11=34.29-3.23X，所以 X=（19.11-34.29）/（-3.23）=4.74 7Qua ntity unkno w=10 =50118 copie

5、s核酸拷貝數(shù)的計(jì)算一、分步推理如何計(jì)算核酸拷貝數(shù)1A260 吸光度值=dsDNA 50ug/ml=ssDNA 33ug/ml=ssRNA 40ug/ml核酸濃度=（OD260）x （dilution factor） x 33 或 40 或 50=ng/ulMW 代表 克/摩爾，單位dolton： 1dolton即表示1g/mol1摩爾=6.02x1023摩爾分子（拷貝數(shù)）平均分子量（MW） : dsDNA=（堿基數(shù)）x （660道爾頓/堿基）ssDNA=（堿基數(shù)）x （330 道爾頓/堿基）ssRNA=（堿基數(shù)）x （340道爾頓/堿基）得到拷貝數(shù)計(jì)算公式：（6.02x1023拷貝數(shù)/摩爾）x

6、 （濃度）/（MW g/mol）= copies/ml.即（6.02X102） x （g/ml）/（DNA length x 660）=copies/ml.或（6.02x 1023） x （ng/ul x 10-9）/（DNA length x 660）=copies/ul.例：3000堿基質(zhì)粒，濃度100 ng/ulMW=3000bp x 660dalton/bp=1.98x 10 daltons,即 1mol=1.98 x 10 g（100 ngx 10-9）g/1.98x 106 =摩爾數(shù)copy數(shù)=摩爾數(shù)x 6.02x 1023 = 3x 1010copies/ul.二、這是一個(gè)小小的計(jì)算器，使你計(jì)算更加方便快捷，免去算數(shù)之苦http:/www.bioask.me/html/541.html什么是拷貝數(shù)？www.bioask.c n/html/540.html如何計(jì)算拷貝數(shù)？計(jì)算方法：（6.02x 1023拷貝數(shù) /摩爾）x （濃度 g/ml） / （MW g/mol） =