淡紫擬青霉菌株防治燈盞花根結線蟲病的效果

1、淡紫擬青霉菌株防治燈盞花根結線蟲病的效果根結線蟲是一類危害大、分布廣且難以防治的重要病原線蟲，生產上防治該病害主要以化學殺線蟲劑為主，由于化學殺線蟲劑對環(huán)境污染嚴重，使用過程中對人、畜也不安全，因此許多化學殺線蟲劑已被禁用。淡紫擬青霉 Paecilomyces lilacinus（Thom.）Samson是土壤及多種植物根系的習居菌，Samson1974年在秘魯首先從根結線蟲卵囊上分離到該菌，Jatala博士1979年首次發(fā)現該菌對南方根結線蟲卵寄生率高達60%-70%.Cayrol等1989年報道了淡紫擬青霉的培養(yǎng)濾液含有殺線蟲物質,被各國學者廣泛應用于根結線蟲生防并成為商品。近年來，國內研

2、究者也對該菌作了大量的生防研究,亦證實該菌對根結線蟲有較高的寄生率，能有效控制土壤中根結線蟲的數量，明顯減少危害，其代謝產物對多種作物具有生理活性。為了開發(fā)利用生防菌物資源，作者近年來篩選出寄生根結線蟲的淡紫擬青霉高效菌株YC0447菌株，通過室內測定及盆栽試驗對淡紫擬青霉YC0447菌株防治燈盞花根結線蟲病的效果進行了初步研究，為進一步田間試驗提供依據。1、材料與方法1.1淡紫擬青霉對燈盞花根結線蟲卵的寄生率測定淡紫擬青霉YC0447菌株從煙草爪哇根結線蟲（Meloidogyne javanica）卵中分離得到。將生長10d的PDA平板上的淡紫擬青霉YC0447菌株孢子用滅菌水洗下，配成2.

3、5×106個/mL孢子懸浮液。根結線蟲采自云南個舊燈盞花植株。將根結線蟲在番茄上繁殖，待其產卵后，隨機取嫩根上早期發(fā)育的卵囊，用1%次氯酸鈉表面消毒后，用滅菌水洗3次，備用。參照Nitao等的方法將根結線蟲卵配制成密度為2500個/mL的卵懸浮液，吸取100μL根結線蟲卵懸浮液和10μL孢子懸浮液，于2%水瓊脂平板上混勻，而后輕輕涂布，以滅菌水為對照，重復3次，置于25下培養(yǎng)12d,每天鏡檢寄生率情況。1.2淡紫擬青霉發(fā)酵液對燈盞花根結線蟲2齡幼蟲的致死作用（1）發(fā)酵液的制備將50mL微量培養(yǎng)基+1%雞蛋黃的液體培養(yǎng)基裝入500mL三角瓶中，滅菌、冷卻后，接種4塊3mm

4、×3mm的淡紫擬青霉菌塊，在28 黑暗條件下180r/min振蕩培養(yǎng)5d.用無菌濾紙過濾，濾液經4 000r/min離心，除去菌絲，取上清液即為發(fā)酵粗提液用于活性測定。（2）殺線蟲活性測定在裝有1.5mL發(fā)酵粗提液的小凹玻皿中，加入備好的燈盞花根結線蟲2齡幼蟲5070條，將小凹玻皿放入大培養(yǎng)皿中保濕，置于25 恒溫箱中，分別于12h,24h,36h,48h后檢測線蟲的死亡率。設無菌的空白培養(yǎng)基和無菌水作對照，重復3次，計算各處理的死線蟲數和統計校正死亡率。死亡率統計方法參考蓋鈞鎰等的方法.-:校正死亡率10%以下；+:校正死亡率11%30%;+:校正死亡率31%50%;+:校正死亡

5、率51%80%;+:校正死亡率大于80%線蟲死活的鑒別采用NaCI檢測法,用細挑針挑取僵直的線蟲，置于2%NaCI中5min后，假死線蟲僵直的蟲體彎曲并開始運動，死亡的線蟲蟲體仍保持僵直不動。殺線蟲活性強弱的分級按Chan-dravadana等的方法。1.3淡紫擬青霉對燈盞花根結線蟲的盆栽防治效果試驗在溫室大棚內進行，供試菌孢子含量為1.47×1011個/g的淡紫擬青霉YC0447菌株麥粒菌劑，燈盞花根結線蟲為南方根結線蟲（M.incognita）。栽培基質為腐質土、無病土、煙草漂浮育苗專用肥按25:50:1比例混合配成，每盆1株。從感染燈盞花根結線蟲的番茄病根上剪取新鮮根結，移栽

6、時將40g病土+30個新鮮根結+20g1施于每株燈盞花根部。對照為40g病土+30個新鮮根結+20g麥粒。每一處理設20盆。接菌后按常規(guī)管理，于接種后60d將全部處理植株扣盆倒出，統計株高和地上部鮮重、根鮮重，并進行根結嚴重度分級,計算病情指數和防治效果。2、結果與分析2.1淡紫擬青霉對燈盞花根結線蟲卵的寄生效果在水瓊脂平板上混合接種淡紫擬青霉YC0447菌株孢子和線蟲卵，8 d后觀察有44.62%的卵被寄生，隨著時間的延長，卵的寄生率不斷加快，12d后觀察有83.50%的卵被寄生，對照中的卵和處理中未被寄生的卵發(fā)育和孵化也相應加快。光學顯微鏡觀察發(fā)現接種淡紫擬青霉3d后菌絲侵入卵中，56d后

7、卵殼表面布滿菌絲，表面粗糙，8d后卵粒變形變軟，卵完全被淡紫擬青霉菌絲所包裹。2.2淡紫擬青霉發(fā)酵液的殺線蟲活性不同濃度淡紫擬青霉發(fā)酵液對燈盞花根結線蟲2齡幼蟲致死活性測定結果見表1.從表1中可以看出，淡紫擬青霉發(fā)酵液對燈盞花根結線蟲致死效果較好。當發(fā)酵液濃度稀釋到40%時，48h后的校正死亡率達80%以上（+）；在濃度為60%時，校正死亡率與濃度為80%時差別不大。說明發(fā)酵液稀釋到60%時的殺線蟲效果最佳。2.3淡紫擬青霉發(fā)酵液致死的根結線蟲2齡幼蟲死亡狀態(tài)觀察經淡紫擬青霉發(fā)酵液處理12h,24h,36h,48h的根結線蟲2齡幼蟲用2%NaC1檢測其死亡情況，并觀察蟲體結構的變化。用發(fā)酵液處

8、理1h后，線蟲的活動變得遲鈍，僵直假死的根結線蟲經2%NaC1處理5min后蟲體恢復彎曲并開始運動。12h后的線蟲僵直并死亡，能看出其內部結構發(fā)生微小的變化，線蟲的體腔內部結構部分消解，同時產生液泡。24h后可以清楚地觀察到死亡的線蟲的體腔內部結構產生大量消解，體壁與腸分離。48h后從口腔開始變得模糊，有的看不清口針，食道模糊，尾部的內部結構與體壁分離，體腔內部結構幾乎完全消解。2.4淡紫擬青霉對燈盞花根結線蟲病的防治效果盆栽試驗結果（表2）表明，防治的平均株高比對照高9cm,地上、地下部鮮重顯著高于對照，100g土中幼蟲數量明顯減少，病情指數降低，花數增加，防治效果為64.7%.經防治的燈盞

9、花根系發(fā)達、健壯,而未防治的燈盞花根系較稀疏，嫩根上1.防治的燈盞花根系只有少量根結出現于老根和上部根上，其病情指數明顯低于對照。由此推測，淡紫擬青霉菌劑對根有一定的保護作用，在控制根結線蟲再侵染過程中發(fā)揮了重要作用。3、討論本研究表明，淡紫擬青霉YC0447菌株對燈盞花根結線蟲分散卵的寄生率為83.50%,對卵囊的寄生率未做測定。陳淑鴻等采用雙溫測定法，測得淡紫擬青霉對爪哇根結線蟲卵囊和分散卵粒的相對孵化率分別為57.4%和23.75%.汪來發(fā)等認為這可能與菌絲寄生卵的機制有關，在寄生過程中孢子要先附著在卵表面萌發(fā)，繼而菌絲發(fā)育而纏繞整個卵，而卵囊中的粘性基質更有利于孢子的附著萌發(fā)和菌絲發(fā)育

10、，分散卵由于受表面消毒的影響，沒有了粘性基質且部分卵始終不能孵化.盆栽試驗以新鮮根結、病土和淡紫擬青霉混合接種，比較符合田間實際，未設計不同劑量處理，需進一步探討多個劑量處理試驗，為田間試驗施用劑量提供依據。淡紫擬青霉自然寄生率低，為了開發(fā)生防菌物資源，研究者們對該菌作了大量的生防研究，目前已廣泛應用于防治根結線蟲、孢囊線蟲等有害植物線蟲的防治實踐中。但由于土壤存在不同程度的抑菌現象及菌株本身與植物根部親和力的影響，這是應用生防菌防治植物寄生線蟲不穩(wěn)定的重要原因.因此有必要從生防菌次生代謝物中尋找具有活性的物質。Park等在淡紫擬青霉發(fā)酵液中檢測到灰白制菌素 （Leucinostatin）的產生，且具有殺線蟲活性.淡紫擬青霉發(fā)酵液中檢測到6種具有內切活性的幾丁質酶，灰白制菌素同幾丁質酶相結合，可作為篩選高效淡紫擬青霉生產菌株的指標.此外淡紫擬青霉發(fā)酵液還具有類似生長素和細