腫瘤組織庫(kù)的建立與管理課件

1、腫瘤組織庫(kù)的建立與管理,腫瘤組織庫(kù)的建立與管理,研究目的,探討分子生物學(xué)研究中腫瘤庫(kù)的建庫(kù)條件，標(biāo)本的采集、保存和質(zhì)量控制，以及腫瘤庫(kù)的信息化管理等有關(guān)問(wèn)題，創(chuàng)建腫瘤組織標(biāo)本庫(kù)，保護(hù)和合理利用腫瘤的標(biāo)本資源，為臨床和科學(xué)研究人員，提供合適數(shù)量的腫瘤標(biāo)本促進(jìn)腫瘤的研究,腫瘤組織庫(kù)的建立與管理,目錄,建庫(kù)理論基礎(chǔ) 材料與方法 結(jié)果 討論 致謝,腫瘤組織庫(kù)的建立與管理,理論基礎(chǔ),一、建立組織庫(kù)的三種模式 1.“銀行”模式 2.臨床試驗(yàn)?zāi)Ｊ?3.前瞻性收集模式,腫瘤組織庫(kù)的建立與管理,理論基礎(chǔ),銀行”模式的組織庫(kù)：按照一定的標(biāo)準(zhǔn)化運(yùn)轉(zhuǎn)程序（standard operating processeds,

2、SOPs）規(guī)范人體組織的收集、加工和儲(chǔ)存。 組織標(biāo)本形式：通常為低溫冷凍組織或蠟塊。 缺點(diǎn)：不能提供新鮮的、未被冰凍的人體組織，亦不能提供某些有特殊加工需求的組織樣本。不能滿足研究者對(duì)組織塊的個(gè)性化需求。 優(yōu)點(diǎn)：可向研究者提供大量的組織樣本，并且這些組織均有相關(guān)的臨床信息和流行病學(xué)信息,腫瘤組織庫(kù)的建立與管理,理論基礎(chǔ),臨床試驗(yàn)?zāi)Ｊ剑菏恰便y行“模式的一個(gè)亞型，是由一個(gè)或多個(gè)臨床試驗(yàn)收集的標(biāo)本構(gòu)成的標(biāo)本庫(kù)。 缺點(diǎn)：其內(nèi)組織標(biāo)本的應(yīng)用受限于倫理委員會(huì)的要求，無(wú)法被廣泛的應(yīng)用與其他臨床研究。同樣，組織的大小、采集及加工的方法也不能滿足所有研究者的需求,腫瘤組織庫(kù)的建立與管理,理論基礎(chǔ),前瞻性收集模式

3、：研究者指定需要的組織類(lèi)型，同時(shí)也制定出所需的組織采集、處理及儲(chǔ)存方法。 缺點(diǎn)：沒(méi)有現(xiàn)成的大量的組織標(biāo)本以及臨床資料，因?yàn)榻M織需要前瞻性的去收集。 優(yōu)點(diǎn)：研究者能獲得他們需要的組織樣本，能夠滿足其研究的個(gè)性化需求,腫瘤組織庫(kù)的建立與管理,理論基礎(chǔ),二、組織收集 盡量縮短和記錄手術(shù)摘除或從手術(shù)室轉(zhuǎn)移到標(biāo)本庫(kù)的時(shí)間間隔很重要 Spruessel等人報(bào)道，組織離體后30分鐘內(nèi)稱80%基因變化少于2個(gè)折疊1 Maine等人報(bào)道，前列腺組織離體1小時(shí)內(nèi)僅有不到1%基因發(fā)生了變化2 術(shù)后標(biāo)本在體外保存5分鐘和60分鐘相比，其mRNA變化不明顯3,1.Spruessel A, Steinmann G, Ju

4、ng M, Lee SA, Carr T, Fentz AJ, Spangenberg J, Zornig C, Juhl HH, David KA. Tissue ischemia time affects gene and protein expression patterns within minutes following surgical tumor excision.Biotechniques.2004;36(6):10301037. 2. Maine IP, Varambally S, Shen R, Chinnaiyan M, Rubin MA. Changes in diff

5、erential gene expression because of warm ischemia time of radical prostatectomy specimens.Am J Pathol.2002;161(5):17431748. 3. Huang J, Qi R, Quackenbush J, Dauway E, Lazaridis E, Yeatman T. Effecs of ischemia on gene expression.J Surg Res.2001;99:222227,腫瘤組織庫(kù)的建立與管理,理論基礎(chǔ),三、組織儲(chǔ)存 北京大學(xué)季加孚等研究發(fā)現(xiàn)：手術(shù)后1 h內(nèi)取

6、材的組織經(jīng)過(guò)3年低溫保存，90以上的標(biāo)本仍有清晰的28S和18S RNA條帶，提示RNA完整性較好4 DNA分子穩(wěn)定性較mRNA好，在-80環(huán)境中保存5年，DNA完整性良好5,4.季加孚北京大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院腫瘤標(biāo)本庫(kù)的建設(shè)J北京大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2005，37(3)：329330 5.張佳年， 于穎彥， 計(jì)駿.等. 低溫凍存時(shí)間對(duì)腫瘤組織生物大分子的影響J. 診斷學(xué)理論與實(shí)踐 2009，V018，No1,腫瘤組織庫(kù)的建立與管理,材料與方法,腫瘤組織庫(kù)庫(kù)房，放置液氮罐、冰箱、冰柜等冷凍設(shè)備，用于存放標(biāo)本；分子生物室（中心實(shí)驗(yàn)室）用于提取血清、血漿、分離淋巴細(xì)胞。 庫(kù)房設(shè)備：液氮罐1個(gè)（YDS-3

7、0，沈陽(yáng)新光）， -80立式超低溫保存箱2臺(tái)（DW-86L628，青島海爾），4-20冰柜1臺(tái)（BCD-130Eb，青島海爾）；聯(lián)想電腦、條碼掃描器、條碼打印機(jī)1套（BP-IP300，德國(guó)BRADY）等,腫瘤組織庫(kù)的建立與管理,庫(kù)房,腫瘤組織庫(kù)的建立與管理,生物樣本庫(kù)資源信息管理系統(tǒng),腫瘤組織庫(kù)的建立與管理,主要設(shè)備,BRADY條碼打印機(jī),液氮罐,海爾-80冰箱,腫瘤組織庫(kù)的建立與管理,患者入院后行生物安全性檢查。檢測(cè)HIV以及嗜肝病毒HBV及HCV感染情況。HIV感染患者不列為采集對(duì)象。HBV及HCV感染者需在標(biāo)本上明確注明。 尊重患者的知情權(quán)和隱私權(quán)，在向患者及家屬介紹標(biāo)本采集和使用目的，

8、獲得患者自愿簽署知情同意書(shū)后，方可安排標(biāo)本采集和數(shù)據(jù)錄入,腫瘤組織庫(kù)的建立與管理,組織采集,手術(shù)結(jié)束后，標(biāo)本離體30分鐘內(nèi)完成，在臨床腫瘤專(zhuān)家的指導(dǎo)下，在不影響病理診斷取材需要的前提下，采集組織樣本。 1）標(biāo)本取材部位：腫瘤組織、癌旁組織（癌組織旁1cm）和正常組織（癌組織旁5cm及以外或最遠(yuǎn)處）。 2）過(guò)程：使用數(shù)碼相機(jī)拍攝標(biāo)本外觀后，將標(biāo)本切成小塊（直徑0.50.5cm，厚度0.5cm），為減少處理時(shí)間，標(biāo)本不應(yīng)切得太小，然后放入無(wú)菌凍存管內(nèi)，做好標(biāo)記，記錄標(biāo)本采集的時(shí)間及標(biāo)本的類(lèi)型。每例病人樣本保存35份凍存管標(biāo)本。每份組織重量原則不低于2g。 3）標(biāo)本凍存管標(biāo)記后直接凍存于液氮中，后轉(zhuǎn)

9、移至-80冰箱中。標(biāo)本運(yùn)送過(guò)程中，將其置于冰中保存,腫瘤組織庫(kù)的建立與管理,術(shù)前血：指臨床診斷明確，患者未經(jīng)任何治療，即放療、化療及免疫治療等，已接受上述治療的患者樣本需詳細(xì)注明。 術(shù)后血：指接受手術(shù)后2周，患者未接受任何放療、化療或免疫治療等,腫瘤組織庫(kù)的建立與管理,1、取血液標(biāo)本，每例采集10ml（不少于5ml），約10ml全血平均分裝于紅帽管（不含抗凝劑，1管）和紫帽管（含2%EDTA抗凝劑，2管）中。 2、紅帽管用于分離血清，室溫放置30分鐘后離心；紫帽管用于分離血漿及淋巴細(xì)胞。 3、1500r/min離心10分鐘，此時(shí)懸液分層，上層淡黃色為血清（紅帽管）或血漿（紫帽管），底層為紅細(xì)胞

10、，紫帽管中中層呈灰白色的為外周血淋巴細(xì)胞。 4、輕輕吸取淡黃色上層血清（血漿）放入1.5ml離心管中，每管200l，共12管（血清6管，血漿6管），做好標(biāo)記。 5、新鮮抗凝血（含2%EDTA抗凝）去血漿后，按照1:1比例加入PBS液混勻。 6、15ml離心管內(nèi)先加入3ml淋巴細(xì)胞分離液，后加入6ml稀釋樣品，注意加入樣品要緩慢進(jìn)行，不要沖破液面，影響離心效果。202下2000r/min離心20分鐘。 7、離心后血樣分四層，將移液管插入液面，輕吸灰白色的淋巴細(xì)胞層，放入另一15ml離心管中，注意吸取過(guò)程中避免吸入分層液和血漿。 8、按1:5的比例向淋巴細(xì)胞中加入PBS液，混勻洗滌，室溫1000r

11、/min離心10min。 9、棄去上清液保留底部沉淀，適用1.5mlPBS液吹打洗滌，置入標(biāo)記好的1.5ml細(xì)胞凍存管中，高速離心機(jī)500r/min離心5分鐘。 10、棄去上清液保留底部沉淀，血清、血漿及淋巴細(xì)胞分裝完畢后貼好二維標(biāo)簽,腫瘤組織庫(kù)的建立與管理,質(zhì)量控制,樣本DNA完整性檢測(cè) 方法一：提取樣本基因組DNA，檢測(cè)OD260/OD280值。進(jìn)行0.7%瓊脂糖凝膠電泳。通過(guò)DNA電泳判斷組織標(biāo)本的基因組是否完整。無(wú)基因組DNA或DNA出現(xiàn)明顯降解為不可用樣本。 方法二：通過(guò)PCR選擇擴(kuò)增管家基因，如GAPD、HHPRT、-actin，分析擴(kuò)增產(chǎn)物的含量。產(chǎn)物含量相對(duì)較少或無(wú)產(chǎn)物，可判斷

12、為不可使用標(biāo)本,腫瘤組織庫(kù)的建立與管理,質(zhì)量控制,樣本RNA完整性檢測(cè) 方法一：參照Trizol 試劑盒操作指南進(jìn)行組織總RNA 的提取。應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)260 nm、280 nm OD值定量分析RNA（OD 260/OD 280為1.7-2.0）；1%瓊脂糖凝膠電泳后觀察5 S、18 S和28 S條帶情況。28 S和18 S條帶亮度的比值約2:1，表明標(biāo)本中的RNA完整性較好。出現(xiàn)降解者為不可用樣本。 方法二：RT-PCR擴(kuò)增-actin、HHPRT管家基因，分析擴(kuò)增產(chǎn)物的含量，產(chǎn)物含量相對(duì)較少或無(wú)產(chǎn)物可判斷為不可用樣本。 方法三：Northern Blot檢測(cè)-actin、HHPRT管

13、家基因，無(wú)印記者列為不可使用樣本,腫瘤組織庫(kù)的建立與管理,蛋白質(zhì)完整性檢測(cè) 蛋白質(zhì)完整性通過(guò)Western Blot進(jìn)行檢測(cè)，檢查標(biāo)本樣本中-actin的蛋白表達(dá)量變化，通過(guò)分析印記條帶，判斷蛋白量是否有變化，無(wú)條帶或條帶變?nèi)跽邽榘l(fā)生組織降解樣本,腫瘤組織庫(kù)的建立與管理,結(jié)果,自2010年7月建庫(kù)以來(lái)共收集保存了各類(lèi)腫瘤（胃癌、結(jié)腸癌、直腸癌、甲狀腺癌、胃腸道間質(zhì)瘤等）患者的組織標(biāo)本1333例，胃癌患者424例，直腸癌267例，結(jié)腸癌246例，甲狀腺腫瘤254例，胃腸道間質(zhì)瘤45例，其他類(lèi)型腫瘤97例。 標(biāo)本總量11919份，其中包括腫瘤組織1170份，腫瘤旁組織900份，正常組織1113份，血清3923份，血漿3931份，淋巴細(xì)胞843份，糞便39份。 已向外省提供60份患者血淋巴細(xì)胞樣本，用于DNA相關(guān)研究，效果良好,腫瘤組織庫(kù)的建立與管理,隨機(jī)抽取近1年的組織樣本20例，用Trizol試劑提取組織總RNA，測(cè)量各標(biāo)本的OD260/OD280比值均在1.8-2.0之間。1%瓊脂糖凝膠電泳后，28 S和18 S條帶清晰明亮，5 S條帶很弱，且28 S和18 S條帶亮度的比值約為2:1，表明標(biāo)本中的RNA完整性較好,腫瘤組織庫(kù)的建立與管理