犬β干擾素的表達(dá)及其抗細(xì)小病毒復(fù)制的研究

1、犬干擾素的表達(dá)及其抗細(xì)小病毒復(fù)制的研究犬細(xì)小病毒（ Canine Parvovirus,CPV）病作為危害犬類健康最嚴(yán)重的傳染病之一 , 對(duì)犬類的健康和生存有著巨大的威脅。隨著時(shí)間的變化CPV也在不斷地發(fā)生變異 , 給此病的預(yù)防與治療帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。干擾素（interferon,IFN）是一種廣泛表達(dá)于脊椎動(dòng)物體內(nèi)的多功能細(xì)胞因子 , 并且具有一系列的生物活性如抗病毒、抗增殖、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用。其中 IFN- 是天然免疫和適應(yīng)性免疫中的一個(gè)重要的中間誘導(dǎo)分子和效應(yīng)分子,它對(duì)抗病毒機(jī)制的獨(dú)特作用是IFN- 及其亞型無(wú)法代替和彌補(bǔ)?，F(xiàn)有的動(dòng)物干擾素主要采用原核表達(dá)的方法來(lái)制備, 需要經(jīng)過(guò)變性和復(fù)

2、性的過(guò)程來(lái)獲得具有活性的蛋白質(zhì), 生產(chǎn)工藝復(fù)雜 , 大大限制了干擾素在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用 , 而利用真核細(xì)胞表達(dá)的干擾素更接近天然干擾素的結(jié)構(gòu)。相比大腸桿菌表達(dá)的犬 IFN- ,CHO表達(dá)的干擾素具有良好的抗病毒活性和免疫原性, 并且副作用更小。本研究從貴州大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院采集犬血液, 利用分離的外周血淋巴細(xì)胞中來(lái)提取總 DNA,PCR擴(kuò)增犬 IFN- 基因 , 克隆并進(jìn)行序列分析 ; 構(gòu)建犬 IFN- 真核表達(dá)質(zhì)粒 , 將其在 CHO-K1細(xì)胞中表達(dá) , 并研究其對(duì) CPV的抗病毒活性。本論文主要研究?jī)?nèi)容包括 :1. 犬 IFN- 基因的擴(kuò)增、克隆及序列分析根據(jù)GenBank登錄的犬IFN- 基因

3、序列（ FJ194477）設(shè)計(jì)合成特異性引物 , 通過(guò) PCR從犬外周血淋巴細(xì)胞總 DNA中擴(kuò)增 IFN- 基因 CDS區(qū)并進(jìn)行克隆測(cè)序。運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)犬IFN- 基因進(jìn)行序列分析 , 并對(duì)其理化性質(zhì)以及編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè), 構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果顯示:犬 IFN- 基因編碼區(qū)全長(zhǎng)561 bp, 共編碼 186 個(gè)氨基酸 , 其分子式可表示為C1014H1593N263O290S9, 分子質(zhì)量為 22.40 ku; 屬于親水性蛋白 , 理論等電點(diǎn)為 5.98; 犬 IFN- 含有豐富的二級(jí)結(jié)構(gòu) , 以螺旋（ 76.88%）和無(wú)規(guī)卷曲（ 19.35%）為主, 蛋白質(zhì)三

4、級(jí)結(jié)構(gòu)呈彎曲螺旋結(jié)構(gòu) ; 與貉、威德?tīng)柡１?、金錢豹、家貓、寬吻海豚、人、雞和綠頭鴨相對(duì)應(yīng)序列核苷酸序列同源性分別為98.4%、87.2%、85.2%、84.7%、79%、74.9%、43.9%和 43.3%。同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明犬與貉IFN- 核苷酸同源性最高（為98.4%）, 親緣關(guān)系最近。 2. 犬 IFN- 基因重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)鑒定本研究主要構(gòu)建犬IFN- 基因重組真核表達(dá)載體, 對(duì)犬 IFN- 在 CHO-K1細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行鑒定。將上一步擴(kuò)增得到的目的基因亞克隆至pEGPF-C1載體上 , 構(gòu)建得到重組真核表達(dá)質(zhì)粒 pEGPF-C1-IFN-, 并通過(guò) PCR

5、、酶切以及測(cè)序確認(rèn)。 利用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 CHO-K1細(xì)胞 , 轉(zhuǎn)染后 48 h 收集細(xì)胞并提取總蛋白。Western-blotting結(jié)果顯示 , 表達(dá)產(chǎn)物能與抗 GFP標(biāo)簽鼠單克隆抗體特異性結(jié)合 , 在 55ku 處出現(xiàn)目的蛋白表達(dá)產(chǎn)物。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建出犬IFN- 基因重組真核表達(dá)載體 pEGPF-C1-IFN-, 并在 CHO-K1細(xì)胞中成功表達(dá)。3. 犬重組 IFN- 對(duì) CPV復(fù)制的影響將 F81 細(xì)胞進(jìn)行傳代 , 設(shè)立四組實(shí)驗(yàn)組分別為陽(yáng)性組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組和控制對(duì)照組。陽(yáng)性組加入1 mLCaIFN-真核表達(dá)產(chǎn)物 , 預(yù)處理 F81 細(xì)胞 5h, 然后接種 CPV。陰性對(duì)照組 , 加入空載體 pEGFP-C1真核表達(dá)產(chǎn)物 1 mL, 預(yù)處理 F81 細(xì)胞 5 h后接種 CPV?？瞻讓?duì)照組傳代5 h 后直接接種 CPV,控制對(duì)照組均不加。通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞病變, 四組接種后分別于12 h 、24 h 以及 36 h 收集細(xì)胞懸液 , 反復(fù)凍融 3 次后收集病毒 , 并提取 DNA,進(jìn)行 CPV-VP2基因