細菌內毒素檢查法.ppt

1、1,1,細菌內毒素檢查法 質監(jiān)中心 山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司,1,2,1、熱原(progon) 醫(yī)院臨床在使用藥品注射劑時，常有發(fā)生冷感、寒戰(zhàn)、發(fā)熱、頭痛、惡心、嘔吐、膚色灰白、休克、嚴重時導致死亡，這種癥狀稱為熱原反應。,一.熱原和細菌內毒素基本知識,1,3,1、熱原(progon),為提高藥品質量和用藥安全，人們對熱原進行了廣泛的研究，直到1923年Seibert提出了用家兔檢測熱原的方法。在1942年美國藥典首先將家兔熱原檢查項收入藥典成為法定方法，中國藥典1953年版開始收載該方法，隨后的世界各國藥典都以動物熱原檢查法作為藥品質量監(jiān)測的方法之一。,1,4,1、熱原(progon),家兔

2、熱原檢查法的優(yōu)點，可在規(guī)定時間里觀察到家兔的體溫變化，相應反應了熱原質引起哺乳類動物復雜的體溫反應過程。所以，在半個多世紀以來熱原檢查法，為保障藥品質量和用藥安全發(fā)揮了重要作用。,1,5,1、熱原(progon),但隨著制藥工業(yè)的發(fā)展和臨床用藥的要求，該方法的局限性越來越明顯。這種熱原檢查法，只局限于某種藥物進入體內（血循環(huán)）是否能引起體溫變化或熱原反應作為判斷藥品是否污染熱原的方法，已不能滿足醫(yī)藥工業(yè)發(fā)展的需要。,1,6,1、熱原(progon),缺點： 標準化程度低，無法判斷檢查樣品中存在的熱原質到底是什么或是哪一種物質。 由于試驗動物家兔是處在被細菌污染的環(huán)境中，通過吸入或皮膚感染細菌內

3、毒素而被免疫，導致動物的個體差異較大。,1,7,1、熱原(progon),試驗動物受到藥品的藥理活性干擾，而影響體溫變化（如放射性藥品、抗生素、生物制品等），實驗結果難以判斷。 設備及實驗費用昂貴（如建設動物房、水電、動物飼料等耗費），做一種藥品需要600元/次，而鱟試劑僅50元/次。,1,8,1、熱原(progon),綜上情況分析，鱟試驗法可避免以上動物熱原檢查法的不足，該技術的成功和應用真可謂是藥品質量監(jiān)控一場大革命。,1,9,1、熱原(progon),什么是熱原？目前國內外仍未有統(tǒng)一的認識，但從國內外文獻報道中，一個共同的意見，都普遍認為：它是指細菌內毒素的脂多糖。,1,10,1、熱原(

4、progon),歐洲藥典委員會提出：“嚴格地講，不是每一種熱原都具有脂多糖的結構，但所有已知的細菌內毒素脂多糖都有熱原活性”。在藥品生產質量管理規(guī)范（GMP）條件下，藥品生產的質量控制一般可以接受的觀點是：不存在細菌內毒素意味著不存在熱原。,1,11,2、細菌內毒素（Endotoxin）,細菌內毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁上的一種脂多糖（Lipoply Saccharide）和微量蛋白（Protein）的復合物，它的特殊性不是細菌或細菌的代謝產物，而是細菌死亡或解體后才釋放出來的一種具有內毒素生物活性的物質。,1,12,2、細菌內毒素（Endotoxin）,其化學成分廣泛分布于革蘭氏陰性菌（如大腸

5、桿菌、布氏桿菌、傷寒桿菌、變形桿菌、沙門氏菌等）及其它微生物（如衣原體、立克次氏體、螺旋體等）的細胞壁層的脂多糖，其化學成份主要是由O-特異性鏈、核心多糖、類脂A三部分組成。,1,13,2、細菌內毒素（Endotoxin）,細菌內毒素化學結構： 1.O-特異性多糖鏈 2.核心多糖 3.類脂A（生理活性中心）,1,14,2、細菌內毒素（Endotoxin）,細菌內毒素，英文稱作Enolotoxin，是G-菌細胞壁個層上的特有結構，內毒素為外源性致熱原，它可激活中性粒細胞等，使之釋放出一種內源性熱原質，作用于體溫調節(jié)中樞引起發(fā)熱。,1,15,內毒素 C因子 活化C因子 13-D葡聚糖 B因子 活化

6、B因子 活化G因子 G因子 前凝固酶 凝固酶(顯色基質法) 凝固蛋白原 凝固蛋白 (比濁法,凝膠法) 鱟試劑凝集反應過程,1,16,2、細菌內毒素（Endotoxin）,一般細菌毒素可分為兩類： 一類為外毒素（Exotoxin）；它是一種毒性蛋白質，是細菌在生長過程中分泌到菌體外的毒性物質。產生外毒素的細菌主要是革蘭氏陽性菌。如白喉桿菌、破傷風桿菌、肉毒桿菌、金黃色葡萄球菌以及少數(shù)革蘭氏陰性菌。,1,17,2、細菌內毒素（Endotoxin）,加一類為內毒素（Endotoxin）。是革蘭氏陰性菌的細胞壁外壁層上的特有結構。細菌在生活狀態(tài)時不釋放出來，只有當細菌死亡自溶或粘附在其它細胞時，才表現(xiàn)

7、其毒性，內毒素的主要化學成分是脂多糖中的類脂A成分。,1,18,革蘭氏陰性菌細胞壁結構,1,19,理化性質 分子量 500025000。形成微膠粒影響水溶性和生物活性 水溶性：核心多糖中KDO及單糖數(shù)量，磷酸和羧酸數(shù)，二價陽離子，三乙胺鹽 吸附性：石棉，活性碳，容器，濾膜 熱穩(wěn)定性：250，30分鐘以上 酸堿，輻照，氧化劑的破壞,2、細菌內毒素（Endotoxin）,1,20,二、細菌內毒素檢查法,1、概述 細菌內毒素檢查包括兩種方法，即凝膠法和光度測定法，后者包括濁度法和顯色基質法。供試品檢測時，除另有規(guī)定外，以凝膠法結果為準。細菌內毒素的量用內毒素單位(EU)表示。,1,21,二、細菌內毒

8、素檢查法,2、細菌內毒素檢查法所應用的 試劑，主要包括：鱟試劑、細菌 內毒素檢查用水、細菌內毒素工 作標準品等。,1,22,鱟試劑（TAL）,1,23,鱟試劑：應具有國家主管部門的批準文號。,凝膠法鱟試劑 ，規(guī)格：0.1ml/支,1,24,鱟試劑,真空封口鱟試劑，規(guī)格：1、1.5、2ml/支,1,25,鱟試劑主要生產廠家,廈門鱟試劑實驗廠有限公司 湛江博康海洋生物有限公司 福建省福州東方鱟試劑廠 福州新北生化試劑有限公司 湛江安度斯生物有限公司,1,26,細菌內毒素檢查用水 1.藥典規(guī)定： 凝膠法： 0.015Eu/ml 光度法： 0.005Eu/ml 2.使用事項-和鱟試劑配套使用,1,27

9、,細菌內毒素國家標準品(RSE),細菌內毒素國家標準品系自大腸埃希菌提取精制而成，用于標定、復核、仲裁鱟試劑靈敏度和標定細菌內毒素工作標準品的效價。,1,28,細菌內毒素工作標準品(CSE),細菌內毒素工作標準品系以細菌內毒素國家標準品為基準標定其效價，用于試驗中鱟試劑靈敏度復核、干擾試驗及各種陽性對照。,1,29,3、儀器設備與實驗器具,分析天平、超凈工作臺、細菌內毒素檢查專用干式恒溫器、電熱恒溫干燥箱(180以上，300以下)、旋渦混合器。,1,30,細菌內毒素檢查專用干式恒溫器,1,31,旋渦混合器,1,32,實驗器具,試管架、鑷子、消毒棉球、稱量瓶(30mm60mm)、刻度吸管(1、2

10、、5、10、15ml)、中號金屬飯盒、加樣器等。,1,33,加樣器,1,34,4、實驗器具的洗滌與滅菌,1、實驗中使用的所有玻璃器具須經(jīng)用自來水沖洗后，在洗衣粉溶液中用毛刷刷洗干凈，取出用自來水、 純化水依次沖洗干凈。,1,35,4、實驗器具的洗滌與滅菌,2、刻度吸管使用時應先用自來水沖洗后，在洗液中浸泡30分鐘，取出用自來水、純化水依次沖洗干凈。,1,36,4、實驗器具的洗滌與滅菌,3、將沖洗干凈的稱量瓶、玻璃小瓶置金屬飯盒內，吸管置金屬筒內，放入烤箱，于于250干烤至少60分鐘，放冷，密閉保存?zhèn)溆?。滅菌后的實驗器具應?4小時內使用，過期應重新處理。,1,37,4、實驗器具的洗滌與滅菌,4

11、、試驗中所用的器皿，需要經(jīng)過處理，除去可能存在的外源性內毒素。常用的方法是250干烤至少60分鐘，達到規(guī)定時間后，關斷電源，待烤箱溫度自然降至室溫，一般約需68 小時。,1,38,4、實驗器具的洗滌與滅菌,也可用其他適宜的方法，并應確證不干擾細菌內毒素的檢查。除去外源性內毒素的玻璃器皿應在24小時內使用，否則須再次除去可能存在的外源性內毒素。試驗操作過程應防止微生物的污染。,1,39,5、供試品溶液的配制,按各藥品項下規(guī)定，取供試品，精密稱定于稱量瓶(事先已除去外源性內毒素)中，按其效價或含量，用各藥品項下規(guī)定的稀釋劑稀釋至規(guī)定濃度，充分搖勻使完全溶解，放置 510分鐘，再搖勻,放置備用。,1

12、,40,5、供試品溶液的配制,一般要求供試品溶液的pH值在6.08.0的范圍內。對于過酸、過堿或本身有緩沖能力的供試品，需調節(jié)被測溶液的pH值，可以使用酸、堿溶液或鱟試劑生產廠家推薦的適宜的緩沖液調節(jié)pH值。酸或堿溶液須用細菌內毒素檢查用水在已經(jīng)去除內毒素的容器中配制，緩沖液必須經(jīng)過驗證不含內毒素或干擾因子。,1,41,5、供試品溶液的配制,注意事項： 1、供試品溶液的濃度如以 *mg/ml表示，此*mg/ml是指供試品溶液中活性物質的濃度。 2 、樣品初試時一般按照樣品的估計百分含量或效價單位計算稀釋液溶劑加入量，復試時，則必須根據(jù)該供試品的實際百分含量或效價來計算。,1,42,6、鱟試劑靈

13、敏度復核試驗,當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發(fā)生了任何可能影響檢驗結果的改變時，應進行鱟試劑靈敏度復核試驗。,1,43,6、鱟試劑靈敏度復核試驗,鱟試劑的標示靈敏度：在本檢查法規(guī)定的條件下，使鱟試劑產生凝集的內毒素的最低濃度即為鱟試劑的標示靈敏度，其單位用EU/ml表示。,1,44,6、鱟試劑靈敏度復核試驗,1、取細菌內毒素國家標準品或工作標準品一支，用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，用75%酒精棉球擦拭后啟開，防止玻璃屑落入瓶內。,1,45,6、鱟試劑靈敏度復核試驗,2、根據(jù)鱟試劑標示靈敏度()，將細菌內毒素國家標準品或工作標準品用細菌內毒素檢查用水溶解 ，在旋渦混合器上混勻15分鐘 ，然后制成 2

14、、0.5和0.254個濃度的內毒素標準溶液，每稀釋一步均應在旋渦混合器上混勻30秒鐘。,1,46,6、鱟試劑靈敏度復核試驗,3、取 0.1ml/支的鱟試劑18支 ，用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，用75酒精棉球擦拭后啟開，防止玻璃屑落入瓶內。規(guī)格大于 0.1ml支的鱟試劑按其標示量加入細菌內毒素檢查用水復溶。輕輕轉動瓶壁，使內容物充分溶解，避免產生氣泡。,1,47,6、鱟試劑靈敏度復核試驗,4、按檢查法項下試驗，將待復核的鱟試劑18管放在試管架上，排成5列，前4列4管，后1列2 管，其中前4列分別加入4個不同濃度的內毒素標準溶液0.1ml（每1個內毒素濃度平行做4管），另一列加入細菌內毒素檢查用水0

15、.1ml。加樣結束后，用封口膜封口，輕輕混勻，避免產生氣泡，垂直放入細菌內毒素檢查專用干式恒溫儀中，在371保溫60分鐘2分鐘后，觀察并記錄結果。,1,48,6、鱟試劑靈敏度復核試驗,5、試驗結果中，如最大濃度2管均為陽性，最低濃度 0.25管均為陰性，陰性對照均為陰性，按下式計算反應終點濃度的幾何平均值即為鱟試劑靈敏度的測定值(c)。 clg-1 (X/4) 式中X為反應終點濃度的對數(shù)值(lg)。反應終點濃度是指系列遞減的內毒素濃度中最后一個呈陽性結果的濃度。,1,49,6、鱟試劑靈敏度復核試驗,6、當c在0.52(包括0.5和2) 時，方可用于細菌內毒素檢查，并以標示靈敏度為該批鱟試劑的靈

16、敏度。,1,50,6、鱟試劑靈敏度復核試驗,1,51,7、供試品的干擾試驗,當鱟試劑、供試品的配方、生產工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結果的變化時，須進行干擾試驗。,1,52,凝膠法干擾試驗溶液的制備,1,53,7、供試品的干擾試驗,1、按鱟試劑靈敏度復核試驗項下，用細菌內毒素檢查用水和未檢出內毒素的供試品溶液且不超過最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)的溶液，分別制成含細菌內毒素工作標準品2、0.5和0.254個濃度的內毒素標準溶液系列A和B。,1,54,7、供試品的干擾試驗,2、鱟試劑的準備： 取0.1ml支的鱟試劑36支，用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，用75酒精棉球擦拭后啟開，防止玻璃屑

17、落入瓶內。規(guī)格大于 0.1ml支的鱟試劑按其標示量加入細菌內毒素檢查用水復溶。輕輕轉動瓶壁，使內容物充分溶解，避免產生氣泡。,1,55,7、供試品的干擾試驗,3、按檢查法項下試驗，照表一制備溶液A、B、C和D。 將準備好的18管鱟試劑放在試管架上，排成5列， 1 列2管作為A，4列4管作為B，其中4列分別加入4個不同濃度的含供試品的內毒素標準溶液，另一列加入供試品溶液。,1,56,7、供試品的干擾試驗,將準備好的另外18管鱟試劑放在試管架上，排成5列，4列4管作為C，1列2管作為D，其中4列分別加入 4個不同濃度的內毒素標準溶液，另一列加入細菌內毒素檢查用水。加樣結束后，用封口膜封口，輕輕混勻

18、，避免產生氣泡，垂直放入細菌內毒素檢查專用干式恒溫儀中，在371保溫60分鐘2分鐘后，觀察并記錄結果。,1,57,7、供試品的干擾試驗,4、試驗結果中，只有當溶液A和陰性對照溶液D的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C的結果在鱟試劑靈敏度符合范圍內時，試驗方為有效。按下式計算系列溶液C和B的反應終點濃度的幾何平均值(Es和Et)。,1,58,7、供試品的干擾試驗,Eslg-1(Xs/4) Etlg-1(Xt/4) 式中Xs、Xt分別為系列溶液C和B的反應終點濃度的對數(shù)值(lg)。,1,59,7、供試品的干擾試驗,當Es在0.52 (包括0.5和2)及Et在0.5Es2Es(包括0.5Es和2Es

19、) 時，認為供試品在該濃度下無干擾作用。若供試品溶液在小于MVD的稀釋倍數(shù)下對試驗有干擾，應將供試品溶液進行不超過MVD的進一步稀釋，再重復干擾試驗。,1,60,7、供試品的干擾試驗,供試品的最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)按下式計算： DCL/ 式中：L：為供試品的細菌內毒素限值。 C：為供試品溶液的濃度（抗生素樣品濃度以活性成分計）。當L以EU/ml表示時，C為1.0ml/ml，當L以EU/mg、EU/u表示時，C為mg/ml、 u/ml。如供試品為注射用無菌粉末或原料藥，則MVD取1，可計算供試品的最小有效稀釋濃度C=/L。 ：鱟試劑的標示靈敏度（EU/ml）。,1,61,7、供試品的干擾試驗

20、,1,62,取效價為100EU的內毒素工作標準品1支（工作標準品為中國藥品生物制品檢定所研制、標定、分發(fā)），開啟，加入1ml細菌內毒素檢查用水溶解，然后用封口膜封閉瓶口，在混旋器上混合15分鐘，混旋后得到100EU/ml的內毒素工作標準品溶液。,1.溶解細菌內毒素工作標準品,1,63,等比例稀釋內毒素標準品濃度溶液，每一步稀釋前要充分振蕩30秒后再進行下一步稀釋。 例：把濃度為100EU/ml的工作品稀釋為10，1，0.1，0.01EU/ml四個濃度，可按下圖稀釋： 100EU/ml 10EU/ml 1EU/ml 0.1EU/ml 0.01EU/ml,2.稀釋細菌內毒素工作標準品,1,64,溶

21、解、分裝規(guī)格大于0.1ml/支的鱟試劑 例：取2支鱟試劑（裝量為0.6ml），分別加入0.6ml細菌內毒素檢查用水，靜置，待其充分溶解后，將它們混合在一支內混勻、待用。取10支儀器定量專用小試管，按2支1組放于試管架上，分別加入0.1ml鱟試劑（注意不要產生氣泡）。,需要注意的問題：,1,65,8、凝膠限量檢查法,1 取裝有0.1ml鱟試劑溶液的1075mm試管或復溶后的0.1ml支規(guī)格的鱟試劑原安瓶8支， 用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，用 75酒精棉球擦拭后啟開，防止玻璃屑落入瓶內。規(guī)格大于 0.1ml支的鱟試劑按其標示量加入細菌內毒素檢查用水復溶。輕輕轉動瓶壁，使內容物充分溶解，避免產生氣泡。

22、,1,66,8、凝膠限量檢查法,2 供試品陽性對照液的制備：用被測供試品溶液將細菌內毒素工作標準品制成 2濃度的內毒素溶液，充分搖勻，放置備用。,1,67,8、凝膠限量檢查法,3 陽性對照液的制備：用細菌內毒素檢查用水將細菌內毒素工作標準品制成 2濃度的內毒素溶液，充分搖勻，放置備用。,1,68,8、凝膠限量檢查法,4 將8管鱟試劑放置在試管架上，其中2支加入 0.1ml按最大有效稀釋倍數(shù)稀釋的供試品溶液作為供試品管， 2支加入 0.1ml陽性對照液作為陽性對照管，2支加入0.1ml細菌內毒素檢查用水作為陰性對照，2支加入0.1ml供試品陽性對照溶液作為供試品陽性對照管。,1,69,8、凝膠限

23、量檢查法,5 加樣結束后，用封口膜封口，輕輕混勻，避免產生氣泡，垂直放入細菌內毒素檢查專用干式恒溫儀中，在371保溫 60分鐘2分鐘后，觀察并記錄結果。注意在保溫和拿取試管過程應避免受到震動制成假陰性結果。,1,70,8、凝膠限量檢查法,4 結果判斷 將試管從恒溫儀中輕輕取出，緩緩倒轉 180時，若管內形成凝膠，并且凝膠不變形，不從管壁滑脫者為陽性，記錄為() ；未形成凝膠或形成的凝膠不堅實，變形并從管壁滑脫者為陰性，記錄為()。若陰性對照溶液的平行管均為陰性，供試品陽性對照溶液的平行管均為陽性，陽性對照溶液的平行管均為陽性，試驗有效。,1,71,8、凝膠限量檢查法,結果判斷 供試品2管均為(

24、)，應認為符合規(guī)定。如2管均為()，應認為不符合規(guī)定；如2管中1管為()，1管為()，按上述方法另取4支供試品管復試，若所有平行管均為(-)，即認為符合規(guī)定。否則判供試品為不符合規(guī)定。,1,72,9、凝膠半定量試驗,凝膠半定量試驗是通過反應終點濃度來量化供試品中內毒素的含量。,1,73,9、凝膠半定量試驗,按下表制備溶液A、B、C、D。按照鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作。,1,74,9、凝膠半定量試驗,1,75,9、凝膠半定量試驗,結果判斷 1、若陰性對照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性對照溶液B的平行管均為陽性，系列溶液C的反應終點濃度的幾何平均值在0.52之間，試驗有效。,1,76,9、凝

25、膠半定量試驗,系列溶液A中每一系列平行管的終點稀釋倍數(shù)乘以，為每個系列的反應終點濃度，所有平行管反應終點濃度的幾何平均值即為供試品溶液的內毒素濃度。,1,77,9、凝膠半定量試驗,系列溶液A中每一系列平行管的終點稀釋倍數(shù)乘以，為每個系列的反應終點濃度，所有平行管反應終點濃度的幾何平均值即為供試品溶液的內毒素濃度。,1,78,9、凝膠半定量試驗,若內毒素濃度小于規(guī)定的限值，判供試品符合規(guī)定。若內毒素濃度大于或等于規(guī)定的限值，判供試品不符合規(guī)定。,1,79,10、操作注意事項,1 進行鱟試驗操作不必在無菌室進行，只須在超凈工作臺即可，操作前用肥皂洗手，然后用75酒精棉球擦拭消毒。 2 實驗時，須戴

26、工作帽和口罩，勿高聲講話，防止唾沫濺入。,1,80,10、操作注意事項,3 試驗所用玻璃器皿，應在24小時內于250干烤至少一小時。 4 用移液管吸取樣品時，須使用吸耳球，勿用嘴吸、吹或其它方式，使用加樣器除外。 5 注意所用鱟試劑的批號、有效期、裝量、靈敏度等，均應符合要求。,1,81,10、操作注意事項,6 切割鱟試劑安瓶時，要小心，溶解液應沿內壁緩緩加入，避免激烈震動安瓶，以防止產生泡沫，同時應注意觀察，使凍干粉末充分溶解。 7 稀釋內毒素工作標準品、溶解鱟試劑盡可能由兩人分別操作，以免污染。,1,82,10、操作注意事項,8 進行干擾試驗時，標準對照和供試品陽性對照應同時進行。 9 向

27、鱟試劑溶解液中加入樣品或內毒素溶液后，應充分混勻，但又要避免泡沫，否則影響觀察試驗結果。 10 保溫時，應使試管或安瓶保持垂直位置，并防止震動。,1,83,10、操作注意事項,11 在進行鱟試劑靈敏度復核 、干擾試驗和供試品細菌內毒素檢查時，各個試驗所要求的對照應同時進行，并在有效的條件下才能進行計算和判斷。 12 觀察結果時，拿取試管或安瓶，要輕取緩慢倒轉180。,1,84,三、樣品檢測過程中的假陽性、假陰性結果分析,（一）.樣品檢測過程中的假陽性結果分析 1. 污染（包括實驗環(huán)境、實驗器材、實驗操作等） 2.葡聚糖的干擾 3.鱟試劑靈敏度 4.特殊樣品,1,85,三、樣品檢測過程中假陽性結

28、果分析,1.污染 a.實驗環(huán)境：沒有明顯空氣流動的潔凈工作室即可。（操作規(guī)程：實驗應在潔凈室或潔凈工作臺內進行。） b.實驗器材：規(guī)范程序 C.實驗操作：避免污染 D.BET水污染,1,86,三、樣品檢測過程中假陽性結果分析,2.葡聚糖 -D-glucan在自然界的分布很廣，主要存在擔子菌、真菌、地衣類、高等植物以及酵母、藻類的菌體成分中。另外，某些使用人造纖維制作的人工腎透析膜上也含有類似物質。,1,87,三、樣品檢測過程中假陽性結果分析,3.鱟試劑靈敏度的影響 鱟試劑的靈敏度與標示靈敏度不符。,1,88,三、樣品檢測過程中假陽性結果分析,4.特殊樣品 某些樣品會和鱟試劑中某些成分發(fā)生化學反

29、應，形成濁度變化，造成假陽性。 如碳酸氫鈉注射液。 溶液pH值的影響。,1,89,三、樣品檢測過程中的假陽性、假陰性結果分析,（一）.樣品檢測過程中的假陰性結果分析 1.器材處理 2.鱟試劑失效、靈敏度與標示靈敏度不符 3. 特殊反應,1,90,三、樣品檢測過程假陰性結果分析,1.器材處理 實驗器材處理不當，不但容易造成假陽性，還容易造成假陰性。實驗器材在經(jīng)過洗液浸泡后，如果沖洗不干凈，有酸性物質殘留，會造成實驗結果出現(xiàn)假陰性,1,91,三、樣品檢測過程假陰性結果分析,2.鱟試劑失效、靈敏度與標示靈敏度不符 鱟試劑保存使用不當，使鱟試劑失效，實驗結果表現(xiàn)為假陰性。 靈敏度復核實驗,1,92,三

30、、樣品檢測過程假陰性結果分析,3.特殊反應某些特殊樣品，如不進行預處理，會造成實驗結果的假陰性。 如血紅蛋白,1,93,四、細菌內毒素檢查法問題回答,1.用同一批號鱟試劑及相同的內毒素溶解水和內毒素標準品做出結果不同，為什么？ 初學者很可能出現(xiàn)這種情況，這是因為試驗操作還不熟練，如何消除上述情況？ 1.試驗器材應保證安全可靠，即除熱原徹底。 2.試驗操作熟練。 3.內毒素標準品溶解稀釋準確。 4.加樣準確迅速，不能有氣泡。,1,94,四、細菌內毒素檢查法問題回答,3、每批新起用的鱟試劑需要做靈敏度復核嗎？ 必須要做。當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發(fā)生了任何可能影響檢驗結果的改變時，應進行鱟試劑

31、靈敏度復核試驗。,1,95,四、細菌內毒素檢查法問題回答,4.如何正確使用旋渦混旋器？ 使用旋渦混旋器的目的是使存在于溶液中的內毒素能夠均勻的分布。由于內毒素有及強的吸附性和聚集性，所以在細菌內毒素檢查法標準操作規(guī)范中規(guī)定，內毒素標準品溶解后應在旋渦混旋器上混合15分鐘，實驗中的每一步稀釋和加樣均應在旋渦混旋器上混合30秒。,1,96,四、細菌內毒素檢查法問題回答,市場上出售的旋渦混旋器有兩種，即插孔式和非插孔式。在使用插孔式旋渦混旋器時，將含有內毒素標準品溶液安剖管插入合適的插孔內，調整混旋幅度至液體處于混旋狀態(tài)而不出管體，時間定為15分鐘，在混旋稀釋的樣品時，將稀釋樣品的容器低部至于混旋器上，容器內液體應處于混旋狀態(tài)方為有效，時間為每次30秒。,1,97,四、細菌內毒素檢查法問題回答,在使用非插孔式旋渦混旋器溶解內毒素標準品時，應用手扶內毒素標準品溶液安瓿，使液體處于混旋狀態(tài)而不出管體，時間定為15分鐘，不應用膠布捆綁的方式，因為這樣管體容易傾斜，液體旋出管外，從而造成內毒素實際含量與標示含量不符，進而影響定標的誤差，在混旋稀釋的樣品時，方法同插孔式旋渦混旋器。,1,98,四、細菌內毒素檢查法問題回答,5. 向反應管加鱟試劑和樣品溶液時，如何避免加