動物肝臟中DNA的提取及檢測實驗報告

1、動物肝臟中DNA的提取及檢測、前言脫氧核糖核酸脫氧核糖核酸（DNA，為英文Deoxyribonucleic?acid 的縮寫），又稱 去氧核糖核酸，是脫氧核糖核酸染色體的主要化學(xué)成分，同時也是組成基因 的材料。有時也被稱為“遺傳微?！保蚴窃诜敝尺^程中，父代會把它們 自己DNA的一部分復(fù)制傳遞到子代中，從而完成性狀的傳播。DNA是高分子聚合物，DNA溶液為高分子溶液，具有很高的粘度，可被甲基綠染成綠色。DNA對紫外線（260nm ）有吸收作用，利用這一特性, 可以對DNA進(jìn)行含量測定。當(dāng)核酸變性時，吸光度升高，稱為增色效應(yīng);當(dāng)變性核酸重新復(fù)性時，吸光度又會恢復(fù)到原來的水平。較高溫度、有機(jī)溶

2、劑、酸堿試劑、尿素、酰胺等都可以引起 DNA分子變性，即DNA雙鏈堿基間的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開一也稱為 DNA的解螺旋。在細(xì)胞內(nèi)，DNA能與蛋白質(zhì)結(jié)合形成染色體，整組染色體則統(tǒng)稱為染色 體組。對于人類而言，正常的體細(xì)中含有 46條染色體。染色體在細(xì)胞分裂之前會先在分裂間期完成復(fù)制，細(xì)胞分裂間期又可劃分為：G1期-DNA合成前期、S期-DNA合成期、G2-DNA合成后期。對于真核生物，如動物、 植物及真菌而言，染色體主要存在于細(xì)胞核內(nèi)；而對于原核生物，如細(xì)菌而 言，則主要存在于細(xì)胞質(zhì)中的擬核內(nèi)。染色體上的染色質(zhì)蛋白，如組織蛋白, 能夠?qū)NA進(jìn)行組織并壓縮，以幫助 DNA與其他蛋白質(zhì)進(jìn)行交互

3、作用,進(jìn)而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。脫氧核糖核酸的結(jié)構(gòu)DNA的結(jié)構(gòu)：DNA的結(jié)構(gòu)一般可劃分為一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu)四個水平。DNA是一種長鏈聚合物，組成單位為四種脫氧核苷酸,即腺嘌呤脫氧核苷酸（dAMP脫氧腺苷）、胸腺嘧啶脫氧核苷酸（dTMP脫氧胸苷）、胞嘧啶脫氧核苷酸（dCMP脫氧胞苷）、鳥嘌呤脫氧核苷酸（dGMP脫氧鳥苷）。而脫氧核糖（五碳糖）與磷酸分子借由酯鍵相連，組成其長鏈骨架,排列在外側(cè)，四種堿基排列在內(nèi)側(cè)。每個糖分子都與四種堿基里的其中一種相連，這些堿基沿著DNA長鏈所排列而成的序列，可組成遺傳密碼，指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。讀取密碼的過程稱為轉(zhuǎn)錄，是以DNA雙鏈中的一條單鏈為模板轉(zhuǎn)

4、錄出一段稱為mRNA （信使RNA）的核酸分子。DNA是由許多脫氧核苷酸按一定堿基順序彼此用 3 , 5 -磷酸二酯鍵相連構(gòu)成的長鏈。大多數(shù) DNA含有兩條這樣的長鏈，也有的 DNA為單鏈，如大腸桿菌噬菌體 X174、G4、M13等。DNA有環(huán)形DNA和鏈狀DNA之分。在某些類型的DNA中，5-甲基胞嘧啶可在一定限度內(nèi)取代胞嘧啶，其中小麥胚DNA的5-甲基胞嘧啶特別豐富。在某些噬菌體中，5-羥甲基胞嘧啶取代了胞嘧啶。40年代后期，查加夫（E.Chargaff ）發(fā)現(xiàn)不同物種DNA的堿基組成不同，但其中的腺嘌呤數(shù)等于其胸腺嘧啶數(shù)（A=T ）,鳥嘌呤數(shù)等于胞嘧啶數(shù)（G=C ），因而嘌呤數(shù)之和等于嘧

5、啶數(shù)之和，一般用幾個層次描繪DNA的結(jié)構(gòu)。濃鹽法從動物組織中提取 DNA核酸和蛋白質(zhì)在生物體中常以核蛋白（DNP/RNP ）的形式存在，其中DNP 能溶于水及高濃度鹽溶液，但在 0.14 M 的鹽溶液中溶解度很低，而RNP 則可溶于低鹽溶液， 因此可利用不同濃度的 NaCl 溶液將其從樣品中分 別抽提出來。將抽提得到的 DNP 用 SDS 處理可將其分離 DNA 和蛋白質(zhì)， 用氯仿 -異戊醇將蛋白質(zhì)沉淀除去可得 DNA 上清，加入冷乙醇即可將其呈纖 維狀析出。肝臟細(xì)胞肝臟是由肝細(xì)胞組成，肝細(xì)胞極小，肉眼看不到，必須通過顯微鏡才能 看到。人肝約有 25 億個肝細(xì)胞， 5000 個肝細(xì)胞組成一個肝

6、小葉， 因此人肝 的肝小葉總數(shù)約有 50 萬個。肝細(xì)胞為多角形，直徑約為 20-30/ 加(微米 )，有 6-8 個面，不同的生理條件下大小有差異，如饑餓時肝細(xì)胞體積變大。每 個肝細(xì)胞表面可分為竇狀隙面、肝細(xì)胞面和膽小管面三種。肝細(xì)胞里面含有 許許多多復(fù)雜的細(xì)微結(jié)構(gòu) :如肝細(xì)胞核、 肝細(xì)胞質(zhì)、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體、 高爾基氏體、微粒體及飲液泡等組成。、實驗?zāi)康?. 掌握濃鹽法從動物組織中提取 DNA 的原理與技術(shù)三、實驗原理核酸和蛋白質(zhì)在生物體中常以核蛋白( DNP/RNP )的形式存在，其中DNP 能溶于水及高濃度鹽溶液，但在 0.14 M 的鹽溶液中溶解度很低，而RNP 則可溶于低鹽溶液

7、， 因此可利用不同濃度的 NaCl 溶液將其從樣品中分 別抽提出來。將抽提得到的 DNP 用 SDS 處理可將其分離 DNA 和蛋白質(zhì)，用氯仿 -異戊醇將蛋白質(zhì)沉淀除去可得 DNA 上清，加入冷乙醇即可將其呈纖維狀析出。四、實驗器材和材料試劑實驗器材： 勻漿器 量筒 離心機(jī) 離心管 試管 吸管 恒溫水浴鍋實驗材料： 豬肝實驗試劑： O.1mol/L NaCl-0.05mol/L檸檬酸鈉溶液（pH6.8） 95%乙醇（A. R.）NaCI 固體（A.R.） 5%SDS溶液（5g SDS 定容至100ml ） V（氯仿）:V （異戊醇）20 : 1的混合液五、實驗操作1. 稱量稱取一定質(zhì)量的豬肝，

8、加入 2倍肝重的O.1mol/L NaCI-0.05mol/L檸檬酸鈉緩沖液并用勻漿器磨碎（已完成）。2.提取DNA量取肝糜4 ml于10毫升離心管，在4000r/min 下離心10min ,沉淀中再加入8 ml緩沖液于4000r/min 離心5 min ;棄上清，取沉淀;將沉淀用10ml檸檬酸鈉緩沖液完全洗入干凈的小燒杯、加入5 ml氯仿-異戊醇混合液、1 ml SDS，振蕩30min （保鮮膜封口）；緩慢加入固體NaCI （約0.9g ），使其最終濃度為1mol/L ；將溶液分裝到2個10毫升離心管中，在4000r/min 離心5 min，取上清水相;在上述水相溶液中分別加等體積冷95%乙

9、醇，邊加邊用玻棒慢慢朝一個方向攪動，將纏繞在玻棒上的凝膠狀物用濾紙吸去多余的乙醇，即得DNA粗品;用8ml蒸餾水溶解DNA粗品于10ml離心管中。3.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制按下表加入各種 試劑，混勻，于60 C恒溫水浴鍋45min，冷卻后，在595nm 波長下于分光光度計比色測定，以吸光度對DNA濃度作圖，制作012345標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液0.00.40.81.21.62.0/ml蒸餾水/ml2.01.61.20.80.40標(biāo)準(zhǔn)曲線。二苯胺試劑/ml4.04.04.04.04.04.0A595nm4.樣品的測定將DNA粗品定容至25ml容量瓶，再取DNA樣液1.0ml ,加入蒸餾水1.0ml，混勻。然后準(zhǔn)

10、確加入二苯胺試劑 4.0ml，混勻，于60 C恒溫水浴鍋45min，冷卻后，595nm波長下于分光光度計比色測定，根據(jù)所測的吸光度對照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得DNA的質(zhì)量（ug ）。5.計算100g豬肝中DNA含量w=m1/m2 X100%w: DNA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）m1 :樣液中測得的DNA的質(zhì)量（ug）m2 :樣液中所含樣品的質(zhì)量（ug）六、實驗數(shù)據(jù)處理1.標(biāo)準(zhǔn)曲線012345標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液0.00.40.81.21.62.0/ml蒸餾水/ml2.01.61.20.80.40二苯胺試劑/ml4.04.04.04.04.04.0A595nm00.0390.090.1460.1970.249DNA含量/u

11、g0801602403204002.實驗結(jié)果處理豬肝質(zhì)量為2.04gDNA提取液體積為12.53ml序號123A595nm0.1020.1020.101平均A595nm0.102樣液中DNA含量/ug171.4樣液中樣品質(zhì)量/g0.1628根據(jù)公式w=m1/m2 X100%得：w=0.1053 %則100g豬肝中DNA含量為：wxi00=0.1053g七、思考題1.實驗中的乙醇、SDS、氯仿-異戊醇、NaCI、檸檬酸鈉分別有什么作用？答:檸檬酸的鈉鹽在實驗中既充當(dāng) DNA酶的抑制劑，也是pH緩沖溶液; SDS是表面活性劑，可以讓蛋白質(zhì)與 DNA分開; 氯仿是有機(jī)溶劑，可以使蛋白質(zhì)聚集沉淀，便于

12、分離出去; 異戊醇是消泡劑，可以減少泡沫的發(fā)生; 氯仿-異戊醇的作用是使蛋白質(zhì)變性、膜溶解; NaCI固體溶解使得試液成為高濃度的鹽溶液，在這樣的環(huán)境中DNA核蛋白能溶解，RNA核蛋白則溶解度很低，可以利用這一性質(zhì)分離兩種核酸。八、實驗注意事項1.DNA 主要集中在細(xì)胞核中，因此，通常選用細(xì)胞核含量比例大的生 活組織作為提取制備 DNA 的材料，小牛胸腺組織中細(xì)胞核比例較大，因而DNA 含量豐富，同時其脫氧核苷酸酶活性較低，制備過程中 DNA 被降解 的可能性相對較低，所以是制備 DNA 的良好材料，但其來源較困難，脾臟 或肝臟易獲得，也是實驗室制備 DNA 常用的材料，本實驗用新鮮肝臟作為

13、實驗材料。2. 為了防止大分子核酸在提取過程中被降解，須采取以下措施：整個過程必須在低溫下進(jìn)行，可加入某些物質(zhì)抑制核酸酶的活性，如檸檬酸鈉、EDTA、SDS等，EDTA是抑制核酸酶的活性最好的抑制劑。3. 從核蛋白中脫去蛋白質(zhì)的方法很多，經(jīng)常采用的有：氯仿- 異丙醇法、 苯酚法、去垢劑法等， 他們均能使蛋白質(zhì)變性和核蛋白解聚， 并釋放出核酸。4.使用離心機(jī)時，對稱放置的離心管必須用天平調(diào)平衡。5.避免劇烈振蕩，如研磨過程、攪拌過程等。九、實驗結(jié)果誤差分析及討論經(jīng)過對本次實驗結(jié)果進(jìn)行分析， 得出 100g 豬肝中 DNA 含量大約為 0.1053g的結(jié)論，在上網(wǎng)查閱相關(guān)資料后發(fā)現(xiàn)：豬肝中 DNA

14、 含量與本次試驗實際操 作測量得出的結(jié)果大致相互吻合。由此可知，本次試驗結(jié)果是相對比較成功 的，較為粗略地測量出豬肝中 DNA 的含量，并且較為熟練地掌握了濃鹽法 從動物組織中提取 DNA 的原理與技術(shù)，基本達(dá)到了本次實驗的目的。但是本次實驗結(jié)果只是粗略測量，并未達(dá)到精確測量豬肝中 DNA 的含量，且實驗數(shù)據(jù)較理論值偏低，這是由于某些誤差導(dǎo)致，在實驗過程中些許 因素可能會導(dǎo)致實驗結(jié)果數(shù)據(jù)有偏差，經(jīng)分析得出以下幾點：在稱取豬肝后加入檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行研磨的過程中， 由于豬肝組織 表面較滑不易磨碎，且研磨至最后依舊有小部分豬肝組織塊殘留，因此可能 導(dǎo)致豬肝中 DNA 提取不充分，致使實驗數(shù)據(jù)較理論值偏低； 研磨過程中，可能由于操作不當(dāng)，導(dǎo)致部分液體濺出，因此可能使得 提取液中部分 DNA 損失，導(dǎo)致實驗數(shù)據(jù)偏低； 在粗提取 DNA 操作中，頻繁地將 DNA 提取液轉(zhuǎn)移至各個儀器內(nèi)， 可能有極小部分 DNA 提取液未倒凈，殘留在儀器壁上損耗掉，導(dǎo)致實驗誤 差； 在使用移液槍的過程中，可能因為操作不當(dāng)或移液槍經(jīng)常錯誤使用, 出現(xiàn)儀器誤差，導(dǎo)致吸取的 DNA 樣液不精確，出現(xiàn)實驗誤差； 在水相中加入乙醇析出 DNA 時，不是所有