基因工程復(fù)習(xí)

1、廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 08生物工程2班基因工程復(fù)習(xí)資料基因工程復(fù)習(xí)總結(jié) 第一章1.基因工程：利用DNA重組技術(shù)，將目的基因與載體DNA在體外進(jìn)行重組，然后把這種重組DNA分子引入受體細(xì)胞，并使之增殖和表達(dá)的 技術(shù)2基因克?。涸诜肿由飳W(xué)上，人們把將外源 DNA插入具有復(fù)制能力的載體DNA中，轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞使這得以永久保存和復(fù)制的過程稱為基 因克隆。（基因工程或重組DNA技術(shù)則側(cè)重于驗證上述過程所獲得遺 傳物質(zhì)新組合在宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)與功能鑒定）3.重組DNA技術(shù)（RecombinantDNATechnique是人類根據(jù)需要選擇目的基因（DNA片段）在體外與基因運載體重組，轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞或 生物體

2、內(nèi)，以達(dá)到改良和創(chuàng)造新的物種和治療人類疾病的目的。4.基因操作：對生物體的遺傳物質(zhì)進(jìn)行人為的操作， 使之發(fā)生修飾和 改變的過程。5遺傳工程：用人工手段把一種生物的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到另一種生物的細(xì)胞中去，并使這種遺傳物質(zhì)所帶的遺傳信息在受體細(xì)胞中表達(dá)的技 術(shù)。遺傳工程，也叫基因工程、基因操作或重組DNA技術(shù)。說明基因工程的理論基石和技術(shù)基礎(chǔ) 理論基石（三大發(fā)現(xiàn)）：DNA是遺傳信息的載體；DNA的雙螺旋機(jī)構(gòu)模 型及其半保留復(fù)制機(jī)理；中心法則和遺傳密碼及其通用性。技術(shù)基礎(chǔ)（三大發(fā)明）：DNA的體外切割和連接；載體和宿主的 發(fā)現(xiàn)、改造和利用；DNA測序、電泳分離和分子雜交（Southern、Norther

3、n 和 West Blot ) 簡述基因工程研究發(fā)展歷史1953, Watson和Crick闡明DNA勺雙螺旋結(jié)構(gòu) 1961-1966，破譯全部遺傳密碼 1971，獲得第1個重組 DNA分子（美國斯坦福大學(xué)的 Paul Berg 及其 同事用限制性內(nèi)切酶將大腸桿菌的 DNA切開，并艱難的與病毒 DNA連接，從而獲得第一個重組 DNA分子） 1972,合成了完整的tRNA基因；P.Berg首次構(gòu)建DNAl組體 1973, Boyer和Cohen建立了 DNA重組技術(shù) 1977,重組人生長素抑制因子在大腸桿菌中成功表達(dá) 1978,美國Genentech公司在大腸桿菌中成功表達(dá)人胰島素1982,笫一

4、個DNAt組技術(shù)生產(chǎn)的動物疫苗在歐洲被批準(zhǔn)使用；美國 批準(zhǔn)重組人胰島素上市1988,1990,第一個體細(xì)胞培養(yǎng)方案在美獲準(zhǔn)；人類基因組計劃啟動1997,世界上第一只克隆羊問世；轉(zhuǎn)錄組學(xué)概念提出2003,人類基因組計劃的所有目標(biāo)全部實現(xiàn)PCR技術(shù)誕生：腫瘤敏感基因工程小鼠獲美國專利授權(quán)2003,中國楊煥明等科學(xué)在京完成了對水稻 （秈稻）基因組序列的測定和初步分析簡述基因工程研究的主要內(nèi)容。1）克隆載體的研發(fā)2 ）受體系統(tǒng)的研發(fā) 3 ）目的基因研究4）工具酶5）新技術(shù)研究（基因槍、放射性同位素探針、PCR等）1）2）3)轉(zhuǎn)基因動物（乳腺生物反應(yīng)器）簡述基因工程的主要應(yīng)用領(lǐng)域 基因工程藥物（重組活性

5、多肽或蛋白、疫苗和DNA疫苗等） 轉(zhuǎn)基因作物（抗病、抗蟲、抗除草劑、抗逆及生物反應(yīng)器等）第33頁，共35頁4)5)工業(yè)（纖維素酶、釀造業(yè)菌株、抗菌素生產(chǎn)菌株的工程改造，等） 環(huán)保（生物降解塑料原料基因工程和生物防治農(nóng)藥污染基因工程 等） 用5個詞描述基因工程的過程。（找、剪、連、轉(zhuǎn)、選） 第二章 天然DNA勺制備DNA變性：是指雙螺旋區(qū)氫鍵斷裂，空間結(jié)構(gòu)破壞，形成單鏈無規(guī)線團(tuán)狀態(tài)的過程。DNA復(fù)性：變性的DNA勺互補(bǔ)鏈在適當(dāng)條件下重新締合成雙螺旋的過程稱為DNA的復(fù)性。Tm值：將紫外吸收的增加量達(dá)最大量的一半時的溫度值稱為熔解溫度（Tm舉例說明濃縮DNA或 RNA勺方法。 乙醇沉淀法：在含陽離

6、子的DNA容液中，加入2倍體積的無水乙醇, 使DNA%淀。（采用的一價陽離子鹽有 NaAc NaCI或NH4Ac終濃度分別是0.25、1.0和2.0 moI/L ;為了可提高小片段（小于 200 bp）的回收率，可用MgCl2（終濃度為10 mmol/L）。）乙醇處理通常在4C、 10 min以上，若片段比較小（小于1kb），或量比較少（少于0.1 pg/ml）,則在-20 C甚至-70 C下沉淀，或延長沉淀的時間。此法沉鹽，影響酶切。 異丙醇沉淀法：在樣品中加1倍體積的異丙醇，冰上10 min以上，4 C下離心（12 000 g以上）10 min,干燥后溶入TE 20C （RNA于80 C）

7、保存。此法不沉鹽。 正丁醇抽提法：向DNA溶液中加入1倍體積的正丁醇，充分混勻, 以1600 r/min 離心I min，棄上相液體。如此重復(fù)至液體達(dá)到所需要的體積。然后用水飽和的乙醚抽提 DNA溶液兩次，去除正丁醇。最后在空氣中蒸發(fā)乙醚。 聚乙二醇濃縮法：將DNA溶液裝人透析袋，置于高濃度的聚乙二醇（PEG600溶液中，4 C下使DNA溶液濃縮至所需要的體積簡述DNA與基因工程有關(guān)的主要特性。1）變性：在一定的條件下，DNA雙鏈因鏈間氫鍵破壞而解鏈的過程。如溫度變性，90C足以使所有的DNA變性；其他，如pH離子強(qiáng)度、 脫水劑等。PCR2）復(fù)性：變性DNA分子因鏈間氫鍵恢復(fù)而重新形成雙鏈 D

8、NA的過程。若是溫度變性，當(dāng)緩慢降低溫度時，該過程得以進(jìn)行。以上是 反應(yīng)的依據(jù)。3）帶電性：一般pH下，帶負(fù)電荷，可電泳分離。4）水溶解性：DNA屬于生物大分子，且?guī)щ姾?，通常分子外形成水膜，可溶于水；但?dāng)電荷變化（如等電點）或水膜破壞時，就會沉淀,這是DNA提取和分離的依據(jù)。簡要說明天然DNA的主要提取過程。1）生物材料的準(zhǔn)備使材料處于提取DNA#率最高的時期,選取最容易提取和含量最高的組織。如細(xì)菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期;植物材料用幼嫩植株，且暗培養(yǎng)12天或黃化苗；動物以 肝臟為好，須將膽囊除盡。2）細(xì)胞的裂解裂解不夠，DNA#率低；裂解過猛，DNA斷裂。細(xì)菌可用溶菌酶、NaOh+ SDS煮沸

9、、冰凍或超聲波等方法處理。動植物組織，先粉碎材料，再裂解細(xì)胞。3） DNA勺分離和抽提根據(jù)待提DNA勺性質(zhì)，將其與其他組分分離，進(jìn)一步抽提 DNA般先按1:1（V:V）用酚、酚+氯仿、氯仿對裂解液分別進(jìn)行抽提,以除去蛋白質(zhì),然后按2:1用乙醇（V:V）或1:1用異丙醇（V:V）在酸性條件下(加1/10體積的3M NaAc pH4.8)沉淀DNA提取質(zhì)粒DNA寸，先調(diào)節(jié)裂解液的pH值到12.6，使所有DNA沉淀, 再調(diào)節(jié)pH值到中性，使質(zhì)粒DNA復(fù)性從沉淀中釋放出來。用 RNase水解除去RNA 制備大分子DNA應(yīng)注意的兩個原則：防止和抑制內(nèi)源Dnase對DNA 的降解；盡量減少溶液中 DNA的

10、機(jī)械剪切破壞。第三章分子克隆工具酶 限制性核酸內(nèi)切酶：一類能識別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列，并使每 條鏈的一個磷酸二酯鍵斷開的內(nèi)脫氧核糖核酸酶。同裂酶：識別序列相同而來源不同的酶。同尾酶：來源和識別序列各不相同，但產(chǎn)生出相同粘性末端的酶 限制酶的Star活性：在特定條件下，某些酶在非識別序列處切割 DNA的現(xiàn)象稱為Star活性。限制性圖譜：DNA分子上限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列分布圖稱限制 性圖譜(restriction map )，或物理圖譜 平末端；兩條鏈上的斷裂位置處在一個對稱結(jié)構(gòu)的中心所形式的斷 裂。粘性末端：兩鏈的斷裂位置交錯、對稱地繞著一個對稱軸排列所形成 的斷裂。銜接頭：一段已知

11、序列且含有限制性核酸酶切酶識別序列和粘性末端 的DNA片段連接子：一個較短的已知序列的且能都被限制性核酸酶切酶切割形成 特定粘性末端的DNA片段，片段未被內(nèi)切酶切割時是末端是平末端。連接酶：六大酶類之一,催化兩個不同分子或同一分子的兩個末端連 接的酶。基因工程中常用的酶有哪些？各有何的用途?限制性核酸內(nèi)切酶：識別 DNA的特異性序列，并在特定位點上切割DNA將兩條鏈上的一個磷酸二酯鍵斷開， 在基因工程操作中，用同一 內(nèi)切酶切割載體和目的基因，以形成相同的末端，用于目的基因和載 體連接。DNA連接酶：進(jìn)行缺刻修復(fù)，連接兩個 DNA分子；一般利用DNA連接酶將載體和目的基因連接起來DNA聚合酶：催

12、化DNA的合成，通常用于PCR反應(yīng)，以后的大量的目的基因。何謂定向克?。咳绾芜M(jìn)行?即將待克隆的核酸分子按一定的方向連接入載體的分子克隆方法1, 利用不同的限制性核算內(nèi)切酶切割目的基因的兩端，以形成不同的粘性末端2，在克隆載體的插入位置設(shè)置對應(yīng)的兩種不同的內(nèi)切酶位點，經(jīng)對應(yīng)的內(nèi)切酶切割后形成與目的基因互補(bǔ)的粘性末端3，DNA連接酶處理目的基因和克隆載體（克隆載體插入位置上設(shè)置兩 個不同的限制性內(nèi)切酶位點，在外源DNA分子兩端也放上相應(yīng)的兩個限制性酶切序列，經(jīng)限制性酶消化后，所產(chǎn)生的DNA黏性末端分別互 補(bǔ)結(jié)合，外源DNA就可定向插入載體。） 說明限制性核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生 Star活性的原因及其克服措

13、施。Star活性因限制酶種類、DNA和反應(yīng)條件的不同而不同，一般是由于一下原因:高濃度酶、高濃度甘油、低離子強(qiáng)度、Mn2取代Mg2+或咼pH?？朔胧?減少酶的用量，以避免過分酶切減少甘油濃度 保證反應(yīng)體系中無有機(jī)溶劑或乙醇 提高離子強(qiáng)度到100150mmol/L 降低反應(yīng)PH至PH7.0 保證使用Mg2+作為二價陽離子等第4、5章分子克隆載體1.載體：能將所承載的外源DNA片段（基因）帶入受體細(xì)胞，并在其中得以維持的DNA分子。2. 表達(dá)載體：含有強(qiáng)啟動子、外源基因可在啟動子的控制下轉(zhuǎn)錄成 mRNA并最終以蛋白質(zhì)的形式在宿主細(xì)胞中表達(dá)的載體。3. 報告載體：一種易于用生化方法檢測表達(dá)產(chǎn)物的基

14、因作為報告基因，通常由 P-Basic、p-Enhancer、p-Promoter、p-Control 組成的載體。4. 質(zhì)粒載體：以質(zhì)粒DNA分子為基礎(chǔ)構(gòu)建而成的載體，主要用于原核生物和植物的基因轉(zhuǎn)移以及建立基因組文庫和cDNA基因文庫。5. 質(zhì)粒：細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)一種自我復(fù)制的環(huán)狀雙鏈 DNA分子，能穩(wěn)定地獨立存在于染色體外，并傳遞到子代，一般不整合到宿主染色體上。6.CCC-DNA:超螺旋共價閉環(huán)DNA分子7. 遷移作用：由共存的結(jié)合型質(zhì)粒引發(fā)的非結(jié)合型質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象稱為遷移作用。8. 接合質(zhì)粒：含tra基因的質(zhì)粒，分子較大，拷貝數(shù)較少，宿主廣,不安全，使用時應(yīng)特別注意（tra基因，指令產(chǎn)生菌

15、毛（Pilus ），促 使宿主與受體接合，導(dǎo)致遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移）9. 非接合質(zhì)粒：不含tra 基因的質(zhì)粒，分子小，拷貝數(shù)多，不會自 行接合轉(zhuǎn)移，比較安全。10. 顯性質(zhì)粒（表達(dá)型質(zhì)粒）：除了控制與本身復(fù)制和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因外，還攜帶其他基因，使宿主呈現(xiàn)出新性狀的質(zhì)粒。11.隱蔽質(zhì)粒：宿主細(xì)胞含有，但無異樣性狀表露的質(zhì)粒 12.Cosmid （粘粒載體）：由質(zhì)粒和含有cos位點的入DNA片段組裝成 一類新的克隆載體13噬菌粒載體：由質(zhì)粒和單鏈?zhǔn)删w的部分序列重組而成的載體，稱為噬菌粒（Phagemid或Phasmid）。能以質(zhì)粒的方式進(jìn)行高拷貝復(fù)制（500）,在輔助噬菌體存在下，又能以M13噬菌體方式

16、進(jìn)行復(fù)制和 包裝。1kb14定位整合克隆載體：除了一般質(zhì)?？寺≥d體必須具備的元件外,還含一或兩個與整合平臺區(qū)域核苷酸同源的序列（長度最好在 以上）。通過同源重組，把外源DNA片段定位整合到整合平臺。15.整合平臺：指受體細(xì)胞基因組上給定的一個供外源DNA定位整合區(qū)域?？商幱诨騾^(qū)，也可處于基因間隔區(qū)。16.YAC （酵母人工染色體）：是將酵母染色體 DNA的端粒（TEL）、DNA復(fù)制起點（ARS和著絲粒（CEN以及必要的選擇標(biāo)記（HISA4和TRP1 基因序列克隆到PBR322中，構(gòu)建成YAC克隆載體。此克隆載體的sup4 基因上，組裝了供插入外源 DNA片段的克隆位點EcoRI17. PAC

17、（P1人工染色體）：利用P1噬菌體基因組元件所構(gòu)建的大片段DNA克隆系統(tǒng)。18. BAC（細(xì)菌人工染色體）：利用細(xì)菌的F質(zhì)粒及其調(diào)控基因為基礎(chǔ)構(gòu)建的用于在大腸桿菌中克隆大片段DNA（10A 300 kb）的細(xì)菌染色體克隆載體。19. 誘導(dǎo)型表達(dá)載體：指啟動子必須在特殊的誘導(dǎo)條件下才有轉(zhuǎn)錄活性或比較高的轉(zhuǎn)錄活性的表達(dá)載體。20. 反義表達(dá)載體：是利用人工合成或重組的與靶基因互補(bǔ)的一段反義DNA或 RNA片段，特異性地與靶基因結(jié)合，達(dá)到封閉其表達(dá)的目的。21. 組織特異性表達(dá)載體：是指有一些特殊的調(diào)控序列（如啟動子）可以調(diào)控基因只在一定的組織中有效的表達(dá)的載體。22. 松弛型質(zhì)粒：在細(xì)菌染色體外能

18、大量獨立復(fù)制的質(zhì)粒。每個細(xì)菌中可存在數(shù)百到數(shù)千個拷貝。23. 嚴(yán)謹(jǐn)性質(zhì)粒：復(fù)制受到嚴(yán)格控制，每個細(xì)胞中的數(shù)量只有12個，在一定的細(xì)胞周期內(nèi)復(fù)制；染色體不復(fù)制時，也不復(fù)制的質(zhì)粒。24. 附加體：一類在細(xì)菌和某些真核細(xì)胞中存在的染色體外的遺傳物質(zhì)，能在細(xì)胞中獨立存在并進(jìn)行自我復(fù)制， 也能整合到染色體，隨同 染色體的復(fù)制而進(jìn)行復(fù)制。25. 轉(zhuǎn)化子：受體菌直接吸收了來自供體菌的 DNA片段，通過交換,把它組合到自己的基因組中，經(jīng)這一過程而獲得外源遺傳物質(zhì)的受體 菌稱為轉(zhuǎn)化子。26. 重組子：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。27. 基因打靶：是指通過DNA定點同源重組，改變基因組中的某一特定基因，從而在生

19、物活體內(nèi)研究此基因的功能。28. 限制修飾系統(tǒng)：是一種存在于細(xì)菌（可能還有其他原核生物），可保護(hù)個體免于外來DNA（如噬菌體）侵入的系統(tǒng)，主要由限制內(nèi)切酶 和甲基化酶組成的二元系統(tǒng)。29. 質(zhì)粒不親和性：不同質(zhì)粒因親緣關(guān)系密切等原因而表現(xiàn)出不能寓于同一細(xì)胞中的特性30. 多克隆位點：DNA載體序列上人工合成的一段序列，含有多個限制內(nèi)切酶識別位點。能為外源 DNA提供多種可插入的位置或插入方案。31. a-互補(bǔ)：是指lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的P-半乳糖苷酶基因的突變體之間實現(xiàn)互 補(bǔ)。按來源可將基因克隆載體分為哪幾類？并說明各自的主要特點。質(zhì)粒（Plasm

20、id ） 噬菌體(phage) 病毒(virus ) 柯斯質(zhì)粒載體(cosmid) 人工染色體(如YAC BAC按功能分類：克隆載體、報告載體和表達(dá)載體。作為克隆載體必須具備的主要條件是什么?(1) 必須含有允許外源 DNA片斷組入的合適位點。并且這樣的克隆位點應(yīng)盡可能的多。(2) 克隆載體應(yīng)能攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞，或能在受體細(xì)胞中自我復(fù)制；或能整合到受體細(xì)胞 DNA中同步復(fù)制。(3) 克隆載體必須含有供選擇用的標(biāo)記基因。以有利于克隆子的篩選和鑒定。(4) 克隆載體必須是安全的，不應(yīng)含有對受體細(xì)胞有害的基因，并且不會任意轉(zhuǎn)入除受體細(xì)胞以外的其他生物的細(xì)胞，尤其是人的細(xì) 胞。作為表達(dá)載體必須

21、具備的主要條件是什么?如何鑒定轉(zhuǎn)化子、重組子和轉(zhuǎn)基因生物?第六章PCR技術(shù)及其應(yīng)用PCR即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個周期，循環(huán)進(jìn)行,使目的DNA#以迅速擴(kuò)增，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、 省時等特點。RT-PCR即反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是對特定的RNA分子進(jìn)行擴(kuò)增的技術(shù)，可分成兩個部分：（1）將目的RNA反轉(zhuǎn)錄（RT）形成cDNA;（2）以此cDNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR。定量PCR在PCF體系中加入熒光基因，利用熒光信號的累積實現(xiàn)實 時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，對起始模板定量分析的方法。反向PCR反向PC

22、R（inverse PCR）是用反向的互補(bǔ)引物來擴(kuò)增兩引物以外的未知序列的片段。RACE cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)是基于 mRN版轉(zhuǎn)錄和PCR技術(shù)建立起來的、以部分的已知區(qū)域序列為起點，擴(kuò)增基因轉(zhuǎn)錄本的未知區(qū)域， 從而獲得mRN完整序列的方法。簡單的說就是從轉(zhuǎn)錄本中快速增長CDNA5和CDNA3末端，進(jìn)而獲得獲得全長 cDNA的方法。（轉(zhuǎn)錄本是由一條基因通過轉(zhuǎn)錄形成的一種或多種可供編碼蛋白質(zhì)的成熟的mRN。TAIL-PCR熱不對稱交交錯PCF是一種用來分離與已知序列鄰近的未知DNA序列的分子生物學(xué)技術(shù)。該技術(shù)以基因組 DNA作為模板，利用依照目標(biāo)序列旁的已知序列設(shè)計的3個較高退火溫度的嵌套特異

23、性引物(special primer, SP),和一個較短且Tm值較低的隨機(jī)簡并 (arbitrarydegenerate, AD) 引物組合， 通過3輪具熱不對稱的溫 度循環(huán)的分級反應(yīng)來進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，獲得已知序列的側(cè)翼序列。PCR巢式PCR巢式PCF是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，使用兩對 引物擴(kuò)增完整的片段。第一對PCR引物擴(kuò)增片段和普通PCF相似 二對引物稱為巢式引物(因為他們在第一次PCRT增片段的內(nèi)部) 合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCRT增片段短于第一次擴(kuò)增。巢式PCR的好處在于，如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯誤片斷，則第二次能在錯誤片段上進(jìn)行引物配對并擴(kuò)增的概率極低。因此

24、，巢式PCR的擴(kuò) 增非常特異。特殊PCF主要有那些？各自的原理是什么？RT-PCR:RN在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下可以逆轉(zhuǎn)錄形成 CDNA,CDN可以在DNA聚合酶的作用下進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增。實時定量PCR: 反向PCR熒光基因在PCR反應(yīng)過程中能產(chǎn)生熒光信號，特殊設(shè)備可 以識別熒光信號，實時定量PCR過熒光信號的強(qiáng)弱來監(jiān)控 PCR反應(yīng)過程。RACE言使RNA勺具有5帽子結(jié)構(gòu)和3多聚A尾巴結(jié)構(gòu)，可以根據(jù)這個特點構(gòu)建引物，其中 5端利用酶切割后加上接頭，3端可以利用多聚T作為引物，從而快速構(gòu)建增長 CDNA5和CDNA3末端TAIL-PCR:利用依照目標(biāo)序列旁的已知序列設(shè)計的3個較高退火溫度的嵌套特異性引物，和

25、一個較短且Tm值較低的隨機(jī)簡并引物組 合，通過3輪具熱不對稱的溫度循環(huán)的分級反應(yīng)來進(jìn)行 PCRT增，獲得已知序列的側(cè)翼序列。巢式PCR 巢式PCF是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，使用兩對PCR引物擴(kuò)增 完整的片段。第一對PCR引物擴(kuò)增片段和普通PCF相似。第二對引物 稱為巢式引物(因為他們在第一次PCR擴(kuò)增片段的內(nèi)部)結(jié)合在第一 次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次 PCR擴(kuò)增片段短于第一次擴(kuò)增。巢式PCR的好處在于，如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯誤片斷，則第二次能在錯誤片段上進(jìn)行引物配對并擴(kuò)增的概率極低。如何設(shè)計PCR引物?引物長度：15-30bp，常用為20mer左右，有效長度不能大 于38mer引物

26、擴(kuò)增跨度：以500bp為宜,特定條件下可擴(kuò)增長至10kb 引物堿基：G+C含量以40-60%為宜 避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu) 引物3 端的堿基要求嚴(yán)格配對，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基, 以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致 PCF失敗 引物5有或加上合適的酶切位點 引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性 引物量：每條引物的濃度 0.1 lumol或10 - 100 pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好 試述PCF反應(yīng)的原理與應(yīng)用.原理：類似于DNA勺天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端 互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu) 成：模板DNA勺變性：模

27、板DNA經(jīng)加 熱至93C左右一定時間后, 使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCRT增形成的雙鏈DNA軍離，使之成為單鏈, 以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火（復(fù) 性）:模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至 55 C左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；引物的延伸：DNA模板-弓I物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多 的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。應(yīng)用：PCF技術(shù)的主要應(yīng)用于基因克隆，即利用 PC

28、R技術(shù)擴(kuò)增目的基因；基因檢測，如遺傳病的檢測；基因配型，如HLA系統(tǒng)基因分析;基因鑒定，如親子鑒定第7、8章 目的基因制備與篩選策略SSH （抑制性減法雜交）：是一種將檢測子cDNA單鏈標(biāo)準(zhǔn)化步驟和消減雜交步驟結(jié)合為一體的技術(shù)，其核心技術(shù)是抑制性PCRRDA代表性差別分析技術(shù)）：是一種利用PCF具有指數(shù)形式擴(kuò)增雙鏈,線性形式擴(kuò)增單鏈模板的特性，通過降低 cDNA群體的復(fù)雜度和多次更換cDNA兩端接頭引物等方法，達(dá)到克隆基因的目的的技術(shù)。DDRT-PCRmRNAI別顯示或稱差別顯示反轉(zhuǎn)錄 PCR：是由Liang和Pardee（1992）建立的一種分離、鑒定差別表達(dá)基因的方法，具有與PCR技術(shù)相似

29、的簡單、快捷和高效等特點。ESTs利用表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）即基因序列中一段含有足夠的結(jié)構(gòu)信息以顯示出該基因與其他基因的差異，能特異地標(biāo)記或表征基因的 序列，長100 500 bp，來尋找新基因的策略即為表達(dá)序列標(biāo)簽法 (ESTs)。酵母雙雜交：是根據(jù)真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控的特點創(chuàng)建的一種體內(nèi)鑒定基因的方法，是一種研究蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)之間的相互作用的技術(shù)，特別 是研究蛋白質(zhì)亞基和另一亞基的相互作用。cDNA文庫：由cDNA勺一套隨機(jī)片段構(gòu)成，其中每個片斷連在一個單獨的載體分子上，儲存在宿主（大腸桿菌、噬菌體等）中并能繁殖擴(kuò) 增，這樣包含著細(xì)胞全部mRN信息的cDNA克隆集合稱為該組織細(xì)胞 的cDNA文

30、庫?；蚪M文庫：是指將某種生物體的全部基因組 DNA用限制性內(nèi)切酶或機(jī)械力量切割成一定長度范圍的 DNA片段，再與合適的載體在體外重組并轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主細(xì)胞獲得的所有陽性菌落?；蛭膸欤夯蚩寺〉娜后w。包括互補(bǔ) DNA文庫和基因組文庫等。簡述cDNA文庫構(gòu)建的原理與步驟 原理：高等生物具有大約104-5種基因，但在一定發(fā)育階段的單個細(xì) 胞或個體中，僅15%左右的基因表達(dá)?？梢娪蒻RNA出發(fā)反轉(zhuǎn)錄而產(chǎn) 生的cDNA克隆，其復(fù)雜程度要比直接從基因組克隆簡單得多。（不明） 步驟：先提總RNA再純化mRNA 合成第一鏈cDNA 將mRNA-DN轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA 將合成的雙鏈cDNA重組到載體上，導(dǎo)入寄主

31、增殖簡述基因組文庫構(gòu)建的原理與步驟 原理：通過克隆載體使某種生物基因組的全部遺傳信息貯存于一個受 體菌的群體，（不確定） 步驟：提取研究對象基因組 DNA制備合適大小的DNA片段，或提取組織或器官的mRN并反轉(zhuǎn)錄成cDNADNA片段或cDNA與經(jīng)特殊 處理的載體連接形成重組DNA重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或體外包裝 后侵染受體菌；陽性重組菌落或噬菌斑的選擇。簡述酵母雙雜交的原理與步驟基本原理：釀酒酵母的半乳糖苷酶基因的轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4的 N端 1147位氨基酸區(qū)段為一 DNA吉合域（BD, C端768881位氨基酸為一轉(zhuǎn)錄激活域（AD。DNA-BD識別GAL4效應(yīng)基因的上游激活序列（UAS，并

32、與之結(jié)合。而AD則通過同轉(zhuǎn)錄必須的其它成份間的結(jié)合作用，啟動UAS下游的基因轉(zhuǎn)錄。通過DNA重組把BD與AD分開，并在同一細(xì)胞中表達(dá)出 BD和AD多肽，但由于彼此間的空間隔離，不會發(fā)生相互作用，故不能 激活效應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄。若將BD和AD分別與來自能結(jié)合的兩個蛋白的基 因融合，BD和AD則在體內(nèi)重新組裝成具有功能的轉(zhuǎn)錄因子（圖） 激活UASr游啟動子調(diào)節(jié)的報告基因的表達(dá)。步驟：將已知蛋白質(zhì)的編碼基因插入 PGBT9同時把cDNA片段克隆在PGAD424h,構(gòu)成cDNA表達(dá)文庫。提取上述兩種質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)化酵 母寄主菌株HF7C （具報告基因UAS-promoter-HIS3 ）。在缺少Leu和Trp的

33、培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以便挑選有兩種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子；同時也在缺少His、Leu和Trp的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以便挑選能表達(dá)相互作用的雜合蛋白的陽性菌落，從而克隆到與已知蛋白質(zhì)相互作用的 CDNA。分離目的基因的方法:1）直接分離: 限制酶酶切分離法（適于從簡單基因組分離目的基因，如質(zhì)粒 和病毒） 物理化學(xué)法（DNA片段的堿基組成差異較大，其理化性質(zhì)明顯不同，如浮力密度和解鏈溫度等）有：密度梯度離心法、單鏈酶解法及分子雜交法等。 雙抗體免疫法（適用于已分離純化且足以產(chǎn)生特定抗體的蛋白 質(zhì)） 反轉(zhuǎn)錄法2）構(gòu)建基因組文庫分離3）構(gòu)建cDNA基因文庫分離4）利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR擴(kuò)增目的基因5）基因的化學(xué)合成（自

34、學(xué)）篩選目的基因的方法:1）根據(jù)功能篩選: 特異蛋白分離法（根據(jù)特異蛋白的氨基酸序列，按照遺傳密碼及其簡并性人工合成特異簡并探針，從文庫中篩選相應(yīng)的基因） 功能互補(bǔ)法（利用克隆片段與寄主細(xì)胞染色體DNA在功能上的互補(bǔ)性直接分離目的基因）。2）根據(jù)序列篩選 已知基因序列或同源基因序列克隆法 表達(dá)序列標(biāo)簽法 基因表達(dá)系列分析法（用來分離不同發(fā)育階段和生理狀態(tài)下差 別表達(dá)基因）3）差別雜交及減法雜交法 差別雜交法（無可供選擇的探針，也無任何有關(guān)目的基因的序列信息時，可采用此法；該法特別適于分離特定組織或特定發(fā)育階段特異表達(dá)基因以及誘導(dǎo)表達(dá)基因）mRNA 減法雜交技術(shù)（通過 DNA復(fù)性動力學(xué)原理富集目

35、的基因，并以此構(gòu)建減數(shù)文庫分離克隆目的基因；尤其適于某些低豐度的cDNA克?。?）差別顯示法mRNA!別顯示也稱DDRT-PCR一種分離、鑒定差別表達(dá)基因的方法；幾乎可檢所有表達(dá)基因；可同時比較多種細(xì)胞類型；可同時展現(xiàn)所有差異；可同時檢測基因的上調(diào)和下調(diào)表達(dá)。） 代表性差別分析技術(shù) 抑制性減法雜交（SSH5)功能結(jié)合法6)DNA插入誘變法（主要用于植物基因克隆分離） 有轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽 法；T-DNA標(biāo)簽法7）基因定位克隆法（是人類或植物基因的克隆中常用方法，主要根據(jù)目的基因在基因組上的位置特性而不是編碼產(chǎn)物來克隆基因。8）分子間相互作用克隆法第9章轉(zhuǎn)基因及其表達(dá) 轉(zhuǎn)化：重組質(zhì)粒通過與膜蛋白結(jié)合進(jìn)入

36、受體細(xì)胞， 并在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn) 定維持和表達(dá)的過程稱之為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化子：經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得外源遺傳物質(zhì)的細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)化子。感受態(tài)細(xì)胞：感受態(tài)細(xì)胞指處于能吸收周圍環(huán)境中 DNA分子的生理狀態(tài)的細(xì)胞。融合蛋白：通過基因工程方法將編碼不同蛋白質(zhì)的基因片段按照正確 的讀框進(jìn)行重組，將其表達(dá)后獲得的新蛋白質(zhì)。包涵體：在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子, 它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水 不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體(In elusion Bodies ，IB )。轉(zhuǎn)基因沉默(transgene silencing):指外源基因在轉(zhuǎn)基因生物中 不能正常表達(dá)的現(xiàn)象, 啟動子(pro

37、moter )是一段提供RNA聚合酶識別和結(jié)合的DNA序列,它位于基因的上游。其長度因生物的種類而異，一般不超過200b P。啟動子是基因表達(dá)調(diào)控的重要順式元件，具有如下特征：序列特異性;方向性；位置特性；種屬特異性。增強(qiáng)子(enhancer):能夠增強(qiáng)啟動子轉(zhuǎn)錄活性的 DNA序列。其結(jié)構(gòu)類似于啟動子，由1多個元件組成，每個元件可以與一種或多種 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合。增強(qiáng)子長 501500bp終止子(term in ator ): 終止轉(zhuǎn)錄的序列。絕緣子(insulator ):是基因表達(dá)的調(diào)控元件，也是一種邊界元件, 能阻止臨近的調(diào)控元件對其所界定基因的啟動子起增強(qiáng)或抑制作用。SD序列：存在于原

38、核生物起始密碼子 AUG上游712個核苷酸處的一種4 7個核苷酸的保守片段，它與16S rRNA 3端反向互補(bǔ)，所以可將mRNA勺AUG起始密碼子置于核糖體的適當(dāng)位置以便起始翻譯 作用。外顯子：基因組DNA中出現(xiàn)在成熟RNA分子上的序列。外顯子被內(nèi)含 子隔開，轉(zhuǎn)錄后經(jīng)過加工被連接在一起，生成成熟的RNA分子。信使核糖核酸（mRNA所攜帶的信息參與指定蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸排列。內(nèi)含子：真核生物細(xì)胞 DNA中的間插序列。這些序列被轉(zhuǎn)錄在前體RNA中，經(jīng)過剪接被去除，最終不存在于成熟RNA分子中。內(nèi)含子和外顯子的交替排列構(gòu)成了割裂基因。在前體RNA中的內(nèi)含子常被稱作“間插序列”。反義RNAantise

39、nse RNA是一類與特定DNA序列互補(bǔ)的小分子RNA編碼反義RNA的DNA稱為反義子RNA interferenee （RNAi）:由雙鏈RNA啟動，在多種酶參與下，經(jīng)過一系列步驟（包括siRNA的形成和雙鏈降解等）將同源RNA降解的 現(xiàn)象。簡述轉(zhuǎn)基因的主要方法與原理1）轉(zhuǎn)化 Ca2+誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化（Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱擊收縮，使胞膜出現(xiàn)空隙，便于外源DNA進(jìn)入。） 電穿孔法轉(zhuǎn)化（在強(qiáng)大電場的作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫 隙，質(zhì)?；駾NA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。） 三親本雜交接合轉(zhuǎn)化 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 基因槍轉(zhuǎn)化2）轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過入噬菌體（病毒）顆粒感染途徑將外源 D

40、NA分子轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞內(nèi)的過程。簡述重組子的篩選與分子鑒定的主要方法和原理 篩選:1）載體遺傳標(biāo)記檢測抗藥性篩選法 營養(yǎng)缺陷型篩選（載體分子上攜帶某種營養(yǎng)組份的合成基因，而受 體細(xì)胞本身不能合成這一營養(yǎng)組份，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在不含此營養(yǎng)組 份的培養(yǎng)基上，長出的便是轉(zhuǎn)化子） 顯色篩選法（載體分子上攜帶某種顯色酶基因，其表達(dá)產(chǎn)物能使細(xì) 胞產(chǎn)生顏色反應(yīng)，從而易于辨認(rèn)和挑選）2）克隆DNA序列檢測（可用于鑒定）限制性酶切圖譜法（對載體上插入的外源DNA片段進(jìn)行酶切圖譜分 析，并以此與目的基因的已知圖譜對比， 因此利用這種方法不僅能區(qū)分重組子與非重組子，而且還能鑒定目的重組子。）菌落噬菌斑原位雜交法（根據(jù)

41、克隆的目的基因或 DNA片段的同源序列設(shè)計并合成探針，以此搜尋篩選含有目的基因的目的重組子。） DNA序列分析法（在DNA聚合反應(yīng)的進(jìn)程中，通過位點特異性終止 測定DNA序列）3）外源基因表達(dá)產(chǎn)物檢測重組子的分子鑒定1）分子大小鑒定2）限制酶酶切3）利用PCR方法篩選確定重組子4）核酸分子雜交檢測法（具有一定同源性的兩條核酸（DNA或 RNA單鏈在適宜的溫度及離子強(qiáng)度等條件下，可按堿基互補(bǔ)配對原則高度 特異地復(fù)性形成雙鏈。該技術(shù)用于重組子鑒定時，雜交的雙方是待測 序列和已知核酸片段（稱為探針）。）真核基因表達(dá)調(diào)控的特點: 表現(xiàn)為在特定的時間和特定的細(xì)胞內(nèi)或在特定外界條件下特定基因 表達(dá)，從而實

42、現(xiàn)有序的、不可逆轉(zhuǎn)的分化發(fā)育過程。因此，特定基因 的表達(dá)依賴于一套特定的轉(zhuǎn)錄因子與 DNA調(diào)控元件之間的相互作用）大多數(shù)真核生物的增強(qiáng)子包含多個不同轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點）當(dāng)信號 傳至細(xì)胞核時，觸發(fā)特定激活物與特定增強(qiáng)子準(zhǔn)確結(jié)合， 形成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA相互作用的網(wǎng)絡(luò)，從而激活或促進(jìn)轉(zhuǎn)錄）說明轉(zhuǎn)基因沉默的機(jī)制與克服措施）轉(zhuǎn)基因沉默（transgene silencing）:指外源基因在轉(zhuǎn)基因生物中不能正常表達(dá)的現(xiàn)象，其機(jī)制主要有:1）位置效應(yīng)：指基因表達(dá)受其在基因組中的位置影響的現(xiàn)象克服措施：基因打靶（定位整合）2）轉(zhuǎn)錄水平沉默：是在 DNA水平上的基因調(diào)控，主要由啟動子甲基化或外源基

43、因的異染色質(zhì)化引起。克服措施：篩選單拷貝插入重組子、選用限制修飾系統(tǒng)缺陷型受體細(xì) 胞。3）轉(zhuǎn)錄后水平沉默：是在 RNA水平上的基因調(diào)控，更普遍。特點是外源基因能夠轉(zhuǎn)錄，但mRNA合成后就被降解或被相應(yīng)的反義 RNA或蛋白質(zhì)封閉，因而不能指導(dǎo) mRNA勺翻譯?？朔胧罕M量避免（如利用編碼序列的簡并性等）。4）翻譯后沉默：主要是受體細(xì)胞的蛋白酶降解外源蛋白?？朔胧? 融合表達(dá)、分泌表達(dá)、包涵體表達(dá)、選用蛋白酶缺陷型受體。作為基因工程宿主必須具備的主要條件: 便于重組DNA導(dǎo)人。 能使重組DNA急定存在。 便于重組體的篩選。 遺傳穩(wěn)定，易于擴(kuò)大培養(yǎng)或發(fā)酵生長。 安全，無致病性，不造成環(huán)境污染。

44、利于外源基因表達(dá)產(chǎn)物積累，或能促進(jìn)其高效分泌表達(dá)。 遺傳密碼無明顯偏倚性。 具有較好的翻譯后加工機(jī)制。 應(yīng)用價值高。第10章細(xì)菌基因工程 融合表達(dá)：目的基因與編碼具有特殊活性的多肽或蛋白質(zhì)的基因融 合，構(gòu)建成一個融合蛋白基因，不改變兩個基因閱讀框的基因表達(dá)方 式。融合蛋白：將外源基因與受體菌基因重組在一起，但不改變兩個基因 閱讀框而表達(dá)的蛋白。分泌表達(dá)：外源基因含有指導(dǎo)信號肽的表達(dá)的序列，使得表達(dá)產(chǎn)物通 過運輸或分泌的方式穿過細(xì)胞外膜進(jìn)入培養(yǎng)基的基因表達(dá)方式 包涵體：包涵體是在一定條件下，外源基因的表達(dá)產(chǎn)物在大腸桿菌中 積累并致密的聚集在一起形成無膜的裸露結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)導(dǎo)：借助病毒、噬菌體或其他方法

45、將外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞并整合到宿 主基因組上的方法。轉(zhuǎn)化：通過外源DNA片段傳遞遺傳信息的過程。轉(zhuǎn)染：利用物理，化學(xué)的方法使受體細(xì)胞從環(huán)境中吸收 DNA勺方法表面展示：將外源基因的表達(dá)產(chǎn)物定位在微生物表面的基因工程技試述促進(jìn)轉(zhuǎn)基因在大腸桿菌中表達(dá)的策略。答：1、優(yōu)化表達(dá)載體的設(shè)計2、提高稀有密碼子tRNA的表達(dá)作用3、提高外源基因mRNA勺穩(wěn)定性4、提高外源基因表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性5、優(yōu)化發(fā)酵過程簡述原核生物基因工程常用的載體和受體細(xì)胞。答：原核生物基因工程常用的受體細(xì)胞有大腸桿菌，枯草芽孢桿菌, 鏈霉菌，藍(lán)藻等常用的載體：大腸桿菌表達(dá)載體 PBR-322, PUC-18 PUC-19;Gst融合表

46、達(dá)載體PGEX,枯草芽孢桿菌整合載體P DG1730.簡述細(xì)菌基因工程的主要應(yīng)用?答：1、在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中生產(chǎn)基因工程農(nóng)藥,抗蟲抗病重組微生物，微生物肥料等。2、在食品和工業(yè)中生產(chǎn)基因工程菌,以產(chǎn)生改良的益生菌，生產(chǎn)酶制劑等。3、重組DNA技術(shù)生產(chǎn)醫(yī)用抗生素4、利用環(huán)境微生物基因工程菌處理環(huán)境中的廢棄物簡述外源基因在細(xì)菌中的主要表達(dá)形式及優(yōu)缺點。答：包涵體 優(yōu)點：主要存在于細(xì)胞質(zhì)，少數(shù)在細(xì)胞周質(zhì)中；易于 分離純化：包涵體水難溶性和密度遠(yuǎn)大于其他蛋白， 通過高速離心即 可分離；對蛋白酶有較好的抗性。缺點：沒有正確的空間構(gòu)象，因而 無生物活性。融合蛋白優(yōu)點：利用tag的特性對融合蛋白進(jìn)行親和層析等 分

47、離提純，因而大大簡化了重組蛋白的純化過程； 保護(hù)外源蛋白不受 宿主內(nèi)蛋白酶的降解 缺點：進(jìn)行基因工程操作比較復(fù)雜，成功融合 的蛋白種類不多 分泌型蛋白 優(yōu)點：簡化了發(fā)酵后處理的純化工藝；減少了外 源蛋白在細(xì)胞內(nèi)被蛋白酶降解的概率； 有利于形成正確的構(gòu)象，獲得較好的生物學(xué)活性或免疫原性的蛋白質(zhì)。缺點：要在外源蛋白的 N端加入添加編碼信號肽的DNA序列，基因操作相對復(fù)雜，同時不能確 保高效的分泌。 整合型外源蛋白 優(yōu)點：外源基因整合在染色體特定部位， 隨著基因組基因穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)缺點：需整合的載體一般是不能在 受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行自主復(fù)制的質(zhì)?；驕囟让舾行唾|(zhì)粒。第11章酵母基因工程YEp （酵母附加體

48、質(zhì)粒）Yip （酵母整合質(zhì)粒）:是以細(xì)菌質(zhì)粒為基礎(chǔ)并攜帶有一個段酵母基因能整合到酵母染色體上YRp （酵母復(fù)制質(zhì)粒）YCp （酵母著絲粒質(zhì)粒） 營養(yǎng)缺陷型：對某些必需的營養(yǎng)物質(zhì)（如氨基酸）或生長因子的合成能力出現(xiàn)缺陷的變異菌株或細(xì)胞。必須在基本培養(yǎng)基（如由葡萄糖和無機(jī)鹽組成的培養(yǎng)基）中補(bǔ)加相應(yīng)的營養(yǎng)成分才能正常生長。簡要描述表面展示原理。酵母表面展示主要采用與酵母匹配有關(guān)的a-凝集素和a-凝集素作為骨架蛋白，與外源基因編碼的蛋白質(zhì)或多肽相融合，使外源基因編碼的蛋白質(zhì)或多肽表達(dá)在酵母細(xì)胞壁表面。具體見書本284頁。酵母基因工程的主要宿主有哪些1）釀酒酵母；2）乳酸克魯維酵母；3）畢赤酵母;4）多

49、形漢遜酵母；5）粟酒裂殖酵母；6）解脂耶氏酵母酵母基因工程的載體有哪些 ？各有和特點？釀酒酵母附加型表達(dá)載體（pYES2 ；畢赤酵母整合型分泌表達(dá)載體（pP IC9K酵母轉(zhuǎn)基因的方法有哪些？ 酵母DNA轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體法 離子溶液法 電穿孔法為什么說酵母是一個非常重要的基因工程宿主1）全基因組測序，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚，遺傳操作簡便;2）具有原核細(xì)菌無法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng);3）大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久、技術(shù)成熟、工藝簡單、成本低廉;4）能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中;5）不含有特異性的病毒、不產(chǎn)內(nèi)毒素，美國FDA認(rèn)定為安全的基因工程受體系統(tǒng)(Generally Recognized As Safe GRAS )；6）酵母菌是最簡單的真核模式生物酵母基因工程的應(yīng)用:1）利用畢赤酵母生產(chǎn)飼料用植酸酶 2）利用淀粉釀酒酵母的基因工程 3）酵母表達(dá)異源蛋白（詳見 P286）第12章植物基因工程 植物整體轉(zhuǎn)化: 全能性：指個體某個器官或組織已經(jīng)分化的細(xì)胞在適宜的條件下再 生成完整個體的遺傳潛力。組成型表達(dá)啟動子：在該類啟動子控制下，結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)大體恒定 在一定水平上，在不同組織、部位表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異。組織特異啟動子：在這啟動子調(diào)控下，基因往往只在某些特定的器官 或組織部位表達(dá)，并表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。啟動子誘導(dǎo)型啟動子：是指在某些特定的物理或化學(xué)信號的刺激