氧自由基與心肌缺血再灌注損傷

1、缺血性心臟病是導(dǎo)致人類死亡的主要原因，在治療上，早期成功恢復(fù)心肌再灌注是改善臨床轉(zhuǎn)歸的最有效方法。但缺血心肌恢復(fù)血流的過(guò)程可造成損傷，這一現(xiàn)象稱為心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia/reperfusion injury,MI/RI)12。而氧自由基（oxygen free radical,OFR）也是心血管疾病時(shí)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞死亡的重要因素之一3。在正常生理?xiàng)l件下，細(xì)胞內(nèi)存在抗氧化物質(zhì)可以及時(shí)清除OFR，使自由基的生成與降解處于動(dòng)態(tài)平衡，對(duì)機(jī)體無(wú)害，而在心肌缺血再灌注損傷情況下，由于OFR生成過(guò)多或機(jī)體抗氧化能力不足，引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，介導(dǎo)心肌損傷45。本研究重點(diǎn)闡述O

2、FR與心肌缺血再灌注損傷之間的關(guān)系。 1 OFR合成、清除及生物學(xué)作用 自由基（free radical）是指具有一個(gè)不配對(duì)電子的原子和原子團(tuán)的總稱。由氧誘發(fā)的自由基稱為OFR，主要包括超氧陰離子(O-2)、過(guò)氧化氫(H2O2)和羥自由基(OH)6。H2O2本身并非自由基而是一種活性氧(reactive oxygen species,ROS)，但它與OFR的產(chǎn)生有密切關(guān)系，易接收一個(gè)電子生成羥自由基（OH）。正常情況下OH不能形成，因?yàn)镺H的形成要求O-2及H2O2同時(shí)存在。當(dāng)O-2及H2O2在組織中過(guò)剩, O-2及H2O2在金屬離子及金屬離子復(fù)合物的催化下發(fā)生HaberWeiss反應(yīng)，生成氧

3、化性更強(qiáng)的OH。OH是十分不穩(wěn)定的氧化物，幾乎與細(xì)胞內(nèi)所有的有機(jī)物反應(yīng)，破壞核酸、蛋白質(zhì)、氨基酸和脂類化合物，從而損害細(xì)胞功能7。在生理情況下，氧通常是通過(guò)細(xì)胞色素氧化酶系統(tǒng)接收4個(gè)電子還原生成H2O，同時(shí)釋放能量，但也有1%2%的氧接收1個(gè)電子生成O-2，或再接收1個(gè)電子生成H2O2。O-2壽命極短，可通過(guò)連鎖反應(yīng)產(chǎn)生OH，H2O2能直接或間接促進(jìn)細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化。 自由基反應(yīng)的擴(kuò)展較廣，但生物體內(nèi)存在一套完整的抗氧化酶和抗氧化劑系統(tǒng)，可以及時(shí)清除它們，所以對(duì)機(jī)體無(wú)害。抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSHPX)和過(guò)氧化氫酶(CAT)。它們存在于胞漿和線粒體中，其重

4、要意義在于降低H2O2濃度，保護(hù)細(xì)胞不受強(qiáng)毒性O(shè)FR OH的損傷?？寡趸瘎┌ù嬖谟诩?xì)胞質(zhì)的維生素E和維生素A；細(xì)胞外液中的半胱氨酸、抗壞血酸、谷胱甘肽；存在胞漿中的還原型谷胱甘肽(GSH)和還原型病理輔酶(NADPH)等。在OFR清除系統(tǒng)功能降低或喪失,生成系統(tǒng)活性增強(qiáng)，一旦恢復(fù)組織血液供應(yīng)和氧供,OFR便大量產(chǎn)生與急劇堆積，從而造成心肌細(xì)胞急性或慢性損傷8。特異靶向抑制NADPH氧化酶可以減弱心血管氧化應(yīng)激9。 2 OFR在心肌缺血再灌注損傷中的作用及地位 目前關(guān)于心肌缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制有許多假設(shè)和報(bào)道，主要與心肌再灌注時(shí)與OFR損傷、細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、心肌細(xì)胞能量代謝障礙10、微

5、血管損傷和粒細(xì)胞浸潤(rùn)以及心肌細(xì)胞的凋亡等作用有關(guān)。MI/RI時(shí)OFR合成增多主要與線粒體單電子還原、黃嘌呤氧化酶形成增多、兒茶酚胺自氧化增強(qiáng)、細(xì)胞內(nèi)鈣超載以及中性粒細(xì)胞呼吸暴發(fā)等有關(guān)11 。由于OFR產(chǎn)生過(guò)多以及抗氧化酶類活性下降，引發(fā)鏈?zhǔn)街|(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，損傷細(xì)胞膜、細(xì)胞器乃至細(xì)胞核酸，導(dǎo)致細(xì)胞壞死凋亡。應(yīng)用外源性O(shè)FR清除劑及抗氧化劑則能降低組織中OFR濃度，促進(jìn)心功能恢復(fù)，表明OFR在心肌缺血再灌注損傷中起著重要作用。 3 OFR與脂質(zhì)生物膜 心肌缺血再灌注損傷時(shí)，通過(guò)黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)、激活的中性粒細(xì)胞、線粒體呼吸鏈功能異常產(chǎn)生大量OFR。膜流動(dòng)性降低，通透性增加, 膜上蛋白質(zhì)或酶損傷、失

6、活以及脂質(zhì)過(guò)氧化作用的有毒產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞與亞細(xì)胞膜，細(xì)胞器產(chǎn)生毒性效應(yīng)等12，表明由OFR介導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化物的過(guò)度激活是造成缺血再灌注損傷的關(guān)鍵因素。 3.1 生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化降低脂膜流動(dòng)性 膜流動(dòng)性是生物膜結(jié)構(gòu)的基本特征，細(xì)胞膜的各種重要功能如能量轉(zhuǎn)換、信息傳遞、細(xì)胞識(shí)別都與膜的流動(dòng)性密切相關(guān)，膜流動(dòng)性是細(xì)胞維持正常生理功能的必要條件 13。由于生物體內(nèi)不飽和脂肪酸主要存在于細(xì)胞膜的類脂中，所以質(zhì)膜和亞細(xì)胞器是脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的主要部位。亞細(xì)胞器的磷質(zhì)比質(zhì)膜所含的多價(jià)不飽和脂肪酸多，因此亞細(xì)胞器對(duì)過(guò)氧化更敏感，其中線粒體膜中的心肌磷脂的氧化可能是導(dǎo)致心肌能量代謝障礙重要的原因14，隨著脂質(zhì)過(guò)氧化含

7、量增多細(xì)胞膜多價(jià)不飽和脂肪酸明顯減少，生物膜PUFA/蛋白質(zhì)比例失常，從而導(dǎo)致膜流動(dòng)性發(fā)生改變。 3.2 脂質(zhì)生物膜過(guò)氧化改變膜酶、離子通道的脂質(zhì)微環(huán)境 脂質(zhì)微環(huán)境的改變使膜通透性增高，引起細(xì)胞內(nèi)離子失調(diào)(Na+、Ca2+等失調(diào))，細(xì)胞外鈣內(nèi)流。鈣內(nèi)流和鈣分隔機(jī)制的失調(diào)導(dǎo)致了缺血再灌注心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載，而鈣也會(huì)加速OFR形成，導(dǎo)致脂質(zhì)膜損傷，加劇惡性循環(huán)15。Ling等16研究證明，OFR與不飽和脂肪酸反應(yīng)形成的丙二醛能使膜蛋白和磷脂之間形成膠聯(lián)聚合，直接破壞膜的磷脂雙層，導(dǎo)致蛋白質(zhì)不可逆性失活，進(jìn)一步使膜的基本特征如變構(gòu)、離子傳遞、酶活性等發(fā)生改變，干擾細(xì)胞正常過(guò)程，使細(xì)胞膜損傷加重，這可能

8、是細(xì)胞由可逆損傷變?yōu)椴豢赡鎿p傷的基礎(chǔ)。 3.3 生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化使呼吸鏈活性受損 線粒體富含心磷脂，它具有高度不飽和性，對(duì)氧化應(yīng)激敏感性高。線粒體呼吸鏈通過(guò)“滲漏機(jī)制”產(chǎn)生OFR17，當(dāng)OFR濃度過(guò)高時(shí)，可能導(dǎo)致線粒體細(xì)胞色素C氧化、ATP合成酶的活性降低。同時(shí)OFR可能激活磷脂酶A2降解膜脂質(zhì)，使線粒體結(jié)構(gòu)受損。受損的線粒體膜引起線粒體膜通透性的改變，使線粒體質(zhì)子濃度梯度下降，致凋亡因子釋放介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。 4 OFR與心肌細(xì)胞凋亡 有研究表明，MI/RI的發(fā)生與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。正常情況下，在生物體內(nèi)，氧化與抗氧化處于平衡狀態(tài)，細(xì)胞代謝需要OFR，如低濃度的OFR能促進(jìn)細(xì)胞增生。但當(dāng)某些

9、因素一旦打破這種平衡，使OFR產(chǎn)生增多，即可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡18，甚至細(xì)胞損傷致死。細(xì)胞凋亡與OFR有著復(fù)雜的關(guān)系，細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，10-9molL水平的OFR促進(jìn)細(xì)胞增殖，10-6molL水平的OFR引起細(xì)胞凋亡，10-3 molL水平的OFR引起細(xì)胞的損傷死亡19。 近年來(lái)隨著分子心血管病學(xué)研究的不斷發(fā)展，心肌細(xì)胞凋亡在心肌缺血再灌注損傷的病理生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用20。多項(xiàng)研究顯示，OFR是啟動(dòng)凋亡的重要因子之一，采用抗氧化劑和自由基清除劑可有效抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。OFR誘發(fā)凋亡的機(jī)制尚未完全闡明，其可能機(jī)制為：（1）直接損傷DNA誘導(dǎo)凋亡。有研究表明，心肌再灌注損傷中NO與活性氧中間物

10、（reactive oxygen intermediate，ROI）生成ONOO-氧化損害蛋白質(zhì)、脂類和核酸，通過(guò)半胱天冬酶途徑誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡21。（2）誘發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化來(lái)影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，激發(fā)相關(guān)調(diào)控基因?qū)е碌蛲觯渲芯€粒體起著重要的作用。大量的活性氧選擇性地使離子通透性喪失或使線粒體膜通透性發(fā)生改變，線粒體膜勢(shì)能改變進(jìn)而引起線粒體釋放細(xì)胞凋亡起始因子或細(xì)胞凋亡蛋白酶激活因子1，進(jìn)一步激活天冬氨酸特異性的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，從而誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生22。（3）激活轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1(activating protein,AP1)和細(xì)胞核因子B（NFB），后者可通過(guò)上調(diào)腫瘤壞死因子和白介素6

11、而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生20。細(xì)胞凋亡時(shí)線粒體結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生亞結(jié)構(gòu)水平上的重構(gòu)，并將凋亡基因調(diào)節(jié)蛋白釋放人細(xì)胞質(zhì)中，這些蛋白包括細(xì)胞色素C等，能進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生23。 5 OFR與鈣超載 1972年Shen和Jennings等24發(fā)現(xiàn)犬心臟冠狀動(dòng)脈短暫閉塞后復(fù)灌可加速細(xì)胞內(nèi)Ca2+的積聚，并首次提出鈣超載學(xué)說(shuō)。大量實(shí)驗(yàn)研究表明，在心肌缺血再灌注過(guò)程中，OFR的過(guò)量產(chǎn)生和細(xì)胞內(nèi)鈣超載是同一病理過(guò)程中的兩種不同現(xiàn)象，且互為因果關(guān)系。首先，細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增多可能是細(xì)胞黏附蛋白介導(dǎo)中性粒細(xì)胞（PMN）釋放的磷脂酶及OFR對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及肌漿網(wǎng)Ca2+泵功能破壞的結(jié)果，因而認(rèn)為Ca2+負(fù)荷過(guò)重是

12、OFR及PMN作用機(jī)制的一部分25。高濃度的細(xì)胞內(nèi)Ca2+很容易激活磷脂酶A和鈣敏感性蛋白酶磷脂酶A，及蛋白激酶C的活化可導(dǎo)致花生四烯酸形成，花生四烯酸不僅通過(guò)其清潔劑樣性能干擾細(xì)胞膜，它還是環(huán)氧化酶的重要底物。花生四烯酸的活化可導(dǎo)致前列腺素和血栓素A 的形成，前者是OFR產(chǎn)生的底物。磷脂酶C催化磷酸肌醇水解能產(chǎn)生三磷酸肌醇(IP)和二?；视?DG)，前者可動(dòng)員細(xì)胞內(nèi)Ca2+，后者能激活蛋白激酶C，間接地通過(guò)Ca2+和Na+/H+交換加劇Ca2+超載26。其次，鈣超載又可激活鈣離子依賴性蛋白酶，后者可催化黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶，而黃嘌呤氧化酶在有氧條件下能促進(jìn)黃嘌呤分解為尿酸的同時(shí)產(chǎn)

13、生大量的OFR。在再灌注時(shí)大量氧進(jìn)入的情況下，黃嘌呤氧化酶作用于次黃嘌呤，產(chǎn)生大量超氧陰離子自由基O-2，后者在Fe3+的催化下與H2O生成過(guò)氧化氫，后經(jīng)HaberWeiss反應(yīng)而生成毒性更強(qiáng)的OH，從而產(chǎn)生更多OFR，能直接作用于肌漿網(wǎng)上的Ca2+泵和Na+/Ca2+交換體，造成兩者功能下降，促進(jìn)Ca2+超載27 。此外OFR也可通過(guò)線粒體損傷導(dǎo)致鈣超載。OFR作用于線粒體膜，造成Ca2+順濃度梯度進(jìn)入線粒體，通過(guò)與線粒體內(nèi)含磷酸根的化合物結(jié)合生成大量不溶性的磷酸鈣沉積于線粒體內(nèi)膜，使得氧化磷酸化障礙，能量生成減少而自由基生成增多。ATP合成障礙，使得心肌膜上ATP依賴的Na+泵和Ca2+泵

14、活性下降，使細(xì)胞內(nèi)Na+升高，Na+ Ca2+交換增強(qiáng)，使胞內(nèi)Ca2+增多，肌漿中更多的Ca2+不能泵出而加劇鈣超載28。OFR和Ca2+超載，兩者相互聯(lián)系，協(xié)同作用，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞不可逆損傷，兩者之間的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。 6 OFR與線粒體 一般認(rèn)為心肌缺血再灌注時(shí)ROS的產(chǎn)生主要有兩個(gè)主要源泉：即黃嘌呤氧化酶和線粒體呼吸鏈。但黃嘌呤脫氫酶的活性在缺血或再灌注時(shí)是非常不穩(wěn)定的，而且也不總是與再灌注損傷聯(lián)系在一起，因此，ROS產(chǎn)生的第二個(gè)源泉，線粒體呼吸鏈可能更為重要的。應(yīng)用電子傳遞鏈復(fù)合物抑制劑，可損害線粒體的電子傳遞鏈酶的活化，進(jìn)而引起大量的OFR生成29。線粒體的呼吸鏈

15、是以電子傳遞的方式進(jìn)行能量代謝，以電子漏的方式進(jìn)行超OFR代謝，線粒體中OFR的水平是呼吸鏈底物飽和氧端電子漏動(dòng)態(tài)平衡的結(jié)果。在病理?xiàng)l件下(如心肌缺血和缺血再灌注、細(xì)胞氧化脅迫等)，線粒體呼吸鏈?zhǔn)钱a(chǎn)生OFR的主要源泉，OFR是線粒體調(diào)節(jié)電子傳遞的副產(chǎn)品。 線粒體是OFR產(chǎn)生的源泉，也是OFR的作用靶點(diǎn)。過(guò)量的OFR可造成細(xì)胞的損傷和細(xì)胞凋亡30。OFR對(duì)線粒體呼吸鏈組分尤其是復(fù)合物和復(fù)合物、ATPase、腺嘌呤核苷酸載體有直接的影響。研究結(jié)果顯示，線粒體呼吸鏈的復(fù)合物和是OFR產(chǎn)生的主要部位，線粒體心肌磷脂含量減少使得線粒體復(fù)合物，復(fù)合物功能降低，是導(dǎo)致OFR大量產(chǎn)生的原因，使用外源心肌磷脂恢

16、復(fù)到正常含量時(shí)可恢復(fù)線粒體復(fù)合物，復(fù)合物功能而減少OFR生成作用12。而Tompkins等31研究利用巰基探針及蛋白質(zhì)組學(xué)工具檢測(cè)到線粒體復(fù)合物巰基亞單位改變的同時(shí)伴有OFR的產(chǎn)生而與復(fù)合物無(wú)關(guān)。氧應(yīng)激損傷可致線粒體脂質(zhì)過(guò)氧化，呼吸鏈細(xì)胞色素明顯丟失，復(fù)合物 活性降低。生物膜上含有多種脂質(zhì)，脂質(zhì)中又含有各種不飽和脂肪酸，脂肪酸可與自由基發(fā)生過(guò)氧化作用，使膜流動(dòng)性降低、膜蛋白變性、膜脆性增加，膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變32，使膜的運(yùn)輸功能紊亂以致喪失。心肌缺血再灌注時(shí)，當(dāng)OFR分子增多時(shí)，線粒體的膜系統(tǒng)可受到損害，從而影響跨越線粒體膜的質(zhì)子梯度，使線粒體合成ATP的功能發(fā)生障礙，同時(shí)，線粒體的功能障礙又可導(dǎo)

17、致自由基產(chǎn)生增多，過(guò)多的OFR不能被及時(shí)清除，又可引起生物膜結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)過(guò)氧化，損害線粒體膜的通透性，引起電子傳遞鏈活性的進(jìn)一步下降，進(jìn)而形成惡性循環(huán)，使OFR生成進(jìn)一步增加，最終造成細(xì)胞及組織的凋亡和壞死33。 7 OFR與心肌缺血預(yù)適應(yīng) 心肌缺血預(yù)適應(yīng)(ischemic preconditioning)是一種內(nèi)源性的保護(hù)機(jī)制，OFR可能參與預(yù)適應(yīng)延遲相的觸發(fā)機(jī)制，給予抗氧化劑可消除OFR對(duì)2448 h后心肌頓抑的保護(hù)作用。有研究證實(shí)血管緊張素預(yù)處理作用是通過(guò)活性氧的產(chǎn)生及信號(hào)調(diào)節(jié)等作用在再灌注損傷時(shí)調(diào)節(jié)機(jī)體氧化還原狀態(tài)而發(fā)揮預(yù)適應(yīng)作用34。預(yù)適應(yīng)機(jī)制也可通過(guò)減輕再灌注過(guò)程中的氧化應(yīng)激對(duì)

18、心肌細(xì)胞起保護(hù)作用35。Gozal等36通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)心肌的缺血預(yù)處理可明顯減少缺血后OFR的產(chǎn)生。 綜上所述，OFR是造成心肌缺血再灌注損傷的直接原因之一。由于OFR在缺血再灌注損傷中的作用非常復(fù)雜，除發(fā)揮自身作用外，還參與、介導(dǎo)多種物質(zhì)在心肌缺血再灌注損傷中的作用。近年來(lái)研究結(jié)果表明OFR在缺血再灌注損傷中不僅有損傷作用,而且也有有益的作用, 如信號(hào)預(yù)處理保護(hù)機(jī)制以及誘導(dǎo)應(yīng)急反應(yīng)等。目前再灌注損傷中不同細(xì)胞來(lái)源的OFR產(chǎn)生機(jī)制仍未完全闡明，此外OFR及細(xì)胞氧化還原狀態(tài)亦參與調(diào)控能量代謝、應(yīng)急反應(yīng)、凋亡、炎性反應(yīng)等復(fù)雜過(guò)程。這也許就是為什么某些單一抗氧化藥物對(duì)臨床病例無(wú)效的原因。因此，今后的抗

19、氧化作用的研究應(yīng)更精確、更深入的研究OFR在再灌注損傷各個(gè)關(guān)鍵時(shí)段及靶點(diǎn)的作用, 確定靶點(diǎn), 在適宜時(shí)間內(nèi)進(jìn)行臨床干預(yù)而不影響其他正常生理功能，這是研究OFR對(duì)心肌缺血再灌注損傷作用的發(fā)展方向?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 金倩;氯地酊聯(lián)合激光治療痤瘡158例療效觀察J;廣東醫(yī)學(xué);1997年10期 2 董新亭,李衛(wèi)莉,馬秀華;自擬粉刺消治療痤瘡126例J;中國(guó)中醫(yī)藥科技;1999年06期 3 查旭山,陳修飏;尋常痤瘡治療體會(huì)J;江西中醫(yī)藥;/xyfm/class/.2002年05期 4 張懷亮 ,譚正輝 ,孫葉梅 ,李梅 ,俞玉芳 ,韓峰;3003例痤瘡患者特征分析

20、與控制對(duì)策J;中華醫(yī)學(xué)美學(xué)美容雜志;/xyfm/class/.2002年06期 5 劉勇,王冬梅;痤瘡的藥物治療J;臨床醫(yī)藥實(shí)踐雜志;2003年09期 6 高宜云;痤瘡從肝論治J;中醫(yī)藥臨床雜志;2004年03期 7 歐其平,林維山;中西醫(yī)結(jié)合治療痤瘡J;中華皮膚科雜志;2004年09期 8 陳五一;痤瘡辨治體會(huì)J;世界中醫(yī)藥;/yisheng/main/index.php.2007年03期 9 雷放;中藥熱敷治療痤瘡有效J;新中醫(yī);/book/main/index.php.1992年09期 10 李東華;異維生素A酸治療痤瘡J;新醫(yī)學(xué);1993年10