SN出口食品中大腸菌群、大腸桿菌檢測方法.

1、中華人民共和國 進(jìn)出口商品 檢驗行業(yè)標(biāo) 準(zhǔn) 出口食品中大 腸菌群、糞 大腸菌群 SN 016992 和大腸桿菌檢驗方法代替 ZB X09 002一 88 Method for examination of coliform, fecal coliform and escherichiacoli in food for export1 主題內(nèi)容與適用范 圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了出口食品中大 腸菌群、糞 大腸菌群和大 腸桿菌的 檢驗方法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于出口食品的 檢驗。2 設(shè)備和材料2.1吸管：1mL,具O.ImL刻度;5mL和10mL，具1mL刻度。2.2 水浴箱:44.5 5C。2.3 培養(yǎng)箱:36 C

2、,44.5 5C。2.4 冰箱:05C 和-15-20C。2.5均質(zhì)器。2.6 乳缽和研棒。2.7平皿:直徑 90mm。2.8天平:感量 0.1g2.9顯微鏡。2.10稀釋瓶:100mL、200mL和500mL三角燒瓶及廣口瓶。2.11玻璃珠:直徑約 5mm。2.12菌落計數(shù)器。3 培養(yǎng)基及 試劑3.1月桂基硫酸鹽胰蛋白（月示（LST肉湯。3.2煌綠乳糖膽鹽（BGLB肉湯。3.3EC肉湯。3.4伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB。3.5營養(yǎng)瓊脂斜面。3.6色氨酸肉 湯。3.7MR-VP 培養(yǎng)基。3.8 Korser氏枸椽酸鹽肉湯。3.9結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA。3.10Butterfield 氏磷酸鹽

3、緩沖稀釋液。3.11生理鹽水。3.12革蘭氏染色液。3.13 Kovacs氏靛基質(zhì)試劑。3.14甲基紅指示劑3.15Voges-proskauer(V-P 試劑。4 樣品制 備4.1以無菌操作取有代表性的 樣品。如有包裝則 用 75%乙醇在開口 處 擦拭后取 樣。若不 能及時檢驗 ,應(yīng)將冷凍樣品置于-15C保存;非冷凍而易腐的食品，應(yīng)置于4C冰箱保存。檢驗前冷凍樣品可于25C 18h內(nèi)解凍，或在45E以下15min內(nèi)解凍。4.2 不同食品 樣品勻液的制 備4.2.1 液體食品以滅菌吸管取樣25mL放入裝有225mL稀釋劑的滅菌玻璃瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量 的玻璃珠 ,以30cm幅度、于7s內(nèi)振搖2

4、5次（或以機械振蕩器振搖，制成1:10的樣品勻液。4.2.2固體和半固體食品以無菌操作取25g樣品，放入裝有225mL稀釋劑的滅菌均質(zhì)杯內(nèi)，于8000r/min均質(zhì)12min,制成1:10樣品勻液（也可用滅菌乳缽研磨的方法代替。4.3稀釋樣品勻液根據(jù) 對樣品污染情況的估計,用稀釋劑將樣品勻液制成一系列十倍 遞增的樣品稀釋液,如10*-2、 10*-3、 10*-4。從制備樣品勻液至稀釋完畢,全過程不得超過15min5 大腸菌群的 測 定5.1 大腸菌群 MPN 值的測定5.1.1 對每個樣品,選擇適宜的三個連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液。每個稀釋 度接種三管月桂基硫酸鹽胰蛋白（月示（LST肉湯，每管接

5、種1mL。5.1.2將接種管置于36C培養(yǎng)48坐h。5.1.3觀察試管的產(chǎn)氣情況:檢查倒管內(nèi)是否有氣泡 產(chǎn)生,記錄在24h和48h內(nèi)產(chǎn)氣的LST肉湯管數(shù)。如所有 LST 肉湯管均未產(chǎn)氣,則可報告為大腸菌群陰性;如有產(chǎn)氣者,則進(jìn) 步作證實試驗。5.2大腸菌群的證實試驗5.2.1將所有產(chǎn)氣管用直徑為3mm的接種環(huán)移種到煌綠乳糖膽鹽（BGLB肉湯管中。5.2.2置 BGLB 肉湯管于 361C 培養(yǎng) 482h。5.2.3記錄所有 BGLB 肉湯管的產(chǎn)氣管數(shù)。5.2.4結(jié)果報告:按BGLB肉湯產(chǎn)氣管數(shù)査MPN表見附錄B（補充件報告每克（毫升樣品中大腸菌群的 MPN 值。6 糞大腸菌群 測定6.1用直徑

6、為3mm的接種環(huán)將所有48i2h內(nèi)產(chǎn)氣的LST肉湯管培養(yǎng)物移種于EC肉湯管中 。6.2將所有接種的EC肉湯管在30min內(nèi)放入帶蓋44.5 5C水浴箱內(nèi)，培養(yǎng)24坐h。水浴箱 的水平面應(yīng)高于肉湯培養(yǎng)基液面。應(yīng) 以已知為44.5C產(chǎn)氣陽性的大腸桿菌和44.5C 不產(chǎn)氣的產(chǎn)氣腸桿菌或其他大 腸菌群細(xì)菌作陽性和陰性 對照。6.3記錄 EC 肉湯管的產(chǎn)氣情況。產(chǎn) 氣管為糞大腸菌群試驗陽性;不產(chǎn)氣管為糞大腸菌群試驗陰性。6.4結(jié)果報告:按產(chǎn)氣管數(shù),查MPN表報告每克（毫升樣品中糞大腸菌群的MPN值。7大腸桿菌測定7.1將6.3條中的EC肉湯管繼續(xù)培養(yǎng)24h,取其產(chǎn)氣管的培養(yǎng)物劃線接種于伊紅美藍(lán)（EMB

7、平板,36 C培養(yǎng)242h07.2檢查平板上有無具黑色中心有光 澤或無光澤的典型菌落。7.3如有典型菌落 ,則從每個平板上至少挑取 2個典型菌落 ;如無典型菌落 ,則從每個平板上至少挑取 2 個可疑菌落0用接種針 接觸菌落中心部位 ,移種到營養(yǎng)瓊脂斜面上,36 C 培養(yǎng) 1824h。7.4將斜面培養(yǎng)物移種到下列培 養(yǎng)基 中 進(jìn)行生化 試驗7.4.1色氨酸肉湯:在36C培養(yǎng)24吃h后加Kovacs氏試劑0.20.3mL,上層出現(xiàn)紅色為靛基 質(zhì)陽性反應(yīng)。7.4.2MR-VP培養(yǎng)基:在36 C培養(yǎng)48吃h。以無菌操作移取培養(yǎng)物 1mL 至 13mm6/10 X0*4/g(mL=6.0 10*5/g(

8、mL附錄 A培養(yǎng)基和 試劑（補充件A1月桂基硫酸鹽胰蛋白（月示（LST肉湯胰蛋白（月示或胰酪 胨（Trypticase20g氯化鈉 5.0g乳糖 5.0g磷酸氫二鉀（K2HPO4 2.75g磷酸二氫鉀（KH2PO4 2.75g月桂基硫酸 鈉 0.1g蒸餾水 1000.0mL將各成分溶解于蒸餾水中。分裝到有倒立發(fā) 酵管的20mM 150mm試管中，每管1 0mL。121C 高壓滅菌 15min。最終 pH6.8 .2。A2煌綠乳糖膽鹽（BGAB肉湯蛋白胨 10.0g乳糖 10.0g牛膽粉（oxgall 或 oxbile 溶液 200.0mL0.1%煌綠水溶液 13.3mL蒸餾水將蛋白胨乳糖溶于約

9、500mL蒸餾水中,加入牛膽粉溶液200mL（將20.0g脫水牛膽粉溶于 200mL蒸餾水中,pH7.07.5用蒸餾水稀釋到975mL,調(diào)pH7.4。再加入0.1%煌綠水溶液13.3mL，用蒸餾水補足到1000mL,用棉花過濾后，分裝到20mM 150mm試管（管 內(nèi)有倒立的小發(fā)酵管中，每管10mL0 121C高壓滅菌15min。最終pH7.2）.1。A3 EC 肉湯胰蛋白（月示或胰酪 （月示 20.0g3號膽鹽或混合膽鹽 1.5g乳糖 5.0g磷酸氫二鉀（K2HPO4 4.0g磷酸二氫鉀（KH2PO4 1.5g氯化鈉 5.0g蒸餾水 1000.0mL將以上成分溶解于蒸 餾水中，分裝16mM

10、150mm試管（管內(nèi)有倒立的小發(fā)酵管, 每管8mLo 121C 高壓滅菌 15min,最終 pH6.9 .1。A4伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB蛋白胨 10.0g乳糖 10.0g磷酸氫二鉀（K2HPO4 2.0g瓊脂 15.0g伊紅丫水溶性0.4g或2%水溶液20mL美藍(lán)0.065g或0.5%水溶液13mL蒸餾水 1000.0mL在1000mL蒸餾水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸鹽和瓊脂，加水補足至原量。分裝于三 角燒瓶中。每瓶100mL或200mL,高壓滅菌15min。最終pH7.1).2。使用前將瓊 脂融化 ,于每100mL瓊脂中加5mL滅菌的20%乳糖水溶液、2mL的2%伊紅丫水溶液和1.3mL0.5 %

11、的美藍(lán)水溶液，搖勻，冷至4550C傾注平皿。A5 營養(yǎng)瓊脂斜面牛肉膏 3.0g蛋白胨 5.0g瓊脂 15.0g蒸餾水 1000.0mL將各成分加于蒸餾水中，煮沸溶解。分裝合適的試管。121C高壓滅菌15min。最 終pH7.3 .1。滅菌后擺成斜面?zhèn)溆?。A6 色氨酸肉 湯胰胨或胰酪胨 10.0g蒸餾水 1000.0mL加熱攪拌溶解胰胨或胰酪胨于蒸餾水中。分裝試管，每管5mL。121C高壓滅菌15 min。最終 pH6.90.2。A7 MR-VP 培養(yǎng)基（月示 胨 7.0g葡萄糖 5.0g磷酸氫二鉀（K2HPO4 5.0g蒸餾水 1000.0mL將各成分溶于蒸餾水中，分裝試管,121C高壓滅菌1

12、5min,最終pH6.9）2A8 Koser氏枸椽酸鹽肉湯磷酸氫銨鈉（NaNH4HPO4 4H2O 1.5g磷酸氫二鉀（K2HPO4 1.0g硫酸鎂（MgSO4 7H2OO.2g枸椽酸鈉（含2H2O 3.0g蒸餾水 1OOO.OmL將各成分溶解于蒸 餾水中,分裝試管,每管 10mL,121C高壓滅菌15min。最終pH6.70.2。A9結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA蛋白胨 7.0g酵母膏 3.0g乳糖 10.0g氯化鈉 5.0g膽鹽或 3號膽鹽 1.5g中性紅 0.03g結(jié)晶紫 0.002g瓊脂 1518g蒸餾水 1000.0mL將上述成分溶于蒸餾水中，靜置幾分鐘，充分?jǐn)嚢枵{(diào)至pH7.4).1

13、。煮沸2min,將培養(yǎng)基冷至4550C傾注平板。臨用時制備，不得超過3h。A10 Butterfield 氏磷酸 鹽緩沖稀釋液貯存液磷酸二氫鉀(KH2PO4 34.0g蒸餾水 500mL將磷酸二氫鉀溶于蒸餾水中,用 1 mol/L 氫氧化鈉約 175mL調(diào)至pH7.2。用蒸餾水加至1000mL貯存于冰箱。稀釋液 取貯存液 1.25mL, 用蒸餾水稀釋至1000mL,分裝于合適容器后,121 T高壓滅菌15min。A11生理鹽水氯化鈉蒸餾水1000.0mL將氯化鈉溶于蒸餾水中,121C高壓滅菌15min。A12革蘭氏染色液結(jié)晶紫染色液：結(jié)晶紫 95乙醇 20.0mL 1草酸 銨水溶液 80.0m

14、L 將結(jié)晶紫完全溶解于乙醇中 ,然后與草酸 銨溶液混合。 革蘭氏碘液：碘 碘化 鉀 蒸餾水 300.0mL將碘與碘化 鉀先行混合 ,加入蒸餾水少許充分振 搖,待完全溶解后 ,再加蒸餾水至 300mL。沙黃復(fù)染液：沙黃95%乙醇10.0mL蒸餾水90.0mL 將沙黃溶解于乙醇中 ,然后用蒸餾水稀釋。 染色法 a.將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染液，染1min,水洗。b. d.滴加革蘭氏碘液，作用 1min,水洗。滴加復(fù)染液，復(fù)染1min,水洗、待干、鏡檢。c.滴加95%乙醇脫色約 1530s,直至染色液被洗掉，不要過分脫色,水洗。結(jié)果：革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。A13 Kovacs

15、氏靛基質(zhì)試劑對二甲氨基苯甲醛戊醇75.0mL鹽酸（濃25.0mL將對二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中，然后慢慢加入濃鹽酸即可。A14甲基紅指示劑 甲基紅0.1g95%乙醇300mL將甲基紅溶解于300mL乙醇中加水稀釋至500mL。 A15 Voges-Proskauer（V-P試劑 甲液a萘酚 無水乙醇100.0mL乙液 氫氧化鉀40.0g 用蒸餾水加至 100.0mL5.0g5.0g0.25g1.0g2.0g1.0g8.5g6附檢樣中最近似值（MPN （MPN表補充件錄B:1g檢樣中最近似值（MPN表（補充件使用三管法，接種量分別為0.1,0.01和0.001g。111 陽性管數(shù)0.1 0.01

16、0.00100000000000000001 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 00001 1 1 122223333000011112222333301230123012301230123012301 2301 23 | MPN | 丨 V3 | 3693| 陽 性 管數(shù) |9.1 | 14| 2026| 15| 20| 27| 34| 2128| 35| 42| 29| 36| 44| 53|23 |39| 64| 95| 43| 75| 120|160 | 93 | 150| 210 | 290 | 240| 460|MPN | 0.11100 | 1100 |0.01 0.001 | 2222222222222222333333333333333300 001111222233330000111122223333012301230123012301 230123012301236.1 | 9.2 |12| 6.2| 9.3| 1216131619|1 1| 9.4|1| 7.21 113.611151115191115202416202429|1 1|1|注 :7.3| 本表采用3個稀釋度0.1g(mL、0.01g(mL和0.001g(mL,每個稀釋度接種3管。 表內(nèi)所列檢樣量如改用1g(mL、0.1g(mL和0.01g(m