現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)學(xué)：醫(yī)學(xué)機(jī)能實(shí)驗(yàn)學(xué)常用儀器介紹 (2)

1、醫(yī)學(xué)機(jī)能實(shí)驗(yàn)學(xué)常用儀器介紹,目錄二,蛋白印跡（Western blot）,其他相關(guān)技術(shù)和儀器的介紹,蛋白印跡（Western blot）,Western Blot中文一般稱為蛋白質(zhì)印跡,Western blot 定義,通過聚丙烯酰胺電泳根據(jù)分子量大小分離蛋白后轉(zhuǎn)移到雜交膜上,分離的蛋白可以通過一抗/二抗復(fù)合物進(jìn)行檢測,是蛋白質(zhì)分析的最流行的技術(shù)之一,它采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。,經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。 以固相載

2、體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)。 再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。,Western blot 原理,蛋白樣品的制備 （蛋白抽提、定量） SDS-聚丙烯酰胺 凝膠電泳 （SDS-PAGE凝膠制備、上樣）,Western Blot操作流程,轉(zhuǎn)膜 封閉 一抗雜交 二抗雜交 底物顯色,水溶液提取法 針對水、稀鹽、稀酸或堿溶液中的蛋白質(zhì)。稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液 對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑 。 細(xì)胞裂解液： 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L Nacl ,5 mmol/L

3、 EDTA, 1%NP40 ， 0.05% PMSF ， 2g/mL Aprotinin, 0.5g/mL Leupeptin ， pH8.0 ，也可向公司購買。 有機(jī)溶劑提取法 對于分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)可用有機(jī)溶劑提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。,一、蛋白樣品的制備,二、蛋白樣品的定量(Bradford法 ),原理考馬斯亮藍(lán)G-250有紅、藍(lán)兩種不同顏色的形式，在一定濃度的乙醇和酸性條件下，可配成淡紅色的溶液，與蛋白結(jié)合后形成藍(lán)色化合物，該化合物在595nm處有最大吸收值，化合物顏色深淺與蛋白的濃度高低成正比 。 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 （插入表格） 檢測樣品蛋白含量：取一管考馬斯亮藍(lán)+95 l

4、 0.15mol/L NaCl NaCl溶液+5l待測蛋白樣品，混勻后靜置2min，倒入比色杯中測試。,20-30 ug 細(xì)胞/組織裂解物 100 ng 純化蛋白 根據(jù)蛋白表達(dá)豐度調(diào)整適當(dāng)?shù)牡鞍咨蠘恿?上樣量一致：每孔上樣量保持一致 上樣前用loading buffer加熱變性樣本,三、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,SDS是一種陰離子表面活性劑， 能打斷蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵，并按一定的比例和蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其本身原有的電荷，掩蓋了各種蛋白分子間天然的電荷差異。,聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)部有大小不一的孔徑，使得小分子快速通過，大分子受小孔徑阻擋跑的慢，從而形成跟分子量有

5、關(guān)的梯度條帶,忽略不同蛋白所帶電荷對于移動(dòng)速度的影響，使其移動(dòng)速度只與分子量相關(guān),Anode - 內(nèi)槽緩沖液帶有負(fù)電荷，與凝膠頂部接觸,外槽中緩沖液帶有正電荷，與凝膠底部接觸,Cathode + 帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì)從上到下運(yùn)動(dòng)（負(fù)極到正極）,電泳進(jìn)程可以根據(jù)前沿指示劑marker來確定，等其跑到底部上面1cm左右即可停止電泳,小分子量蛋白跑的比較快. 蛋白根據(jù)分子量大小分開,標(biāo)本加入到上樣孔中,四、Western Blot 轉(zhuǎn)膜,分離的蛋白通過電轉(zhuǎn)膜方式從凝膠中轉(zhuǎn)移到雜交膜上（PVDF或NC膜）：在之前需要“切膠”,PVDF膜：可重復(fù)使用，特別適合蛋白印跡，結(jié)合能力較強(qiáng)，但價(jià)格比較昂貴。 NC

6、膜（硝酸纖維素膜）：價(jià)格比較便宜，應(yīng)用較廣，結(jié)合牢固性差一些，韌性也不如PVDF，不能重復(fù)使用，但蛋白吸附容量高，親水性較好。,脫脂奶粉（含5脫脂奶粉的TBST緩沖液 ） BSA(牛血清白蛋白） Western Blot 膜封閉液（生物試劑公司提供）,五、封閉,六、一抗、二抗孵育,把NC膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，加入一抗溶液與濾膜溫育，4過夜。 倒掉一抗溶液，用PBS漂洗濾膜3次，每次10min。 加入配制的二抗，搖床上緩慢搖動(dòng)， 室溫一小時(shí)或4過夜。 倒掉二抗溶液，用PBS漂洗濾膜3次，每次10min。,七、二抗與底物反應(yīng)顯色,ECL化學(xué)發(fā)光顯色液 比較常用，結(jié)果容易控制，但是被催化是

7、靈敏度差一點(diǎn) DAB顯色液 比較靈敏，是HRP最敏感的底物,Western Blot 需要的主要試劑,常用的有PVDF膜，硝酸纖維素膜或者尼龍膜,WB需要試劑膜,BSA或者脫脂奶粉(光明脫脂奶粉) 商業(yè)化的封閉試劑,WB需要試劑封閉試劑,主要目的是確定靶蛋白的分子量大?。皇褂妙A(yù)染的Marker還可以實(shí)時(shí)檢測電泳分離情況，并可以轉(zhuǎn)移到膜上。,WB需要試劑蛋白質(zhì)Marker,選擇適合檢測標(biāo)本種屬的一抗（說明書有驗(yàn)證） 選擇適用于WB實(shí)驗(yàn)方法的一抗（說明書有驗(yàn)證） 選擇單克隆抗體或者經(jīng)過親和純化的多克隆抗體 根據(jù)說明書推薦的濃度優(yōu)化最佳稀釋比例,WB需要試劑一抗,Santa cruz, Cell s

8、ignaling, Invitrogen, Sigma, Abcam, R&D, Abnova, Chemicon, Calbiochem, Millipore, BD, Cayman, Roche, eBioscience, et al.,選擇合適的一抗：,二抗選擇：根據(jù)一抗來源種屬以及抗體Ig亞型選擇合適的二抗。 二抗的使用： 根據(jù)說明書推薦濃度使用TBST稀釋二抗。 如果說明書沒有推薦濃度，可進(jìn)行多個(gè)稀釋比例進(jìn)行摸索最佳稀釋度（1:1000-1:20000）。 孵育條件一般為室溫1-2小時(shí)。,雜交需要試劑二抗,Santa cruz, Cell signaling, Invitrogen,

9、 Sigma, Abcam, R&D, Abnova, Chemicon, Calbiochem, Millipore, BD, Cayman, Roche, eBioscience, et al.,顯色底物：操作簡單，靈敏度低，如TMB、DAB、BCIP/NBT 化學(xué)發(fā)光底物：靈敏度高，需要曝光檢測設(shè)備（暗室、曝光設(shè)備和膠片）或者凝膠成像設(shè)備。,雜交需要試劑底物,沒有信號 高背景 非特異性條帶 條帶大小不對,WB常見問題,標(biāo)本問題 標(biāo)本中不含檢測蛋白：設(shè)置陽性對照 上樣量不夠，或者蛋白表達(dá)豐度比較低：增加上樣量 轉(zhuǎn)膜問題 轉(zhuǎn)膜不完全：轉(zhuǎn)膜后使用麗春紅染色，確定目的大小蛋白條帶是否存在于膜上，

10、使用蛋白質(zhì)Marker. 洗滌過度：減少洗滌時(shí)間和次數(shù). 封閉 封閉過度：減少封閉試劑濃度，封閉時(shí)間，更換封閉試劑 抗體孵育和檢測 抗體濃度和時(shí)間孵育不夠：增加抗體濃度，延長孵育時(shí)間 一抗不工作：設(shè)置陽性對照 二抗不工作：和其他一抗配合檢測二抗是否工作 一抗/二抗不匹配：檢查抗體的來源和亞型。正確選擇二抗 底物失活：重新配制有效的底物,沒有信號/弱信號,背景高,封閉 封閉時(shí)間不夠：延長封閉時(shí)間 優(yōu)化封閉試劑的類型和濃度 封閉試劑和抗體有交叉反應(yīng)：更換封閉試劑. 磷酸化抗體不能使用含有酪蛋白的封閉試劑：推薦BSA封閉 抗體孵育和檢測 一抗/二抗?jié)舛忍撸航档涂贵w濃度 孵育溫度太高：建議4度孵育過

11、夜 其他 洗膜不充分：5*3mins，多次短時(shí)間的洗膜 曝光時(shí)間過長：縮短曝光時(shí)間 出現(xiàn)干膜現(xiàn)象：保證膜充分浸透，避免出現(xiàn)干膜 二抗非特異性：設(shè)置只加二抗對照,非特異性條帶,標(biāo)本制備 二聚體或者多聚體：增加上樣前煮沸變性時(shí)間 蛋白不同剪切體或者 isoforms 存在. 蛋白降解：使用新鮮制備的標(biāo)本，標(biāo)本中加入新鮮配制的蛋白酶抑制劑 上樣量過大：減少上樣量 封閉Blocking 封閉不充分：優(yōu)化封閉時(shí)間和封閉試劑濃度 抗體孵育和檢測 一抗/二抗?jié)舛冗^高：降低抗體濃度 抗體沒有經(jīng)過純化 二抗非特異性結(jié)合：使用二抗對照 其他 洗膜保證充分,條帶大小不對,標(biāo)本制備 二聚體/多聚體存在：使用還原變性電

12、泳，除非說明書上有特殊說明 多個(gè)亞型存在？（Isoforms） 蛋白降解？ 蛋白修飾,舉例： 扇貝多肽（PCF）對UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞FADD蛋白表達(dá)的影響。FADD蛋白表達(dá)水平以FADD與-肌動(dòng)蛋白（內(nèi)參）吸光度比值表示。,Western blotting 結(jié)果如圖所示，F(xiàn)ADD對照組有低表達(dá)，模型組表達(dá)量明顯增加，與模型組相比，各劑量PCF組FADD表達(dá)量均降低（P0.01），且隨PCF劑量增加對FADD表達(dá)量抑制作用逐漸增強(qiáng)，呈劑量相關(guān)性。,高效液相色譜儀,高效液相色譜分離是利用試樣中各組分在色譜柱中的淋洗液和固定相間的分配系數(shù)不同，當(dāng)試樣隨著流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱中后，組分就在其中的兩

13、相間進(jìn)行反復(fù)多次（103-106）的分配（吸附脫附放出），由于固定相對各種組分的吸附能力不同（即保存作用不同），因此各組份在色譜柱中的運(yùn)行速度就不同，經(jīng)過一定的柱長后，便彼此分離，順序離開色譜柱進(jìn)入檢測器，產(chǎn)生的離子流信號經(jīng)放大后，在記錄器上描繪出各組分的色譜峰。,高效液相色譜儀在醫(yī)藥方面的應(yīng)用 分離分析藥物的組分含量 藥物生產(chǎn)中進(jìn)行中間控制 分析藥物在體內(nèi)的殘量 測定藥物在各種器官中的代謝產(chǎn)物，特別是研究藥物的代謝 產(chǎn)物在血清中存在的情況。,HPLC特點(diǎn) 采用高壓輸液泵，高效微粒固定相和高靈敏度檢測器。高壓、高速、高效、高靈敏度、樣品回收方便。,高壓：液相色譜法以液體為流動(dòng)相（稱為載液），液

14、體流經(jīng)色譜柱，受到阻力較大，為了迅速地通過色譜柱，必須對載液施加高壓。一般可達(dá)150350105Pa。 高速：流動(dòng)相在柱內(nèi)的流速較經(jīng)典色譜快得多，一般可達(dá)110ml/min。高效液相色譜法所需的分析時(shí)間較之經(jīng)典液相色譜法少得多，一般少于1h。 高效：近來研究出許多新型固定相，使分離效率大大提高。 高靈敏度：高效液相色譜已廣泛采用高靈敏度的檢測器，進(jìn)一步提高了分析的靈敏度。如熒光檢測器靈敏度可達(dá)10-11g。另外，用樣量小，一般幾個(gè)微升,HPLC的圖形結(jié)果,固定相 將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面 化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的有機(jī)鍵合層 如C18（十八烷基硅烷）、 C8（辛烷基）、氨基鍵合硅膠 固定相

15、類型 極性固定相：正相色譜 以極性有機(jī)基團(tuán)如胺基（-NH2）、腈基（-CN）、醚基（-O-）等鍵合在硅膠表面制成的 非極性固定相：反相色譜 反相色譜法最常用的固定相是C18、C8和苯基鍵合相的填料，在分離極性很大的化合物時(shí)，也可以采用氨基、氰基等極性基團(tuán)鍵合固定相。,色譜固定相的基本要求,2021/4/7,分離分析流動(dòng)相,38,色譜流動(dòng)相的基本要求,保持色譜柱的穩(wěn)定性，因而： 與固定相不互溶 （延長柱壽命） 不發(fā)生不可逆吸附 有合適的pH值 化學(xué)惰性不與樣品及固定相發(fā)生反應(yīng)。,2021/4/7,分離分析流動(dòng)相,39,色譜流動(dòng)相的基本要求,適用于所選的檢測器 UV： 在紫外線區(qū)“透明” 示差：折

16、射率與溶劑有較大差異 電化學(xué)檢測器：電惰性。 對樣品有很強(qiáng)的溶解力。 清洗與更換方便：可減少更換溶劑時(shí)的間隔時(shí)間。 低價(jià)、毒性小、純度高。,2021/4/7,分離分析流動(dòng)相,40,流動(dòng)相的選擇,有合適的理化性質(zhì)（沸點(diǎn)、粘度等，盡可能小一些） 合適的強(qiáng)度（分配系數(shù)要合適，簡單樣品可大，復(fù)雜樣品要?。?混合溶劑（有等度和梯度之分） 極性合適（需根據(jù)溶劑的性質(zhì)而定）,2021/4/7,分離分析流動(dòng)相,41,流動(dòng)相的選擇性分組,檢測器的作用是將柱流出物中樣品組成和含量的變化轉(zhuǎn)化為可供檢測的信號，常用檢測器有紫外吸收、熒光、示差折光、化學(xué)發(fā)光等。,HPLC的檢測器,紫外可見吸收檢測器（UVD）是HPLC

17、中應(yīng)用最廣泛的檢測器之一，幾乎所有的液相色譜儀都配有這種檢測器。,熒光檢測器是一種高靈敏度、有選擇性的檢測器，可檢測能產(chǎn)生熒光的化合物。某些不發(fā)熒光的物質(zhì)可通過化學(xué)衍生化生成熒光衍生物，再進(jìn)行熒光檢測。,舉例 應(yīng)用高效液相色譜方法檢測人血漿和尿液中左卡尼汀(L-carnitine，LC)及其?；镆阴Ｗ罂嵬?Acetyl-L-cainitine，ALC)、丙酰左卡尼汀(Propionyl-L-cainitine，PLC)含量,色譜條件,雙通道紫外檢測器 色譜柱: Hypersil SiO2 (4.6mm250mm，5m) 流動(dòng)相:乙腈:6.4molL-1檸檬酸緩沖液(10:90) 流 速:

18、1.2mlmin-1 檢測波長：260nm 進(jìn)樣量：20l,HPLC-UV法,空白血漿,健康人血漿 5%腹膜透析液,HL130HS血液透析器,4,空白血漿,血漿、尿液樣本處理,血漿尿液樣本+乙腈:甲(9:1),TBA,1.5mlmin-1 24h,上清+PBPB,待測紫外 衍生物,HPLC-UV法,NaH2PO4Ag2O(9:1),KH2PO4,提取兩次,70 1.5h,空白尿液,酸化蒸餾水（每100毫升蒸餾水中含1毫升冰醋酸）,空白血漿,標(biāo)準(zhǔn)血漿,空白尿液,標(biāo)準(zhǔn)尿液,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,HPLC-UV法,LC血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線 Y=0.2861X+0.01190 2.5500molL-1 r=0.9980,

19、LC尿液標(biāo)準(zhǔn)曲線 Y=0.0786X+0.02620 21000molL-1 r=0.9969,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,HPLC-UV法,均滿足血漿和尿藥濃度測定的方法學(xué)要求,小 結(jié),實(shí)驗(yàn)條件滿足對血漿和尿液中LC含量測定。,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，并具有較高的檢測靈敏度和方法學(xué)回收率。,HPLC-UV法,可用于臨床樣本的測定。,不能同時(shí)檢測血漿和尿液中的LC、ALC、PLC。,色譜條件,熒光檢測器 色譜柱: Hypersil C18 (4.6mm250mm，5m) 流動(dòng)相:乙腈-0.1molL-1乙酸銨(34:66) 流 速: 1mlmin-1 檢測波長：Ex 248nm，Em 418nm 進(jìn)樣

20、量：50l,HPLC-FL法,空白血漿,血漿、尿液樣本處理,HPLC-FL法,空白尿液,血漿尿液樣本:乙腈(1:5),EDC,上清液+1-AA,熒光衍生物,氯仿,乙醚,待測熒光衍生物,LC標(biāo)準(zhǔn),ALC標(biāo)準(zhǔn),PLC標(biāo)準(zhǔn),混合標(biāo)準(zhǔn),6.3min,9.4min,13.4min,空白血漿,標(biāo)準(zhǔn)血漿,空白尿液,標(biāo)準(zhǔn)尿液,LC血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=26.31062X+22.53629 r=0.9982 2.5500molL-1,ALC血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=19.26067X+6.716380 r=0.9980 0.2550molL-1,PLC血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=6.08251X+1.59046 r=0.9927 0.12

21、0molL-1,LC尿液標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=27.54841X+30.6576 r=0.9976 21000molL-1,ALC尿液標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=18.85477X+4.70837 r=0.9985 1500molL-1,PLC尿液標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=6.00967X+1.44269 r=0.9915 0.2100molL-1,HPLC-FL法,均滿足血漿和尿藥濃度測定的方法學(xué)要求,小 結(jié),在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，并具有較高的檢測靈敏度和方法學(xué)回收率。,HPLC-FL法,實(shí)驗(yàn)條件滿足同時(shí)對血漿和尿液中LC，ALC和PLC含量測定。,可用于血漿和尿液中LC、ALC和PLC的含量測定,其他相關(guān)技術(shù)和 儀器

22、的介紹,酶標(biāo)儀,1 原理 酶標(biāo)儀（Microplate Reader）是對酶聯(lián)免疫檢測（ EIA）實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行讀取和分析的專業(yè)儀器。酶聯(lián)免疫反應(yīng)通過偶聯(lián)在抗原或抗體上的酶催化顯色底物進(jìn)行的，反應(yīng)結(jié)果以顏色顯示，通過顯色的深淺即吸光度值的大小就可以判斷標(biāo)本中待測抗體或抗原的濃度。,2 酶標(biāo)儀的應(yīng)用 酶標(biāo)儀主要應(yīng)用于酶聯(lián)免疫吸附檢測反應(yīng)中檢測吸光度值。 MTT法檢測細(xì)胞活性 原理 MTT，化學(xué)名3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名是噻唑鹽。活細(xì)胞，特別是增殖的細(xì)胞中能量代謝旺盛，其中線粒體能量代謝過程中產(chǎn)生的琥珀酸脫氫酶可將淡黃色的MTT還原為藍(lán)色的結(jié)晶formazan

23、沉積在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞周圍，形成的結(jié)晶與增殖的細(xì)胞數(shù)成正比。二甲基亞砜（DMSO）可溶解formazan，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映細(xì)胞數(shù)量。,步驟： 將細(xì)胞以5103/ml密度接種于96孔板，培養(yǎng)至指數(shù)生長期， 然后分別在每孔加入15 l MTT(5mg/ml)，在37 5CO2飽和水汽CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加150 l二甲亞砜，常溫下振蕩10 min，酶標(biāo)儀測波長490 nm時(shí)的吸光度OD值。每個(gè)孔的細(xì)胞的存活率以正常對照細(xì)胞為100%，計(jì)算不同處理組細(xì)胞存活率。,UVAmodel：紫外線損傷模型 PCF：扇貝多肽,RNA干擾 1 原理： 近年

24、來的研究表明，將與mRNA對應(yīng)的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞，可以使mRNA發(fā)生特異性的降解，導(dǎo)致其相應(yīng)的基因沉默。這種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被稱為RNA干擾（RNAi）。 2 小的干涉RNA（siRNA）： 是在RNA干涉過程中人工體外合成的小片段RNA，由約20個(gè)堿基對組成，包括5個(gè)磷酸鹽，2個(gè)核苷和3個(gè)懸臂。 3 應(yīng)用： 研究信號傳導(dǎo)通路和基因功能 RNAi能夠在哺乳動(dòng)物中降低特異性基因的表達(dá)，制作多種表型，而且抑制基因表達(dá)的時(shí)間，控制基因表達(dá)的部位。 開展基因治療的新途徑

25、一基因家族的多個(gè)基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性， 設(shè)計(jì)針對這一區(qū)段序列的dsRNA分子，只注射一種dsRNA即可以產(chǎn)生多個(gè)基因表達(dá)同時(shí)降低的表現(xiàn)，也可同時(shí)注射多種dsRNA而將多個(gè)序列不相關(guān)的基因同時(shí)剔除。為治療多基因調(diào)控的腫瘤疾病，帶來新的治療策略。,Fas干擾實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),空白對照組、UVB模型組、UVB試劑對照組 (不加siRNA,僅加入轉(zhuǎn)染試劑)、UVBsiRNA 組,接種細(xì)胞至6 孔板,讓其在有血清無抗生素的培養(yǎng)基中生長， 使得轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度達(dá)60%80%,轉(zhuǎn)染,siRNA 組每孔加入800L轉(zhuǎn)染復(fù)合物 8L siRNA溶于100L轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基 8L siRNA轉(zhuǎn)染試劑溶于10

26、0L轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基,37 、5% CO2孵育57h,去除轉(zhuǎn)染復(fù)合物， 更換含10%小牛血清的正常培養(yǎng)基,37 、5% CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1824h,轉(zhuǎn)染48h后進(jìn)行UVB照射30min,干擾效率的檢測,RT-PCR 檢測干擾后Fas mRNA的表達(dá)水平,Western blot檢測干擾后Fas蛋白的表達(dá)水平,ESR技術(shù) 1 原理 電子自旋共振(electron spin resonance ESR) 又稱電子順磁共振(electron paramagnetic resonance EPR),。ESR是研究自由基的最直接和最有效的方法和技術(shù)，但是這些自由基必須是相對穩(wěn)定的，而且要達(dá)到一定濃度才

27、能用ESR技術(shù)檢測和研究。 2 舉例：ESR檢測ROS和NO的動(dòng)態(tài)釋放,UVA,UVA+PCF,UVAmodel：紫外線損傷模型 PCF：扇貝多肽,UVB,UVB+PCF,透射電鏡 1 原理 透射電鏡是以電子束透過樣品經(jīng)過聚焦與放大后所產(chǎn)生的物像， 投射到熒光屏上或照相底片上進(jìn)行觀察。透射電鏡的分辨率為0.10.2nm，放大倍數(shù)為幾萬幾十萬倍。由于電子易散射或被物體吸收，故穿透力低，必須制備更薄的超薄切片（通常為50100nm）。 2 舉例：透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu),Control,UVB model,UVB+0.5%PCF,UVAmodel：紫外線損傷模型 PCF：扇貝多肽,原位雜交技術(shù) 1

28、 原理 原位雜交的本質(zhì)就是在一定的溫度和離子濃度下，使具有特異序列的單鏈探針通過堿基互補(bǔ)規(guī)則與組織細(xì)胞內(nèi)待測的核酸復(fù)性結(jié)合而使得組織細(xì)胞中的特異性核酸得到定位，并通過探針上所標(biāo)記的檢測系統(tǒng)將其在核酸的原有位置上顯示出來。 2 舉例：原位雜交檢測p21mRNA 將用DEPC處理后的無菌蓋玻片（細(xì)胞飛片）置入6孔培養(yǎng)板中，接種細(xì)胞于孔內(nèi)，37 、5 % CO2培養(yǎng)至細(xì)胞80融合，處理同1.2細(xì)胞培養(yǎng)。將細(xì)胞飛片用中性樹膠粘于載玻片上，4多聚甲醛固定20 min，PBS洗5 min2次，系列酒精脫水。蛋白酶K消化細(xì)胞，經(jīng)PBS清洗，多聚甲醛固定及酒精系列脫水后于37用不含探針的雜交液預(yù)雜交45 mi

29、n。加入含探針90 gL-1的雜交液，置于密閉濕盒中，60過夜。雜交結(jié)束后，NBT顯色，中性樹膠封片。,UVAmodel：紫外線損傷模型 PCF：扇貝多肽,激光掃描共聚焦顯微(confocal laser Scanning microscopy，CLSM）,1 基本原理 激光共聚焦顯微鏡是近年來發(fā)展起來的一種結(jié)合激光掃描、計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析與顯微鏡技術(shù)的新技術(shù)，新儀器。它采用計(jì)算機(jī)自動(dòng)定量分析被激光掃 描的物體所激發(fā)出的熒光數(shù)量的變化，具有圖像清晰、特異性高、敏感性強(qiáng)、可精確定量等優(yōu)點(diǎn)。 2 優(yōu)點(diǎn) 激光共聚焦顯微鏡做間接免疫熒光組化染色并做定量分析，利用激光聚焦熒光標(biāo)記和系統(tǒng)軟件分析對組織進(jìn)行深層與斷層掃描，不破壞組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，可準(zhǔn)確深層次定位和精確定量，是轉(zhuǎn)化了的精