椎間盤(pán)退變中影響Sox9基因的相關(guān)因素

1、DOC格式論文，方便您的復(fù)制修改刪減椎間盤(pán)退變中影響Sox9基因的相關(guān)因素(作者：?jiǎn)挝唬亨]編：)【關(guān)鍵詞】 椎間盤(pán)退變Sox9基因隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和對(duì)椎間盤(pán)退變的生物學(xué)機(jī)制的深入研究， 人們已經(jīng)越來(lái)越不滿(mǎn)足于傳統(tǒng)的椎間盤(pán)退變治療方法，如臥床休息、 理療、藥物治療和手術(shù)治療等。這些傳統(tǒng)方法僅能短期緩解椎間盤(pán)退 變給患者帶來(lái)的痛苦，并不能從根本上終止退變進(jìn)程。近些年來(lái)，對(duì) 椎間盤(pán)退變的基因治療成為目前的熱點(diǎn)之一，其中，Sox9基因因其在軟骨細(xì)胞發(fā)育成熟中的作用，更是成為各國(guó)學(xué)者研究的重點(diǎn)1。很 多研究發(fā)現(xiàn)，Sox家族的Sox9基因很可能與椎間盤(pán)退變有著密切的 關(guān)系。通過(guò)對(duì)Sox9基因的表達(dá)進(jìn)行

2、干預(yù)，如利用生長(zhǎng)因子、炎性介 質(zhì)等，將會(huì)有效地影響椎間盤(pán)退變的發(fā)生。 本文針對(duì)當(dāng)前研究較多的 兩種細(xì)胞因子BMP-2和IL-1，對(duì)其在椎間盤(pán)退變中，對(duì) Sox9基因 的表達(dá)的調(diào)節(jié)作用及可能的調(diào)控機(jī)制作一詳細(xì)說(shuō)明。1生長(zhǎng)因子(BMP-2)對(duì)Sox9基因的調(diào)控作用1.1生長(zhǎng)因子對(duì)Sox9基因的調(diào)控作用 細(xì)胞因子是具有促進(jìn)有 絲分裂、細(xì)胞分化和基質(zhì)合成，抑制細(xì)胞凋亡等作用的一類(lèi)物質(zhì)，在 椎間盤(pán)中也有細(xì)胞因子的存在，它們可調(diào)節(jié)和恢復(fù)椎間盤(pán)退變中細(xì)胞 外的基質(zhì)代謝。其中生長(zhǎng)因子是治療椎間盤(pán)退變潛力最大的一類(lèi)蛋白 質(zhì)，女口 TGF- B、IGF-1、EGF、FGF、BMP等2。近期研究結(jié)果發(fā) 現(xiàn)3 ,So

3、x9基因的生物學(xué)作用可以被某些細(xì)胞因子有效地進(jìn)行調(diào)控。 有學(xué)者4將重組 的人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bo nemorphoee netic protein-2,BMP-2)導(dǎo)入成年兔退變的椎間盤(pán)細(xì)胞中，結(jié)果顯示，它可 以嚴(yán)格的按劑量依賴(lài)方式正相調(diào)控 Sox9基因mRNA的表達(dá)，從而 引起Col2al表達(dá)的增加，相應(yīng)地增加皿型膠原及蛋白聚糖的合成。還有學(xué)者5將椎間盤(pán)細(xì)胞于體外進(jìn)行傳代培養(yǎng)后加入 rhBMP-2,結(jié)果 顯示，BMP-2對(duì)椎間盤(pán)細(xì)胞中軟骨特異性基因 Sox9蛋白表達(dá)水平和 基因轉(zhuǎn)錄水平的正向調(diào)控作用是平行一致的，且具有濃度依賴(lài)性。另有報(bào)道68稱(chēng)TGF-別也可以對(duì)Sox9基因的表達(dá)進(jìn)行有效

4、地正相 調(diào)控。1.2 BMP-2對(duì)Sox9基因的調(diào)控機(jī)制 當(dāng)前的研究表明，BMPS 作為T(mén)GF B超家族成員中的一員，其發(fā)揮生物學(xué)作用是通過(guò)TGF B-Smad信號(hào)通路。Smads為與線(xiàn)蟲(chóng)Sma和果蠅Mad蛋白同源的蛋 白家族，他們可以將TGFB信號(hào)直接由細(xì)胞膜受體傳導(dǎo)入細(xì)胞核內(nèi)， 是受體激酶介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的新途徑，為細(xì)胞信號(hào)跨膜后與核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄之間開(kāi)通了一條簡(jiǎn)便路徑9、10。Smads分子中都有兩 個(gè)保守的Mad同源域，N端的MH1結(jié)構(gòu)域可與DNA的CAGAC序 列結(jié)合，C端的MH2結(jié)構(gòu)域可與轉(zhuǎn)錄輔激活蛋白或輔阻遏物相互作用，是Smad的功能區(qū);兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的短連接區(qū)有多個(gè)磷酸化位

5、點(diǎn)可被ERK磷酸化而失活，是 Smad的負(fù)調(diào)控區(qū)Smads至少有8 個(gè)成員即Smad 1-8，根據(jù)其功能不同分為3類(lèi)，第1類(lèi)是膜受體激 活的 Smad(R-Smads)，包括 Smad 1、2、3、5、8，其 C 端功能域 末端含有保守的磷酸化位點(diǎn) SSXS基序(motif)，可與TGF B受體直接 作用并被磷酸化之后與 Smad4結(jié)合為二聚體轉(zhuǎn)位入核。R-Smads 與信號(hào)通路的特異性有關(guān)：Smad2和Smad3介導(dǎo)TGF B和活動(dòng)素的 信號(hào)，Smadsl、5、8則介導(dǎo)BMP的信號(hào)。第2類(lèi)為通用 Smad(co-Smad)，目前只有Smad4，與其他Smads的同源性較低， C端功能域沒(méi)有磷

6、酸化位點(diǎn)，不與受體相互作用，但可與Smads家族其他成員相互作用形成穩(wěn)定的異源多聚體調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄。第3類(lèi)有Smad6、7,為T(mén)GF伊Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制因子，可與 R-Smads競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合受體阻止 R-Smads的磷酸化，從而阻斷TGF B的效應(yīng)oTGF伕Smad信號(hào)通路中各型Smads分子之間的作用精密 協(xié)調(diào)，共同完成生理及病理狀態(tài)下 TGF B的生物學(xué)效應(yīng)。TGF伕Smad 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受多種因子的調(diào)節(jié)， R-Smad與Smad4形成的寡聚體 進(jìn)入細(xì)胞后可直接與 DNA結(jié)合調(diào)控基因表達(dá)，但這種 DNA結(jié)合活 性很低，更重要的是與胞核內(nèi)的輔激活蛋白或輔阻遏物分子結(jié)合調(diào)節(jié) 靶基因轉(zhuǎn)錄

7、，主要的輔激活蛋白有 CBP，p300，c-Jun，lef-1;輔阻 遏物有SINPl，Sno-N，Ski等，目前，許多細(xì)節(jié)仍尚未清楚。既然 已知BMPS發(fā)揮生物學(xué)作用是通過(guò) TGF憐Smad信號(hào)通路，作用不 妨大膽的設(shè)想，BMP-2對(duì)椎間盤(pán)細(xì)胞中軟骨特異性基因 Sox9的正向 調(diào)控也正是通過(guò)此一調(diào)控機(jī)制發(fā)揮作用。2致炎因子(IL-1)對(duì)Sox9基因的調(diào)控作用2. 1炎性介質(zhì)在軟骨損傷和修復(fù)中的作用已知退變性椎間盤(pán)自發(fā)地產(chǎn)生一氧化氮(NO)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、前列腺素E2(PGE2) 和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，而且它們的濃度較正常椎間盤(pán)高11。 這些炎性介質(zhì)在椎間盤(pán)內(nèi)的作用還不十

8、分清楚，但是它們對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的作用卻有一些研究。NO、IL-6和PGE2是抑制蛋白多糖合成的因 子，并且它們的作用受白細(xì)胞介素-1(IL-1)調(diào)控而得到加強(qiáng)。蛋白多 糖在受到IL-l的直接作用下也容易發(fā)生裂解，這一過(guò)程被認(rèn)為受 MMPs的調(diào)控12。外源性IL-1在正常和退變椎間盤(pán)內(nèi)刺激炎性介質(zhì) 的作用已有研究。在IL-1的作用下正常椎間盤(pán)產(chǎn)生的 NO、IL-6、MMPs 和PGE2濃度要高于退變椎間盤(pán)，退變椎間盤(pán)也能增加 NO，IL-6和 PGE2，但是不能增加MMPs的合成。有研究表明13，當(dāng)關(guān)節(jié)軟骨 受到創(chuàng)傷或者炎癥侵襲發(fā)生損傷后，浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞會(huì)表達(dá)大量的致 炎因子IL-1家族，IL-1能

9、夠刺激蛋白酶的表達(dá)，包括基質(zhì)降解酶， 膠原酶以及組織纖溶酶原激活劑等。IL-1的存在會(huì)抑制軟骨細(xì)胞中H 型膠原mRNA的表達(dá)以及H型膠原和蛋白聚糖的合成，使細(xì)胞外基質(zhì) 降解和變性，破壞軟骨細(xì)胞賴(lài)以生存的環(huán)境，抑制軟骨細(xì)胞的增殖， 導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的死亡，從而阻止關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)。由此可知，IL-1是 有效的軟骨細(xì)胞增殖的抑制劑。IL-1對(duì)軟骨細(xì)胞分解代謝的作用也可 以通過(guò)在關(guān)節(jié)內(nèi)注射致炎因子而得到證明，將IL-1注射到鼠關(guān)節(jié)內(nèi)，會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)滑液中白細(xì)胞增多和關(guān)節(jié)軟骨的蛋白多糖丟失。在注射后1d內(nèi)，軟骨細(xì)胞蛋白多糖的合成會(huì)發(fā)生明顯的減少并且這種減少會(huì) 持續(xù)兩周。進(jìn)一步的研究表明，IL-1的信號(hào)傳導(dǎo)是通過(guò)

10、NF-kB通路。 還有學(xué)者指出，IL-1也可以通過(guò)依賴(lài)于NO或者不依賴(lài)于NO的途徑 激活鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶而發(fā)揮其生物學(xué)作用；IL-1對(duì)酪氨酸激酶的激活作 用也在多種細(xì)胞體系中被發(fā)現(xiàn)，包括T淋巴細(xì)胞以及軟骨細(xì)胞。2.2 IL-l對(duì)Sox9基因的調(diào)控作用 在人體內(nèi)，椎間盤(pán)是一個(gè)無(wú) 血管的纖維軟骨性結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞外基質(zhì)中廣泛聚集著類(lèi)軟骨細(xì)胞和纖 維樣細(xì)胞，當(dāng)椎間盤(pán)發(fā)生退變時(shí)，椎間盤(pán)組織中亦有致炎因子IL-1的高度表達(dá)，因此，我們有理由相信在椎間盤(pán)退變中，IL-1可能遵循 與在關(guān)節(jié)軟骨中同樣的機(jī)制，發(fā)揮生物學(xué)作用，參與椎間盤(pán)退變的調(diào) 節(jié)。在Murakami等14的研究中，IL-1和腫瘤壞死因子-atumor

11、 necrosis factor- a,TNF- a可以快速、明顯地導(dǎo)致 Sox9 mRNA 和(或) 蛋白表達(dá)水平的降低，從而進(jìn)一步影響到H型膠原等基因的表達(dá)及軟 骨的形成過(guò)程。有學(xué)者15經(jīng)研究證實(shí)，在不同濃度IL-1處理的椎間 盤(pán)細(xì)胞中對(duì)mRNA水平行相對(duì)定量分析，顯示出 Sox9基因的表達(dá) 有一個(gè)明顯的減弱過(guò)程，H型膠原和蛋白聚糖基因的表達(dá)也相應(yīng)的隨 之減弱，在Western免疫印跡和免疫組化對(duì)蛋白水平的檢測(cè)結(jié)果也 顯示出與mRNA表達(dá)結(jié)果的一致性，表明IL-1可以按劑量依賴(lài)方式 負(fù)向調(diào)節(jié)人椎間盤(pán)細(xì)胞中軟骨細(xì)胞特異性基因Sox9、II型膠原和蛋白聚糖基因的表達(dá)。進(jìn)一步的研究顯示出，IL-

12、1調(diào)控Sox9基因的表達(dá) 及其發(fā)揮的生物學(xué)作用很可能是通過(guò)核轉(zhuǎn)錄因子kB(n uclear transcription factor kappa B ，NF-kB)通路。2.3 IL-1對(duì)Sox9基因的調(diào)控機(jī)制 有研究表明，IL-1對(duì)Sox9 基因的調(diào)控是通過(guò)NF-kB通路完成的。NF-kB/Rel家族有5個(gè)成員： RelA(p65)、RelB、c2Rel、p50和p52，它們共同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是在 N 端均含有一段保守的約 300個(gè)氨基酸殘基左右的 Rel同源結(jié)構(gòu)域 (Re12homology domain，RHD)，RHD 中含有 DNA 結(jié)合區(qū)、核定位 序列(nuclear localiza

13、tion se2quenee， NLS)、二聚體化及 IkB 結(jié)合 的區(qū)域。根據(jù)結(jié)構(gòu)、功能和合成形式將上述成員分為兩組，第1組為C端不含有反式激活功能域(transactivation domain，TAD)的p50和 p52，二者分別由其蛋白前體p105和p100裂解而來(lái)，它們無(wú)激活轉(zhuǎn) 錄活性，與靶DNA序列結(jié)合后，表現(xiàn)為抑制基因轉(zhuǎn)錄；第2組為C 端含有TAD的RelA(p65)、RelB和c2Rel，它們沒(méi)有前體，與靶DNA 序列結(jié)合后，表現(xiàn)為促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。上述成員以一定的組合形成同源 或異源二聚體，即為不同的轉(zhuǎn)錄因子。但并非任何兩個(gè)成員都可以形 成二聚體，目前已知的二聚體有 p50/Re

14、lA、p50/c2Rel、RelA/c2Rel 異源二聚體以及RelA/RelA、p50/p50和p52/p52同源二聚體，其中 以p50/RelA最為常見(jiàn)，即通常所指的NF-kB。NF-kB是序列特異的 轉(zhuǎn)錄因子，不同的二聚體有不同的轉(zhuǎn)錄激活特性，對(duì)DNA靶序列的識(shí)別也略有不同，這就提高了 NF-kB亞單位對(duì)不同基因的表達(dá)調(diào)節(jié)。靜息狀態(tài)下細(xì)胞的NF-kB二聚體與其抑制蛋白1-kB結(jié)合為復(fù) 合物存在于胞漿中。I-kB家族成員有I-kB a、IF-kB B、I-kB 和ABcl23。 該家族共同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是都含有 57個(gè)約30個(gè)氨基酸殘基組成的 的錨蛋白重復(fù)區(qū)域(ankyrin repeat d

15、omain，ARD)，I-kB通過(guò)其ARD作用于NF-kB的RHD,使RHD上的NLS被覆蓋，進(jìn)而導(dǎo)致NF-kB 不能經(jīng)核孔向核內(nèi)易位。在致炎因子的刺激下，抑制蛋白I-kB會(huì)快速的磷酸化進(jìn)而降解，暴露出 NF-kB上的NLS，從而允許NFkB轉(zhuǎn) 位于核心位置并且通過(guò)在 kB的位置上結(jié)合DNA來(lái)對(duì)轉(zhuǎn)錄過(guò)程進(jìn)行 調(diào)節(jié)16、17。有研究14表明當(dāng)加入一定量的IkB降解抑制劑二硫 基碳化吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate ，PDTC)時(shí)，可以相應(yīng)地 阻斷由于IL-1引起的NFkB DNA的增加，由IL-1引起的Sox9蛋白 水平的減少也相應(yīng)地被阻斷，由此可證明 IL-1對(duì)S

16、ox9的調(diào)控是由 NF-xB通路所介導(dǎo)。2.4 IL-1可能存在的其他調(diào)控機(jī)制：除了激活 NF-kB 通路之外，IL-1對(duì)Sox9是否還存在其他方式的調(diào)控呢？有學(xué)者指出， IL-1可以使應(yīng)力活性蛋白激酶(SAPK)ERK，P38和JNK活化，而這 些蛋白激酶則磷酸化及激活轉(zhuǎn)錄因子 c-Jun ,ATF2和TCF/E1k1;IL-1 亦可以通過(guò)依賴(lài)于 NO或者不依賴(lài)于NO的途徑激活鳥(niǎo)甘酸環(huán)化 酶;IL-1還可以活化磷脂酶 A2,誘導(dǎo)COX的表達(dá)，導(dǎo)致PGE2水平 的增高;除此之外，IL-1還可以通過(guò)激活鞘磷脂酶來(lái)誘導(dǎo)神經(jīng)酰胺通 路;IL-1對(duì)酪氨酸激酶的激活作用也與多種細(xì)胞體系中被發(fā)現(xiàn)。雖然 已

17、證明IL-1可以激活多種信號(hào)傳導(dǎo)通路，但I(xiàn)L-1對(duì)Sox9的調(diào)控是 否通過(guò)其中的一種或幾種，仍需要進(jìn)一步的研究加以證實(shí)。還有研究顯示，IL-1和TNF- a可以激活其它不同的細(xì)胞通路， 從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子的活動(dòng)和表達(dá)發(fā)生相應(yīng)的變化，進(jìn)而影響整個(gè)轉(zhuǎn)錄過(guò)程。IL-1在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病中高度表達(dá)，同時(shí)也發(fā)揮著誘導(dǎo)MMPs轉(zhuǎn)錄過(guò)程的作用。MMPs啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)所必需的部分序 列包含在一個(gè)與轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1(activator protein-1 ，AP-1)高度 同源的DNA片段上，AP-1與MMPs啟動(dòng)子鄰近的上游調(diào)節(jié)序列的 共同作用是這一轉(zhuǎn)錄過(guò)程中主要的參與機(jī)制，IL-1很可能是通過(guò)影響

18、AP-1的表達(dá)或活動(dòng)來(lái)調(diào)節(jié)上述轉(zhuǎn)錄過(guò)程。目前，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，決定人類(lèi)軟骨發(fā)生、形成密切相關(guān)的Sox9 基因，很可能參與了椎間盤(pán)的退變過(guò)程，且其對(duì)椎間盤(pán)的作用受到某 些生長(zhǎng)因子以及炎性因子的調(diào)控。但目前的研究多集中在單一的細(xì)胞 因子對(duì)Sox9的調(diào)控。而椎間盤(pán)退變是多因素作用的結(jié)果，而非單一 細(xì)胞因子的作用。如果在不久的將來(lái)能對(duì)多種細(xì)胞因子的共同作用進(jìn) 行研究并更進(jìn)一步的揭示出這些細(xì)胞因子對(duì)Sox9的確切調(diào)控機(jī)制，將會(huì)對(duì)椎間盤(pán)退變的理論研究和治療具有重大的意義?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 趙勇，王文波基因治療與椎間盤(pán)退變J.中國(guó)矯形外 科雜志，2004，12 : 1332-1333.2 Wallach CJ,

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