凝膠分離技術(shù)

1、第三章 凝膠分離技術(shù) 凝膠是一種高分子聚合物，不溶于水，但遇水溶脹，形成三維空間結(jié)構(gòu)。 凝膠又稱分子篩，對(duì)生物大分子物質(zhì)具有篩分作用。 凝膠分離即是利用凝膠分子篩的篩分作用對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離的操作。 牛牛文庫文檔分享 優(yōu)點(diǎn)： 1、凝膠為不帶電荷的惰性物質(zhì)，不與溶質(zhì)分子發(fā)生任何作用，因此分離條件溫和， 產(chǎn)物收率高，重現(xiàn)性好； 2、應(yīng)用范圍廣，所分離物質(zhì)分子量覆蓋面大，可分離從幾百到數(shù)百萬分子量的物 質(zhì)； 3、設(shè)備簡單，操作方便，周期短，可反復(fù)使用。 凝膠分離已成為一種通用的分離方法，在生物大分子物質(zhì)（蛋白質(zhì)、酶、核 酸、激素、多糖等）的制備與生產(chǎn)技術(shù)中被廣泛應(yīng)用。 牛牛文庫文檔分享 第一節(jié) 凝膠分離

2、原理 一、凝膠分離原理 當(dāng)被分離物質(zhì)的分子大小不同時(shí)，能夠進(jìn)入到凝膠內(nèi)部的能力也不同。凝膠 中的孔隙大小與分子大小有相仿的數(shù)量級(jí)。當(dāng)混合物通過凝膠時(shí)，比孔隙小的分子 可以自由進(jìn)入凝膠內(nèi)部，而比孔隙大的分子就不能進(jìn)入，因此在移動(dòng)速度方面就出 現(xiàn)差異，從而使不同相對(duì)分子質(zhì)量的各組分得到分離。 牛牛文庫文檔分享 牛牛文庫文檔分享 牛牛文庫文檔分享 分離原理可用下式表示： VR = V0 + kVi 式中：VR：保留體積（洗脫體積） V0：柱床內(nèi)存在于凝膠外面的水相體積 外水體積 Vi：凝膠顆粒內(nèi)部所含的水相體積 內(nèi)水體積 k：分配系數(shù) 牛牛文庫文檔分享 被分離物質(zhì)分子很大，被完全排阻于凝膠顆粒之外：

3、 k = 0，VR = V0 ； 被分離物質(zhì)分子很小，能完全自由進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部： k =1，VR = V0 + Vi ； 中等大小的分子，只能達(dá)到部分凝膠顆粒內(nèi)部： 0 k 1，V0 VR V0 + Vi。 牛牛文庫文檔分享 Vo、Vi的測(cè)定 Vo的測(cè)定 選用分子量約200萬的藍(lán)色葡聚糖-2000（或一種不被凝膠滯留的有顏色的大 分子物質(zhì)，便于觀察)，測(cè)定它的洗脫曲線，洗脫峰峰頂洗出的體積就是該柱的Vo 值。 Vi的測(cè)定 選用一種分子量小于凝膠工作范圍下限的化合物，測(cè)出其洗脫體積，減去Vo 就是該柱的Vi 。常用鉻酸鉀(黃色)或有UV吸收的物質(zhì)如N-乙酰酪氨酸乙酯來測(cè)定。 牛牛文庫文檔分享

4、分配系數(shù)k的計(jì)算： k = （VR-V0）/ Vi 牛牛文庫文檔分享 分子量與洗脫體積的關(guān)系： lgMr=-kVR+Vo（成立？） Mr很大時(shí)，達(dá)到上限？ Mr很小時(shí)，達(dá)到下限？ 牛牛文庫文檔分享 二、常用凝膠 葡聚糖凝膠(dextran gel，Sephadex) 聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gel，Bio-Gel P) 瓊脂糖凝膠(agarose gel，Sepharose) 瓊脂糖及葡聚糖組成的復(fù)合凝膠(Superdex) 此外還有葡聚糖醚、聚甲基丙烯酸醋、聚苯乙烯等制成的凝膠 牛牛文庫文檔分享 1、葡聚糖凝膠 葡聚糖凝膠在水、醇、乙二醇、甲酸胺、二甲基甲酸胺、二甲亞楓

5、等溶劑中 都可吸液膨脹, 但吸收溶劑的量與膨脹后的體積視溶劑而異。凝膠充分膨脹的時(shí)間 隨交聯(lián)度而不同, 交聯(lián)度越小所需時(shí)間越長, 加熱可以縮短吸水膨脹時(shí)間。 牛牛文庫文檔分享 葡聚糖和3-氯-1，2環(huán)氧丙烷以醚鍵相互交聯(lián)形成。 按交聯(lián)度大小分8種型號(hào)，G值代表不同交聯(lián)度。 Sephadex G-10，15，25，50，75，100，150，200 數(shù)字表示每克干膠膨脹時(shí)吸水量的10倍。 Sephadex G-25代表每克干膠膨脹時(shí)可以吸水2.5克。 牛牛文庫文檔分享 葡聚糖凝膠 牛牛文庫文檔分享 牛牛文庫文檔分享 葡聚糖凝膠只能應(yīng)用于水溶性物質(zhì)與水溶液或類水溶液, 但如在葡聚糖分子上 引入有機(jī)

6、基團(tuán)則可以增大其有機(jī)性質(zhì)而使之呈親脂性。如LH-20型葡聚糖凝膠即為 在G-25型凝膠上引入羥丙基基團(tuán), 使糖分子與醚鏈相連。這種凝膠既有親水性, 又 有親脂性, 可以在多種有機(jī)溶劑中膨脹后應(yīng)用, 如氯仿、丁醇、四氫呋喃、二氧六 環(huán)等, 但在苯、乙酸乙酯等溶劑中膨脹不多, 較少應(yīng)用。用氯仿時(shí),因凝膠比重較小, 所以要采取措施, 使凝膠不能浮起, 也可改用上行法。 牛牛文庫文檔分享 2、聚丙烯酰胺凝膠 牛牛文庫文檔分享 牛牛文庫文檔分享 3、瓊脂糖凝膠 瓊脂糖凝膠與前二種不同, 它不是以化學(xué)鍵共價(jià)鍵交聯(lián)的, 而是以氫鍵交聯(lián), 不同的孔隙程度是由改變瓊脂糖的濃度而達(dá)到的,因此穩(wěn)定性有一定限制。沒有

7、干 的凝膠, 必須在膨脹狀態(tài)保存, 遇脫水劑、冷凍和有機(jī)溶劑即破壞。pH在4-9之間、 溫度在0-40之間穩(wěn)定, 超出此范圍即破壞。 牛牛文庫文檔分享 牛牛文庫文檔分享 三、凝膠特性參數(shù) 1、排阻極限：指不能擴(kuò)散到凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部的最小分子的相對(duì)分子質(zhì)量，即相對(duì)分 子質(zhì)量大于該數(shù)值的分子不能進(jìn)入到凝膠網(wǎng)絡(luò)中，其洗脫體積為Vo。 如Sephadex G50的排阻極限為30000。 2、分級(jí)范圍：即能為凝膠阻滯并且相互之間可以得到分離的溶質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量 范圍。 如Sephadex G50的分級(jí)范圍為1500-30000。 牛牛文庫文檔分享 3、凝膠粒徑：凝膠一般為球形，其粒徑越小，HETP（理論板當(dāng)

8、量高度）越小，分 辨率越高。 凝膠粒徑多用篩目或微米表示。如軟粒凝膠一般為50-150微米（100-300目）， 硬粒凝膠一般為5-50微米。 4、空隙體積：指柱中凝膠之間空隙的體積，即Vo。 空隙體積可用相對(duì)分子質(zhì)量大于排阻極限的溶質(zhì)測(cè)定，如相對(duì)分子質(zhì)量為200 萬的水溶性藍(lán)色葡聚糖。 牛牛文庫文檔分享 5、溶脹率：溶脹后每克干凝膠所吸收的水分的百分?jǐn)?shù)稱為溶脹率，即 溶脹率=100% 如Sephadex G50的溶脹率為500%30%。 6、床體積：指1克干膠充分溶脹后所占有的體積。 如Sephadex G50的床體積為9-11mL/g干膠。 凝膠的床體積可用于估算裝滿一定體積的凝膠柱所需的

9、凝膠干粉量。 牛牛文庫文檔分享 第二節(jié) 凝膠分離應(yīng)用 凝膠分離特點(diǎn) (1)溶質(zhì)與介質(zhì)不發(fā)生相互作用，操作條件溫和，回收率可接近100%； (2)批次之間不需要進(jìn)行苛刻的介質(zhì)清洗或再生，容易實(shí)現(xiàn)循環(huán)操作； (3)分離機(jī)理簡單、操作參數(shù)少、容易規(guī)模放大； (4)僅根據(jù)分子量進(jìn)行分離，選擇性較低，處理量小。 牛牛文庫文檔分享 一、凝膠的選擇與處理 1、排阻范圍的選擇 牛牛文庫文檔分享 2、粒度的選擇 牛牛文庫文檔分享 3、凝膠用量的選擇 干凝膠用量（g）：r2h/床體積 理論用量（1+10%）=凝膠處理量 牛牛文庫文檔分享 4、凝膠的處理 （1）除去影響流速的過細(xì)顆粒 “水力浮洗法”：將顆粒粗細(xì)不均

10、的凝膠懸浮在大 體積的水中，讓它自然沉降，過細(xì)的顆粒浮在上面，倒 去即可。反復(fù)幾次。 （2）溶脹 使用前需直接在欲使用的洗脫液中浸泡溶脹。通常 使用“熱法”溶脹，即在沸水浴中，將懸浮于洗脫液中 的凝膠漿逐漸升溫到近沸，12小時(shí)即可。 沸水溶脹不但節(jié)省時(shí)間，還可以殺滅凝膠中污染 的細(xì)菌并排除氣體。 牛牛文庫文檔分享 （3）為了保證流速穩(wěn)定，獲得較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用前用傾瀉法傾去不易沉下的 較細(xì)顆粒，使凝膠顆粒大小一致。 牛牛文庫文檔分享 5、柱結(jié)構(gòu)（、h）的選擇 牛牛文庫文檔分享 柱太短，影響分離效果；柱長一些，分離效果好，但柱太長，則延長分離時(shí)間， 樣品也稀釋過度。層析柱的內(nèi)徑也要選擇適當(dāng)：內(nèi)

11、徑過細(xì)（小于1cm），會(huì)發(fā)生 “器壁效應(yīng)”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影響分離效果；過大（大 于5cm）則稀釋現(xiàn)象嚴(yán)重。所以層析柱的內(nèi)徑和高度應(yīng)有一定的比例：對(duì)于除鹽 來說應(yīng)為15125；對(duì)于純化蛋白質(zhì)來說應(yīng)為1201100。 牛牛文庫文檔分享 二、凝膠分離操作技術(shù) 1、凝膠裝柱 將層析柱垂直裝載支架上，將下端輸液管夾緊； 向柱中加入約1/3體積的0.9NaCl溶液（或洗脫液）； 將一細(xì)玻棒伸入柱內(nèi)，靠近管內(nèi)壁，順著玻棒緩慢的向管內(nèi)加入混勻的凝膠溶 液； 凝膠加至層析柱頂端約3cm時(shí)，打開柱下端輸液開關(guān)，使流速控制在0.25- 0.5ml/cm2min。 連續(xù)而緩慢的加凝膠直到穩(wěn)定在離管

12、口約5cm處。 注意：防止空氣進(jìn)入凝膠床 牛牛文庫文檔分享 裝柱操作注意事項(xiàng)： 灌注凝膠時(shí)要求將均勻的凝膠一直加到所需柱床高度，不能時(shí)斷時(shí)續(xù)，否則 將出現(xiàn)分層或“紋路”等毛病。若出現(xiàn)這些現(xiàn)象，可以用玻璃棒將已經(jīng)形成的柱床 逐步攪起，直至出毛病的地方，再繼續(xù)加入攪勻的凝膠懸液。若在灌好凝膠后才發(fā) 現(xiàn)“紋路”、分層等現(xiàn)象時(shí)，要重新裝柱，以免影響層析效果。在做大型的凝膠柱 時(shí)，灌注的凝膠是否均勻往往從表面上看不出來，所以使用前應(yīng)用一些帶色的大分 子物質(zhì)如細(xì)胞色素C、血紅蛋白或?qū)Ｓ玫乃{(lán)色葡聚糖2000（Blue dextran-2000） 通過凝膠柱，以檢查形成的帶色斑帶是否整齊，若斑帶歪斜，應(yīng)該重新

13、裝柱，直至 達(dá)到要求。 牛牛文庫文檔分享 注1：剛從冰箱中取出的凝膠液，不能馬上用來灌柱，應(yīng)平衡至室溫后再用，不 然裝好的凝膠柱會(huì)產(chǎn)生大量的氣泡影響層析。 注2：在整個(gè)灌注凝膠的過程及使用中，凝膠柱面上一定要覆蓋著一層溶液，以 免進(jìn)入空氣。若進(jìn)空氣，在加入溶液時(shí)，凝膠柱中易形成氣泡。 注3：裝好的凝膠柱，使用時(shí)應(yīng)該用相當(dāng)于柱體積兩倍或更多的洗脫液流過洗脫 柱，以壓實(shí)凝膠。 牛牛文庫文檔分享 2、樣品的上柱及洗脫 加樣量的控制 分析：1-2ml/100ml床體積， 制備：10-30ml/100ml床體積 洗脫液的選擇：首先洗脫液最好與浸泡凝膠時(shí)所用的溶液一致，否則由于更換溶 劑，凝膠體積會(huì)發(fā)生變

14、化而影響分離效果；水溶性物質(zhì)的洗脫用水或具有不同離子 強(qiáng)度和pH的緩沖液，非水溶性物質(zhì)的洗脫用有機(jī)溶劑（苯、丙酮等）。 牛牛文庫文檔分享 葡聚糖基本上不帶電荷、呈惰性，不與被分離的物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，所以分離的效 果較好。然而由于是葡萄糖的聚合物，因而仍有少量的活性羥基，能吸附少量 蛋白質(zhì)等被分離的物質(zhì)。為了克服這個(gè)缺點(diǎn)，一般使用含有離子強(qiáng)度達(dá)0.08的 NaCl等中性鹽作洗脫液。 牛牛文庫文檔分享 凝膠層析加樣操作示意圖 牛牛文庫文檔分享 圖注： 1、平衡好的層析柱。 2、沿管壁將樣品溶液小心加到凝膠床面上，應(yīng)避免將床面凝膠沖起。 3-4、打開下口夾子，使樣品溶液流入柱內(nèi)，同時(shí)收集流出液， 5-7

15、、當(dāng)樣品溶液流至與膠面相切時(shí)，夾緊下口夾子。按加樣操作，用1mL洗脫液 沖洗管壁2次。 8-9、最后加入34mL洗脫液于凝膠上。 10、連接柱層析系統(tǒng)，自動(dòng)收集記錄。 牛牛文庫文檔分享 凝膠分離洗脫與自動(dòng)收集系統(tǒng) 牛牛文庫文檔分享 實(shí)物圖 牛牛文庫文檔分享 凝膠層析中的分離行為 藍(lán)葡聚糖（蘭色）、血紅蛋白（紅色）、鉻酸鉀(黃色) 牛牛文庫文檔分享 3、凝膠的回收與保存 凝膠一次裝柱后可以反復(fù)使用，不必特殊處理，并不影響分離效果。為了防 止凝膠染菌，可在一次層析后加入0.02的疊氮化鈉，在下次層析前將抑菌劑除去， 以免干擾洗脫液的測(cè)定。 如果不再使用可將其回收，一般方法是將凝膠用水沖洗干凈濾干，

16、依次用70 、90、95乙醇脫水平衡至乙醇濃度達(dá)90以上，濾干，再用乙醚洗去乙醇、 濾干、干燥保存。濕態(tài)保存方法是凝膠漿中加入抑菌劑或水沖洗到中性，密封后高 壓滅菌保存。 牛牛文庫文檔分享 三、影響凝膠分離的因素 1、流速對(duì)蛋白質(zhì)分辨率的影響 牛牛文庫文檔分享 2、黏度對(duì)分辨率的影響 牛牛文庫文檔分享 3、凝膠柱層析操作壓 操作壓的增加會(huì)影響流速（變快？變慢？），此外還可以導(dǎo)致凝膠膠面下降， 柱床容積的改變，相應(yīng)測(cè)出的Vt，Vo，Ve等也改變，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差。 牛牛文庫文檔分享 操作壓與流速的關(guān)系 牛牛文庫文檔分享 4、加樣量對(duì)分辨率的影響 I .加樣量少時(shí)，A、 B二種物質(zhì)完全分開。 I

17、I.加樣量適當(dāng)時(shí)， A、B 二種物質(zhì)剛剛 分開。 III.加樣量太大時(shí)， A、B二種物質(zhì)只能 部分分開。 牛牛文庫文檔分享 （1）分析工作時(shí)，樣品體積為柱床體積的14%； 制備分離時(shí)，樣品體積為柱床體積的2530%。 （2） 分離體積（Vsep=Ve1-Ve2） 當(dāng)樣品體積Vsep時(shí)，兩個(gè)相鄰組分不能完全分離。 牛牛文庫文檔分享 5、凝膠粒徑對(duì)分辨率的影響 粒徑小的分離較好, 分辨度較高, 但流速低； 粒度大的流速高, 但洗脫峰較為扁平, 分辨度也較差。 從分析角度考慮, 以用較細(xì)顆粒與較慢流速為好。 牛牛文庫文檔分享 四、凝膠分離的應(yīng)用 主要應(yīng)用范圍： 分級(jí)分離各種抗原與抗體； 去掉復(fù)合物中

18、的小分子物質(zhì)，如除鹽、熒光素和游離 的放射性同位素以及水解的蛋白質(zhì)碎片； 分析血清中的免疫復(fù)合物； 分子量的測(cè)定。 牛牛文庫文檔分享 脫鹽：高分子（如蛋白質(zhì)、核酸、多糖等）溶液中的低分子量雜質(zhì)，可以用凝膠 法除去，這一操作稱為脫鹽。本法脫鹽操作簡便、快速、蛋白質(zhì)和酶類等在脫鹽過 程中不易變性。適用的凝膠為SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。柱長 與直徑之比為5-15，樣品體積可達(dá)柱床體積的25-30，為了防止蛋白質(zhì)脫鹽后 溶解度降低會(huì)形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸銨等揮發(fā)性鹽類緩沖液使層析柱平 衡，然后加入樣品，再用同樣緩沖液洗脫，收集的洗脫液用冷凍干燥法除去

19、揮發(fā)性 鹽類。 牛牛文庫文檔分享 用于分離提純：凝膠層析法已廣泛用于酶、蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、激素、生物 堿等物質(zhì)的分離提純。凝膠對(duì)熱原有較強(qiáng)的吸附力，可用來去除無離子水中的致熱 原制備注射用水。 高分子溶液的濃縮：通常將SephadexG-25或50干膠投入到稀的高分子溶液中， 這時(shí)水分和低分子量的物質(zhì)就會(huì)進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部的孔隙中，而高分子物質(zhì)則排阻 在凝膠顆粒之外，再經(jīng)離心或過濾，將溶脹的凝膠分離出去，就得到了濃縮的高分 子溶液。 牛牛文庫文檔分享 測(cè)定高分子物質(zhì)的分子量：用一系列已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)品放入同一凝膠柱內(nèi)，在 同一條件下分離，記錄每一成分的洗脫體積，并以洗脫體積對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作圖

20、， 在一定分子量范圍內(nèi)可得一直線，即分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定未知物質(zhì)的分子量時(shí)， 可將此樣品加在測(cè)定了標(biāo)準(zhǔn)曲線的凝膠柱內(nèi)洗脫后，根據(jù)物質(zhì)的洗脫體積，在標(biāo)準(zhǔn) 曲線上查出它的分子量。 牛牛文庫文檔分享 牛牛文庫文檔分享 被分離物質(zhì)分子很大，被完全排阻于凝膠顆粒之外： k = 0，VR = V0 ； 被分離物質(zhì)分子很小，能完全自由進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部： k =1，VR = V0 + Vi ； 中等大小的分子，只能達(dá)到部分凝膠顆粒內(nèi)部： 0 k 1，V0 VR V0 + Vi。 牛牛文庫文檔分享 二、常用凝膠 葡聚糖凝膠(dextran gel，Sephadex) 聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gel，Bio-Gel P) 瓊脂糖凝膠(aga