單克隆抗體的制備.

1、單克隆抗體的研制一、單克隆抗體的概念抗體是機(jī)體在抗原刺激下產(chǎn)生的能與該抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白。常規(guī)的抗體制備是通過動物免疫并采集抗血清的方法產(chǎn)生的，因而抗血清通常含有針對其他無關(guān)抗原的抗體和血清中其他蛋白質(zhì)成分。一般的抗原分子大多含有多個不同的抗原決定簇，所以常規(guī)抗體也是針對多個不同抗原決定簇抗體的混合物。即使是針對同一抗原決定簇的常規(guī)血清抗體，仍是由不同B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的異質(zhì)的抗體組成。因而，常規(guī)血清抗體又稱多克隆抗體（polyclonal antibody），簡稱多抗。由于常規(guī)抗體的多克隆性質(zhì)，加之不同批次的抗體制劑質(zhì)量差異很大，使它在免疫化學(xué)試驗等使用中帶來許多麻煩。 因此，制備針對預(yù)

2、定抗原的特異性均質(zhì)的且能保證無限量供應(yīng)的抗體是免疫化學(xué)家長期夢寐以求的目 標(biāo)。隨著雜交瘤技術(shù)的誕生，這一目標(biāo)得以實現(xiàn)。1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，他們把用預(yù)定抗原免疫的小鼠脾細(xì)胞 與能在體外培養(yǎng)中無限制生長的骨髓瘤細(xì)胞融合，形成B細(xì)胞雜交瘤。這種雜交瘤細(xì)胞具有雙親細(xì)胞的特征，既像骨髓瘤細(xì)胞一樣在體外培養(yǎng)中能無限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴細(xì)胞那樣合成和分泌特異性抗體。通過克隆化可得到來自單個雜交瘤細(xì)胞的單克隆系，即雜交瘤細(xì)胞系，它所產(chǎn) 生的抗體是針對同一抗原決定簇的高度同質(zhì)的抗體，即所謂單克隆抗體（monoclonal antibody），簡稱單抗

3、。與多抗相比，單抗純度高，專一性強(qiáng)、重復(fù)性好、且能持續(xù)地?zé)o限量供應(yīng)。單抗技術(shù)的問世， 不僅帶來了免疫學(xué)領(lǐng)域里的一次革命，而且它在生物醫(yī)學(xué)科學(xué)的各個領(lǐng)域獲得極廣泛的應(yīng)用，促進(jìn)了眾多學(xué)科的發(fā)展。Kohler和Milstein兩人由此杰出貢獻(xiàn)而榮獲1984年度諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎。二、雜交瘤技術(shù)（一）雜交瘤技術(shù)的誕生淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)的誕生是幾十年來免疫學(xué)在理論和技術(shù)兩方面發(fā)展的必然結(jié)果，抗體生成的克隆選擇學(xué)說、抗體基因的研究、抗體結(jié)構(gòu)與生物合成以及其多樣性產(chǎn)生機(jī)制的揭示等，為雜交瘤技 術(shù)提供了必要理論基礎(chǔ)，同時，骨髓瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)、細(xì)胞融合與雜交細(xì)胞的篩選等提供了技術(shù)貯 備。1975年8月7 日

4、, Kohler和Milstein在英國自然雜志上發(fā)表了題為“分泌具有預(yù)定特異性抗 體的融合細(xì)胞的持續(xù)培養(yǎng)”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefinedspecificity ）的著名論文。他們大膽地把以前不同骨髓瘤細(xì)胞之間的融合延伸為將喪失合成次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT ）的骨髓瘤細(xì)胞與 經(jīng)綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合。融合由仙臺病毒介導(dǎo)，雜交細(xì)胞通過在含有次黃嘌呤（hypoxa

5、nthi ne， H ）、氨基喋呤（ami nopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidi ne，T）的培養(yǎng)基（HAT） 中生長進(jìn)行選擇。在融合后的細(xì)胞群體里，盡管未融合的正常脾細(xì)胞和相互融合的脾細(xì)胞是HGPRT+，但不能連續(xù)培養(yǎng)，只能在培養(yǎng)基中存活幾天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤細(xì)胞和相互融合的 HGPRT-骨髓瘤細(xì)胞不能在 HAT培養(yǎng)基中存活，只有骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞形成的雜交瘤細(xì)胞因得到分別來自 親本脾細(xì)胞的 HGPRT 和親本骨髓瘤細(xì)胞的連續(xù)繼代特性， 而在 HAT 培養(yǎng)基中存活下來。 實驗的結(jié)果 完全像起始設(shè)計的那樣， 最終得到了很多分泌抗綿羊紅細(xì)胞抗體的克隆化雜交瘤細(xì)胞系。

6、用這些細(xì)胞 系注射小鼠后能形成腫瘤，即所謂雜交瘤。生長雜交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同質(zhì)的抗體，即 單克隆抗體。這一技術(shù)建立后不久，在融合劑和所用的骨髓瘤細(xì)胞系等方面即得到改進(jìn)。最早仙臺病毒被用做融合劑，后來發(fā)現(xiàn)聚乙二醇（PEG ）的融合效果更好，且避免了病毒的污染問題，從而得到廣泛的 應(yīng)用。隨后建立的骨髓瘤細(xì)胞系如 SP2/0-Ag14 ， X63-Ag8.653 和 NSO/1 都是既不合成輕鏈又不合成 重鏈的變種，所以由它們產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞系，只分泌一種針對預(yù)定的抗原的抗體分子，克服了骨髓 瘤細(xì)胞 MOPC-21 等的不足。再后來又建立了大鼠、人和雞等用于細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞系，但其基

7、 本原理和方法是一樣的。（二） 基本程序和方法 雜交瘤技術(shù)在具體操作上，各實驗室使用的程序不盡一致。本節(jié)中介紹的方法是作者所在實驗 室采用的、實踐證明成熟的程序，該程序適合國內(nèi)大多數(shù)實驗室。在開展雜交瘤技術(shù)制備單抗之前，培養(yǎng)骨髓瘤和雜交瘤細(xì)胞必須具備下列主要儀器設(shè)備：超凈工作臺、C02恒溫培養(yǎng)箱、超低溫冰箱（-70 C）、倒置顯微鏡、精密天平或電子天平、液氮罐、離心機(jī)（水平轉(zhuǎn)子，4000r/min ）、37C水浴箱、純水裝置、濾器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、 50ml、 25ml 細(xì)胞培養(yǎng)瓶， 10ml、 1ml 刻度吸管，試管，滴管（彎頭、直頭） ，平皿，燒杯， 500ml

8、、 250ml、 100ml 鹽水瓶，青霉素小瓶， 10ml、 5ml、 1ml 注射器等， 96 孔、 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，融合管（50ml 圓底帶蓋玻璃或塑料離心管） ，眼科剪刀，眼科鑷，血細(xì)胞計數(shù)板，可調(diào)微量加樣器（ 50ul，200ul, 1000ul）,彎頭針頭，200目篩網(wǎng)，小鼠固定裝置等。此外，雜交瘤細(xì)胞的篩選與檢測的儀 器設(shè)備，依據(jù)檢測單抗的方法不同而各異，請參閱本節(jié)有關(guān)部分。淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)的主要步驟包括：動物免疫、細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞的篩選與單抗檢測、 雜交瘤細(xì)胞的克隆化、 凍存、 單抗的鑒定等， 圖 6-1 概括了淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)研制單抗的主要過程。1、動物免疫（1）

9、抗原制備 制備單克隆抗體的免疫抗原，從純度上說雖不要求很高，但高純度的抗原使得到所需 單抗的機(jī)會增加，同時可以減輕篩選的工作量。因此，免疫抗原是越純越好，應(yīng)根據(jù)所研究的抗原和 實驗室的條件來決定。一般來說，抗原的來源有限，或性質(zhì)不穩(wěn)定，提純時易變性，或其免疫原性很 強(qiáng)，或所需單抗是用于抗原不同組分的純化或分析等，免疫用的抗原只需初步提純甚至不提純，但抗 原中混雜物很多，特別是如果這些混雜物的免疫原性較強(qiáng)時，則必須對抗原進(jìn)行純化。檢測用抗原可 以是與免疫抗原純度相同， 也可是不同的純度， 這主要決定于所用篩檢方法的種類及其特異性和敏感 性。（2）免疫動物的選擇 根據(jù)所用的骨髓瘤細(xì)胞可選用小鼠和大

10、鼠作為免疫動物。因為，所有的供雜交瘤技術(shù)用的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系均來源于 BALB/c 小鼠，所有的大鼠骨髓瘤細(xì)胞都來源于 L0U/c 大鼠， 所以一般的雜交瘤生產(chǎn)都是用這兩種純系動物作為免疫動物。但是， 有時為了特殊目的而需進(jìn)行種間雜交，則可免疫其他動物。種間雜交瘤一般分泌抗體的能力不穩(wěn)定，因為染色體容易丟失。就小鼠而言，初次免疫時以8-12周齡為宜，雌性鼠較便于操作。（3）免疫程序的確定免疫是單抗制備過程中的重要環(huán)節(jié)之一，其目的在于使B淋巴細(xì)胞在特異抗原刺激下分化、增殖，以利于細(xì)胞融合形成雜交細(xì)胞，并增加獲得分泌特異性抗體的雜交瘤的機(jī)會。因 此在設(shè)計免疫程序時，應(yīng)考慮到抗原的性質(zhì)和純度、抗原量

11、、免疫途徑、免疫次數(shù)與間隔時間、佐劑 的應(yīng)用及動物對該抗原的應(yīng)答能力等。沒有一個免疫程序能適用于各種抗原?，F(xiàn)用的免疫程序中多數(shù)是參照制備常規(guī)多克隆抗體的方法。表6-1列舉了目前常用的免疫程序。免疫途徑常用體內(nèi)免疫法包括皮下注射、腹腔或靜脈注射，也采用足墊、皮內(nèi)、滴鼻或點眼。最后一次加強(qiáng)免疫多采用腹腔或靜 脈注射，目前尤其推崇后者，因為可使抗原對脾細(xì)胞作用更迅速而充分。在最后一次加強(qiáng)免疫后第3天取脾融合為好，許多實驗室的結(jié)果表明，初次免疫和再次免疫應(yīng)答反應(yīng)中，取脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞 融合，特異性雜交瘤的形成高峰分別為第4天和第22天，在初次免疫應(yīng)答時獲得的雜交瘤主要分泌IgM抗體，再次免疫應(yīng)答時獲

12、得的雜交瘤主要分泌IgG抗體。筆者體會陽性雜交瘤出現(xiàn)的高峰與小鼠血清抗體的滴度并無明顯的平行關(guān)系，且多在血清抗體高峰之前。因此，為達(dá)到最高的雜交瘤形成率 需要有盡可能多的漿母細(xì)胞，這在最后一次加強(qiáng)免疫后第3天取脾進(jìn)行融合較適宜。已有人報道采用脾內(nèi)免疫，可提高小鼠對抗原的免疫反應(yīng)性，且節(jié)省時間，一般免疫3天后即可融合。表6-1不同免疫抗原的免疫程序免疫原特性抗原量接種次數(shù)間隔時間單抗的特性抗體滴度親和性免疫原性強(qiáng)（如 細(xì)胞、細(xì)菌和病 毒等）106-107 個細(xì)胞或1-10ug2-42-4周高中等至強(qiáng)免疫原性中等10-100ug2-42-4周中等或咼中等或強(qiáng)免疫原性弱A.20-400ug2-4隨后

13、2-3每月2-3月中等強(qiáng)B.10-50ug 其后200-400ug2其后4每月每天中等中等C.10-100ug2其后4其后“休息”最后加強(qiáng)每月10天1-2月中等中等或強(qiáng)（摘自劉秀梵）4-8周齡 BALB/c小體內(nèi)免疫法適用于免疫原性強(qiáng)、來源充分的抗原，對于免疫原性很弱或?qū)C(jī)體有害（如引起免疫 抑制）的抗原就不適用了。如果制備人單克隆抗體幾乎不大可能采用體內(nèi)免疫法。因此，針對這些情 況，可采用體外免疫。所謂體外免疫就是將脾細(xì)胞（或淋巴結(jié)細(xì)胞，或外周血淋巴細(xì)胞）取出體外， 在一定條件下與抗原共同培養(yǎng)，然后再與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。其基本方法是取鼠的脾臟，制成單細(xì)胞懸液，用無血清培養(yǎng)液洗滌 2-3 次

14、，然后懸浮于含 10%小牛血清的培養(yǎng)液中， 再加入適量抗原（可溶性抗原0.5-5ug/ml ，細(xì)胞抗原105-10 6個細(xì)胞/ml ）和一定量的BALB/c小鼠胸腺細(xì)胞培養(yǎng)上清液；在37C, 6%CO2濃度下培養(yǎng)3-5天，再分離脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。2、細(xì)胞融合（1） 主要試劑的配制a、細(xì)胞培養(yǎng)基 雜交瘤技術(shù)中使用的細(xì)胞培養(yǎng)基主要有 RPMI-1640 或 DMEM （DulbercoModified Eagles Medium ）兩種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，具體配制方法按廠家規(guī)定的程序，配好后過濾除菌（0.22um）,分裝，4C保存。不完全 RPMI-1640培養(yǎng)基：RPMI-1640培養(yǎng)基原液 96

15、ml100 x L.G.溶液（L-谷氨酸）1ml雙抗溶液 1ml7.5% NaHCO 3溶液 1-2ml HEPES 溶液 1ml不完全 DMEM 培養(yǎng)基： DMEM 13.37g超純水或四蒸水 980mlNaHCO 3 3.7g 雙抗溶液 10ml100 x L.G.溶液 10ml用1N HCl調(diào)試PH至7.2-7.4，過濾除菌，分裝 4C保存。完全 RPMI-1640或DMEM 培養(yǎng)基：不完全 RPMI-1640或DMEM 培養(yǎng)基80ml小牛血清 15-20ml用于骨髓瘤細(xì)胞 SP2/0和建株后的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)。 HT 培 養(yǎng)基： 完全 RPMI-1640 或 DMEM 培 養(yǎng)基 99ml

16、HT 貯存液 1ml HAT 培 養(yǎng)基： 完全 RPMI-1640或DMEM 培養(yǎng)基 98mlHT 貯存液 1mlA 貯存液 1ml-5b、氨基喋呤（A）貯存液（100 x, 4x 10- mol/L ）:稱取 1.76mg 氨基喋呤（Ami nopterin MW 440.4），溶于 90ml 超純水或四蒸水中，滴加 1mol/L NaOH 0.5ml 中和，再補加超純水或四 蒸水至100ml。過濾除菌，分裝小瓶（2ml/瓶），-20 C保存。-2-3c、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）貯存液（100 x ,H:10 mol/L , T： 1.6 x 10 mol/L）:稱取136.1mg 次

17、黃嘌呤（Hypoxanthine,MW 136.1）和 38.8mg 胸腺嘧啶核苷（Thymidine,MW 242.2）, 加超純水或四蒸水至 100ml,置45-50 C水浴中使完全溶解，過濾除菌，分裝小瓶（2ml/瓶），-20 C凍存。用前可置 37 C加溫助溶。d、 L-谷氨酰胺（L.G.）溶液（100X, 0.2mol/L ）:稱取 2.92g L-谷氨酰胺（L-glutamine , MW46.15 ），用100ml不完全培養(yǎng)液或超純水 （或四蒸水）溶解，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/ 瓶），-20 C凍存。e、 青、鏈霉素（雙抗）溶液（100X）:取青霉素G （鈉鹽）100萬單

18、位和鏈霉素（硫酸鹽）1g, 溶于100ml滅菌超純水或四蒸水中，分裝小瓶（4-5ml/ 瓶） , -20 C凍存。f、7.5% NaHCQ溶液：稱取分析純 NaHCO7.5g，溶于100ml超純水或四蒸水中，過濾除菌， 分裝小瓶（4-5ml/瓶），蓋緊瓶塞，4C保存。g、HEPES 溶 液 （1mol/L ）:稱取 23.83g HEPES （ N-2-Hydroxyethylpiperazine-N，-2-ethanesulfonic acid, N-2-羥乙基哌嗪-N，-2-乙基磺酸，MW 238.3）溶于 100ml 超純水或四蒸水中，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/ 瓶） , 4C保存

19、。h、 8-氮鳥嘌呤貯存液（100X）: 稱取200mg 8-氮鳥嘌呤（8-azaguanine , MW 152.1）,加入 4mol/L NaOH 1ml，待其溶解后，加入超純水或四蒸水99ml，過濾除菌；分裝小瓶，-20 C凍存。使用時按 1%濃度加入到培養(yǎng)液中（即終濃度為20ug/ml ）。i、 50% PEG:稱取PEG 1000或4000 20-50g 于三角瓶中，蓋緊，60-80 C水浴融化，0.6ml分裝于青霉素小瓶中，蓋緊，8磅高壓蒸汽15分鐘，-20 C存放備用。臨用前加熱融化，加等量不完全培養(yǎng)基，用少許7.5% NaHCO調(diào)PH至8.0，或購買Sigma或Gibco公司現(xiàn)

20、成產(chǎn)品。 髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備 融合前骨髓瘤細(xì)胞維持的方式，對成功地得到雜交瘤是最為重要的。目標(biāo)是使細(xì)胞處于對數(shù)生 長的時間盡可能長， 融合前肯定不能少于 1 周。凍存的細(xì)胞在復(fù)蘇后要 2 周時間才能處于適合于融合 的狀態(tài)， 長過了的骨髓瘤細(xì)胞至少幾天才可能恢復(fù)。 在實驗室中處于對數(shù)生長的骨髓瘤細(xì)胞維持在含 10%小牛血清的培養(yǎng)基中，方法是用6個裝5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶，接種 10倍系列稀釋的骨髓瘤細(xì)胞。1 周后到細(xì)胞相當(dāng)密而又未長過的一瓶重新移植。典型的倍增時間為14-16 小時。骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備方法如下：a、于融合前 48-36 小時，將骨髓瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)（一般按一塊 96 孔板的融合試驗約需

21、 2-3 瓶 100ml 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)備） 。b、融合當(dāng)天， 用彎頭滴管將細(xì)胞從瓶壁輕輕吹下 ，收集于 50ml 離心管或融合管內(nèi)。c、1000r/min 離心 5-10 分鐘，棄去上清。d、加入 30ml 不完全培養(yǎng)基，同法離心洗滌一次。然后將細(xì)胞重懸浮于 10ml 不完全培養(yǎng)基，混 勻。e、 取骨髓瘤細(xì)胞懸液， 加 0.4%臺盼藍(lán)染液作活細(xì)胞計數(shù)后備用。細(xì)胞計數(shù)時， 取細(xì)胞懸液 0.1ml加入 0.9ml 臺盼藍(lán)染液中，混勻，用血球計數(shù)板計數(shù)。計算細(xì)胞數(shù)目的公式為：每毫升細(xì) 胞數(shù)=4個大方格細(xì)胞數(shù)X 105/4 ;或每毫升細(xì)胞數(shù)=5個中方格細(xì)胞數(shù)X 106/2 脾淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備取

22、已經(jīng)免疫的 BALB/c 小鼠，摘除眼球采血，并分離血清作為抗體檢測時的陽性對照血清。同時通過頸脫位致死小鼠， 浸泡于 75%酒精中 5 分鐘，于解剖臺板上固定后掀開左側(cè)腹部皮膚，可看到脾臟，換眼科剪鑷，在超凈臺中用無菌手術(shù)剪剪開腹膜，取出脾臟置于已盛有 10ml 不完全培養(yǎng)基的 平皿中，輕輕洗滌，并細(xì)心剝?nèi)ブ車Y(jié)締組織。將脾臟移入另一盛有 10ml 不完全培養(yǎng)基的平皿中， 用彎頭鑷子或裝在 1ml 注射器上的彎針頭輕輕擠壓脾臟（也可用注射器內(nèi)芯擠壓脾臟） ，使脾細(xì)胞進(jìn) 入平皿中的不完全培養(yǎng)基。用吸管吹打數(shù)次，制成單細(xì)胞懸液。為了除去脾細(xì)胞懸液中的大團(tuán)塊，可 用 200 目銅網(wǎng)過濾。收獲脾細(xì)胞

23、懸液， 1000r/min 離心 5-10 分鐘，用不完全培養(yǎng)基離心洗滌 1-2 次， 然后將細(xì)胞重懸于 10ml 不完全培養(yǎng)基混勻，取上述懸液，加臺酚藍(lán)染液作活細(xì)胞計數(shù)后備用。通常 每只小鼠可得1 X 108-2.5 X 108個脾細(xì)胞，每只大鼠脾臟可得5X 108-10 X 108脾細(xì)胞。 飼養(yǎng)細(xì)胞（ Feeder cells ）的制備在細(xì)胞融合后選擇性培養(yǎng)過程中， 由于大量骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞相繼死亡， 此時單個或少數(shù)分 散的雜交瘤細(xì)胞多半不易存活， 通常必須加入其他活細(xì)胞使之繁殖， 這種被加入的活細(xì)胞稱為飼養(yǎng)細(xì) 胞。飼養(yǎng)細(xì)胞促進(jìn)其他細(xì)胞增殖的機(jī)制尚不明了， 一般認(rèn)為它們可能釋放非種屬特異

24、性的生長刺激因 子，為雜交瘤細(xì)胞提供必要的生長條件；也可能是為了滿足新生雜交瘤細(xì)胞對細(xì)胞密度的依賴性。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有胸腺細(xì)胞、 正常脾細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞。 其中以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的來源及制 備較為方便，且有吞噬清除死亡細(xì)胞及其碎片的作用，因此使用最為普遍。其制備方法如下：按上述采小鼠脾細(xì)胞的方法將小鼠致死、體表消毒和固定后，用消毒剪鑷從后腹掀起腹部皮膚， 暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射 10ml 不完全培養(yǎng)基至腹腔，注意避免穿入腸管。 右手固定注射器，使針頭留置在腹腔內(nèi)，左手持酒精棉球輕輕按摩腹部 1 分鐘，隨后吸出注入的培養(yǎng) 液。 1000r/min 離心 5-10 分鐘，

25、棄上清。先用 5ml HAT 培養(yǎng)基將沉淀細(xì)胞懸浮，根據(jù)細(xì)胞計數(shù)結(jié)果， 54補加HAT培養(yǎng)基，使細(xì)胞濃度為 2 X 10/ml，備用。通常對巨噬細(xì)胞來說，96孔培養(yǎng)板 每孔需2X 10個細(xì)胞， 24 孔板每孔需 105細(xì)胞。每只小鼠可得 3-5X 106個細(xì)胞，因此一只小鼠可供兩塊96 孔板的飼養(yǎng)細(xì)胞。 也可在細(xì)胞融合前 1-2 天制備并培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞， 這樣使培養(yǎng)板孔底先鋪上一層飼養(yǎng)細(xì)胞層。 做法是，將上述細(xì)胞懸液加入96孔板，每孔0.1ml （相當(dāng)于2滴），然后置37C 6% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng) 細(xì)胞融合的程序已報道的有很多種，這里介紹的是作者所在實驗室

26、常用的一種。A、 將1 X 108脾細(xì)胞與2 X 107-5 X 107骨髓瘤細(xì)胞SP2/0-Ag14混合于一支50ml融合管中，補加 不完全培養(yǎng)基至30ml，充分混勻。B、1000r/min 離心 5-10 分鐘，將上清盡量吸凈。C、 在手掌上輕擊融合管底，使沉淀細(xì)胞松散均勻；置40 C水浴中預(yù)熱。D 用1ml吸管在1分鐘左右（最佳時間為 45秒）加預(yù)熱至40C的50%PEG（ PH8.0 ） 1ml，邊 加邊輕輕攪拌。E、 用10ml吸管在90秒內(nèi)加20-30ml預(yù)熱至37 C的不完全培養(yǎng)基；20-37 C靜置10分鐘。F、1000r/min 5 分鐘；棄去上清。G、加入 5ml HAT

27、培養(yǎng)基，輕輕吹吸沉淀細(xì)胞，使其懸浮并混勻，然后補加含腹腔巨噬細(xì)胞的HAT培養(yǎng)基至 80-100ml。H、分裝 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔 0.10-0.15ml ；分裝 24 孔板，每孔 1.0-1.5ml ；然后將培養(yǎng)板 置37C, 6% CO培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。I、5天后用HAT培養(yǎng)基換出1/2培 養(yǎng)基。J、 7-10天后用HT培養(yǎng)基換出HAT培養(yǎng)基；（第14天后可用普通完全培養(yǎng)基）。L、 經(jīng)常觀察雜交瘤細(xì)胞生長情況，待其長至孔底面積 1/10 以上時吸出上清供抗體檢測。3、雜交瘤細(xì)胞篩選雜交瘤細(xì)胞在融合后 2 周左右即可篩選， 即把分泌所需抗體的雜交瘤孔從眾多的孔中選出來，通常也稱為抗體檢測?？?/p>

28、體檢測的方法很多，通常根據(jù)所研究的抗原和實驗室的條件而定。但作為雜交 瘤篩選的抗體檢測方法必須具有快速、準(zhǔn)備、簡便，便于一次處理大量樣品等特點。因為往往有幾百 個樣品需要在短短幾個小時就報告結(jié)果， 以便決定雜交瘤細(xì)胞的取舍。 所以選用抗體檢測方法的原則 是快速、 敏感、 特異、 可靠、 花費小和節(jié)省人力。 一般說來， 在融合之前就必須建立好抗體檢測方法， 并克服可能存在的問題。另一個重要問題是抗體檢測方法所需要的“動力學(xué)范圍”，即檢出背景以上的最強(qiáng)與最弱信號之比， 依所用的檢測抗原是否純凈而定。 如雜交瘤抗體是針對純化的蛋白質(zhì)抗原的， 100%的抗原參與反應(yīng)，一個陽性 / 陰性判別系統(tǒng)就夠了。

29、另一方面，如果雜交瘤抗體是針對細(xì)胞表面 微量的蛋白抗原， 檢測系統(tǒng)可能需要能測出微弱信號， 則動力學(xué)范圍至少應(yīng)為 10：1，最好為 100：1。 另外， 檢測方法的選擇還受所需雜交瘤抗體的類型和預(yù)定的用途的影響。結(jié)合補體的抗體可以用基于細(xì)胞毒性反應(yīng)的檢測方法來選出。如需結(jié)合A蛋白的雜交瘤抗體，就要用結(jié)合蛋白A的檢測方法。下面簡要介紹幾種常用的抗體檢測方法： 免疫酶技術(shù) 免疫酶技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶對底物顯色反應(yīng)的高效催化作用有機(jī)結(jié)合而成的 免疫學(xué)技術(shù)。由于它特異性強(qiáng)，靈敏度高，現(xiàn)已廣泛用于篩選和鑒定單抗。A、器材和試劑a. 包被緩沖液：碳酸鹽緩沖液：取 0.2mol/L Na 2CG

30、 8ml，0.2mol/L NaHCO 3 17ml混合，再加 75ml蒸餾水， 調(diào)PH至9.6。Tris-HCl 緩沖液（ PH8.0， 0.02mol/L ）：取 0.1mol/L Tris 100ml， 0.1mol/L HCl 58.4ml混合，加蒸餾水至 1000ml。b. 洗滌緩沖液（PH7.2 的 PBS： KHPQ 0.2g , KCl 0.2g , NqHPO 12H2O 2.9g , NaCl 8.0g , Tween-20 0.5ml ，加蒸餾水至 1000ml。c. 稀釋液和封閉液：牛血清白蛋白（ BSA 0.1g，加洗滌液至 100ml;或用洗滌液將小牛血清 配成 5

31、-10%使用。d. 酶反應(yīng)終止液（2mol/L H 2SQ）:取蒸餾水178.3ml，滴加濃硫酸（98% 21.7ml。e. 底物緩沖液（PH5.0，磷酸鹽-檸檬酸緩沖液）：取0.2mol/L Na 2HPQ25.7ml , O.1ml/L 檸檬 酸 24.3ml ，再加 50ml 蒸餾水。檸檬酸溶液及配成的底物緩沖液不穩(wěn)定，易形成沉淀，因此 一次不宜配制過多。f. 底物使用液：QPD底物使用液（測 490nm 的 QD值）:QPD 5mg 底物緩沖液 10ml, 3% H2Q 0.15ml 。TMBS或 TMB底物使用液（測 450nm 的 OD值）:TMBS或 TM（1mg/ml） 1.0

32、ml ,底物緩沖液 10ml, 1% H2Q2 25ul 。ABTS底物使用液（測 410nm的OD值）:ABTS 0.5mg，底物緩沖液 1ml, 3% H2Q 2ul。g. 抗體對照：以骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為陰性對照，以免疫鼠血清作為陽性血清。h. 抗原: 可溶性抗原:盡量純化，以獲得高特異性。病毒感染的傳代細(xì)胞或全菌抗原。 淋巴細(xì)胞等懸液。i. 酶標(biāo)抗鼠抗體或酶標(biāo) SPA或其他類似試劑。j. 細(xì)胞固定液：-20 C丙酮；或丙酮-甲醛固定液：NazHPQ100mg KHPQ 500mg蒸餾水150ml, 丙酮225ml，甲醛125ml;或丙酮-甲醛溶液（1;1 ）;或-20 C甲醇。k.

33、聚苯乙烯微孔板： 40 孔、 96 孔、或條孔；硬板或軟板均可使用。l. 酶聯(lián)免疫閱讀儀；或光鏡。m. 吸管、加樣器及水浴箱、離心機(jī)等。B、 可溶性抗原的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）a. 純化抗原用包被液稀釋至 1-20ug/ml 。b. 以50-100UI/孔量加入酶標(biāo)板孔中，置4C過夜或37C吸附2小時。c. 棄去孔內(nèi)的液體，同時用洗滌液洗 3 次，每次 3-5 分鐘，拍干。d. 每孔加200ul封閉液4C過夜或37C封閉2小時；該步驟對于一些抗原，可省略。e. 洗滌液洗3次；此時包被板可-20 C或4C保存?zhèn)溆?。f. 每孔加50-100UI待檢雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，同時設(shè)立陽性、陰性對照

34、和空白對照；37C孵育 1-2 小時；洗滌，拍干。g. 加酶標(biāo)第二抗體，每孔 50-100ul , 37C孵育1-2小時，洗滌，拍干。h. 加底物液，每孔加新鮮配制的底物使用液50-100ul , 37C 10-30分鐘。i. 以2mol/L H 2SQ終止反應(yīng)，在酶聯(lián)免疫閱讀儀上讀取QD直。j. 結(jié)果判定：以P/NM 2.1，或P N+3SD為陽性。若陰性對照孔無色或接近無色，陽性對照孔 明確顯色，則可直接用肉眼觀察結(jié)果。C、全菌抗原的 ELISAa. 新鮮培養(yǎng)的細(xì)菌用蒸餾水或PBS懸浮，并調(diào)整細(xì)菌濃度至1X 108個/ml。必須指出，對于人畜共患病病原體需注意安全操作，最好是滅活處理。b.

35、 每孔中加 100ul 5% 戊二醛溶液（0.1mol/L NaHCO 3 95ml+25%戊二醛溶液 5ml）, 37C作用 2 小時，蒸餾水洗滌 3次；加上述細(xì)菌懸液 50ul/孔；37-56 C烘干；每孔加200ul封閉液4 C 過夜或37 C 2小時封閉。c. 步驟b也可采用先每孔加 50ul細(xì)菌懸液，37C-56 C烘干，然后用-20 C預(yù)冷的無水甲醇室 溫作用15分鐘，蒸餾水洗滌 3次；每孔加200ul封閉液4C過夜或37C 2小時封閉。d. 洗滌液洗3次；此時包被板可在-20 C或4C保存?zhèn)溆?。e. 以下步驟同上法。D、用全細(xì)胞抗原的 ELISAa. 按常規(guī)方法培養(yǎng)細(xì)胞，接種病毒

36、，收獲感染細(xì)胞和未感染細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，用PBS制成適當(dāng)濃度懸液。b. 淋巴細(xì)胞懸液的制備采用新鮮外周血加肝素抗凝后，滴加于淋巴細(xì)胞分離液之上，1500rpm離心 30 分鐘，吸取界面細(xì)胞洗滌二次，即為新鮮淋巴細(xì)胞懸液。該細(xì)胞懸液中若仍混有紅 細(xì)胞，離心后加 0.83%的氯化銨溶液，室溫 10 分鐘，洗滌一次即可。將該細(xì)胞懸液稀釋至 適當(dāng)濃度。c. 每孔加100ul上述a或b的細(xì)胞懸液，使每孔含細(xì)胞5X 104個；1500r/min 15 分鐘，甩去上清；室溫干燥或吹干后用丙酮-甲醇（1: 1） 4C固定10分鐘；可4C或-20 C保存?zhèn)溆?。d. 以下步驟同上法。E、抗體捕捉ELISA試驗本

37、法用抗BALB/c小鼠lg的多克隆抗體捕捉待檢樣品中的McAb再依次加抗原、酶標(biāo)多克隆抗體及底物顯色。該法是常用的ELISA中較理想的一種；其操作步驟如下：a. 以適當(dāng)濃度的純化抗鼠lg抗體包被酶標(biāo)板，每孔加 100ul , 37C 2小時或4C過夜。b. 洗滌、拍干后加待測的 McAb樣品，37C 1-2小時。c. 洗滌后加適量的抗原，37 C 1-2小時。d. 洗滌后加入酶標(biāo)多克隆抗體，37C 1-2小時。洗滌后加底物顯色，判定結(jié)果。F、ABC-ELISA試驗ABC-ELISA是在常規(guī)ELISA原理的基礎(chǔ)上，增加了生物素（ Biot in ）與親和素（Avidi n ）間的放 大作用。 親

38、和素有 4個亞單位組成， 對生物素有高度的親合力。 生物素很易與蛋白質(zhì)共價結(jié)合。 因此， 結(jié)合了酶的親和素與結(jié)合有抗體的生物素發(fā)生反應(yīng)即起到了多極放大作用。其操作步驟如下：a. 已知抗原的包被及加待檢McAb樣品，同間接 ELISA試驗。b. 加生物素化抗鼠Ig抗體，每孔100ul , 37 C 1小時；洗滌。c. 加酶標(biāo)親和素，每孔 100ul , 37 C 30分鐘洗滌；加底物顯色，判定結(jié)果。G、Dot-ELISA 試驗免疫斑點試驗（Dot-ELISA ）是以硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜為固相載體，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的免疫檢測手段。該法采用不溶性底物（如 DAB或4-氯萘酚或AgNO等），其與

39、相應(yīng)標(biāo)記物（HRRAP膠體金）作用形成不溶性產(chǎn)物，呈現(xiàn)斑點狀著色，從而易于判定結(jié)果。根據(jù)所用的標(biāo)記物不同， 可分為HRP免疫斑點試驗、AP免疫斑點試驗和免疫金銀斑點法等。其操作步驟大致如下：a. 將抗原液2-5ul點加于纖維素膜上，室溫 37 C干燥。b. 將纖維膜浸入封閉液中，37C 30分鐘。c. 用洗滌液洗2次，吸干后加待檢 McAb樣品，37C 1小時；用洗滌液振蕩洗滌三次，每次5分鐘，加HRP或AP或膠體金標(biāo)記的抗鼠lg抗體，37C作用30分鐘。d. 同法洗滌，吸干，用新配的相應(yīng)底物溶液顯色，然后水洗終止反應(yīng)，觀察結(jié)果。H、免疫組化染色法該法主要用于檢測針對細(xì)胞抗原成分的McAb常用

40、的方法是間接免疫過氧化物酶試驗（ IIP ,in direct imm un operoxidase）及APAAP技術(shù)。其結(jié)果用光鏡或倒置顯微鏡檢查。 免疫熒光技術(shù) 免疫熒光技術(shù)可用于多種抗原的雜交瘤抗體檢測，如細(xì)胞性抗原（包括細(xì)菌和動物細(xì)胞）、感染細(xì)胞中的病毒抗原和膜抗原等。其操作簡單、敏感性高，可直接觀察抗原定位等優(yōu)點，在McAb的篩選與鑒定上具有重要的應(yīng)用價值。A、器材和試劑a. 供檢測抗體用的抗原制備 固定細(xì)胞片或板，活細(xì)胞懸液。b. PBS（PH7.2， 0.01mol/L ）c. 待檢的McAb樣品。d. 冷丙酮e. FITC （異硫氰酸熒光素）或 TRITC （四甲基異硫氰酸羅丹

41、明熒光素）標(biāo)記的抗鼠 lg抗體等f. 熒光顯微鏡，磁力攪拌器，離心機(jī)，水浴箱等。B、間接免疫熒光法a. 固定細(xì)胞片的制備：生長在蓋片上的細(xì)胞（接種或未接種病毒），可直接收獲蓋片，在 PBS中洗滌，用4 C丙酮固定10分鐘，空氣干燥，置密封容器于-20 C保存?zhèn)溆?；單?xì)胞懸液可在蓋片上制成涂片，固定方法同上。細(xì)胞涂片的制備：將10ul細(xì)菌懸液（1 x 108個/ml ）涂抹7X 21mm蓋片上，自然干燥后，用-20 C丙酮固定10-15分鐘，于-20 C保存?zhèn)溆谩. 蓋片在去離子水中濕潤后置架上滴加 10-20ul 雜交瘤上清或其他待檢樣品； 設(shè)立陽性、 陰性 對照；置37C水浴孵育0.5-1

42、小時。c. 取出蓋片置PBS中用磁力攪拌器洗滌 15分鐘。d. 蓋片置架上，滴加工作濃度的抗鼠lg的熒光抗體10-20ul , 37C孵育0.5-1小時。e 同法洗滌 15分鐘； 取出蓋片， 用延緩熒光碎滅的封載劑 （如緩沖甘油， 9份甘油加 1 份 PBS） 封于干凈載玻片上。f. 光顯微鏡上觀察，陽性結(jié)果可見特異性熒光（ FITC為黃綠色熒光，TRITC為桔紅色熒光）。g. 細(xì)胞固定片的制備，也可改在培養(yǎng)板孔中進(jìn)行，其余步驟同上，在觀察結(jié)果時，將培養(yǎng)板翻 轉(zhuǎn)置于熒光顯微鏡下，判斷標(biāo)準(zhǔn)不變。C、細(xì)胞的膜熒光染色完整的活細(xì)胞的細(xì)胞膜，抗體不能透過。如果細(xì)胞在4C操作，則熒光染色僅限于細(xì)胞膜。必

43、須注意死細(xì)胞常以非特異性方式吸附大量熒光抗體，因此試驗過程中要保證細(xì)胞的高活力?；罴?xì)胞的膜熒光染色大致步驟如下：a. 制備活性較好的細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)濃度至107個/ml。b. 在小試管（5X 50mm中加入100ul細(xì)胞懸液，再加入 100ul待檢McAb的樣品，混勻，4C 作用 30-90 分鐘。c. 用洗滌液（PBS900ml，小牛血清50ml,4%NaN50ml）洗二次，每次加洗滌液 1-5ml , 1000r/min 離心5分鐘，棄上清。加入 100ul熒光抗體，4C作用30-90分鐘。d. 同法洗滌，將細(xì)胞重新懸于 20-30ul 含10%甘油和 10-100ug 苯二胺 /ml 的溶

44、液中；滴加于 載玻片上，加蓋片封載。e. 立即在熒光顯微鏡上檢查。f. 細(xì)胞也可在染色后用 1%多聚甲醛生理鹽水固定，立即檢查，或至少在4 C可保存一周。 間接血凝試驗間接血凝試驗又稱被動血凝試驗（PHA）,是目前應(yīng)用較廣的檢測方法之一。本試驗是以包被可溶性抗原的紅細(xì)胞作為指示系統(tǒng)， 當(dāng)被檢抗體與包被在紅細(xì)胞上的抗原產(chǎn)生特異性反應(yīng)時，導(dǎo)致紅細(xì)胞呈凝集現(xiàn)象?？梢?，該法具有靈敏、快速、容易操作和無需昂貴儀器等優(yōu)點，而且經(jīng)改用醛化紅細(xì)胞 以后，克服原來重復(fù)性差的缺點。A、器材和試劑a. 綿羊抗凝血，或人“ O型抗凝血。b. 緩沖液：PBS（ PH7.2）;醋酸緩沖液。c. 甲醛，丙酮醛，NaN，抗凝

45、劑等。d. 血凝板，振蕩器等。B、多糖抗原的間接血凝試驗a. 甲醛化綿羊紅細(xì)胞的制備：無菌采集綿羊頸靜脈血50ml，用枸櫞酸鈉作抗凝劑；用 5倍于紅細(xì)胞壓積的 PH7.2 PB（ NazHPQ12H2O3.58g , KHPO40.41g , NaCl 8.01g，蒸餾水 1000ml） 充分洗滌 5 次，每次 1500r/min 5-10 分鐘，直至上清測定無蛋白質(zhì)（用飽和硫酸銨滴定上 清，觀察有無白色沉淀） ，再以相同緩沖液配成25%紅細(xì)胞懸液；將 25%紅細(xì)胞懸液與 20%甲醛以2.5 : 1的比例混勻，37C水浴作用2小時，每15分鐘振蕩一次，紅細(xì)胞顏色逐漸 由鮮紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樽厣?；?P

46、H7.2 PBS洗滌4次，每次2000r/min 10分鐘，再以同樣的 PBS 制成 25%紅細(xì)胞懸液； 其后，重復(fù)醛化一次， 方法同前； 最后配成 20%醛化綿羊紅細(xì)胞懸液， 加甲醛至0.3%防腐，4 C保存?zhèn)溆?。b. 脂多糖抗原致敏甲醛化綿羊紅細(xì)胞的制備：取脂多糖（LPS）,以0.2mol/L PH8.0 PB 液，調(diào)整多糖濃度至120ug/ml，然后100C水浴處理1小時；將冷卻至37C的熱處理LPS與6% 醛化紅細(xì)胞等量混合，37 C攪拌作用45分鐘；取出離心2000r/min 10分鐘，以0.01mol/L PH7.2 PBS洗滌4次；配制成4%致敏血球，分裝，保存于 4C備用，或凍

47、干保存。c. McAb的篩選：取待測 McAb樣品25ul，加入V型微量血凝板孔中，同時設(shè)立陰性、陽性對照；再加入 0.5-4%致敏紅血球懸液 25ul，在振蕩器上混勻 30秒；置室溫或 37 C 30-60 分鐘觀察結(jié)果。陰性對照孔應(yīng)呈緊縮的圓點。C、可溶性蛋白抗原的間接血凝試驗a. 紅細(xì)胞醛化：采用雙醛法。采綿羊或人“O型抗凝血，每次加 10倍于紅細(xì)胞壓積的 PBS洗滌 4-6 次，然后配成 8%紅細(xì)胞懸液；向此 8%紅細(xì)胞懸液緩慢加入等量含有3%丙酮醛和3辦醛的PBS于室溫緩慢攪拌17小時；其后洗滌 3次，配成20%雙醛化紅細(xì)胞懸液，加 0.1% NaN3防腐，4C保存?zhèn)溆?。b. 致敏紅

48、細(xì)胞：取 20%雙醛化紅細(xì)胞 0.1ml ， 1500r/min 10 分鐘，棄上清，沉積紅細(xì)胞加 0.2mol/L PH4.0醋酸-醋酸鈉緩沖液1ml，并加最適濃度（應(yīng)預(yù)先測定，蛋白抗原為50ug/ml 左右）的抗原1ml，混勻，于45C致敏30分鐘，有時輕輕搖動，使紅細(xì)胞不下沉。然后離心去上清，并用20倍于紅細(xì)胞壓積的 PBS洗3-4次，最后用PBS配成0.5-1%致敏紅細(xì)胞， 4C保存?zhèn)溆?。c. McAb測定：同上法。 放射免疫測定放射免疫測定是用放射性同位素標(biāo)記抗原或抗體， 以檢測相應(yīng)抗原或抗體的定量方法。 在篩選和 鑒定單抗時常用抗原固相法，即用抗原包被聚乙烯微板，借以檢測樣品中的M

49、cAb其操作步驟如下：a. 用碳酸鹽緩沖液將抗原稀釋至適宜的濃度 （1-100ug/ml ），滴加聚乙烯微板孔內(nèi)， 100ul/ 孔， 4C過夜或37C 2小時。b. 棄去抗原液，每孔加 100UI含0.5-1% BSA的PBS 4C 1-2小時封閉。c. 用BSA-PBS洗滌3次，每次3分鐘。d. 加待檢樣品，每孔100ul，設(shè)立陰性孔、陽性孔和空白孔；37 C 1-2小時，同法洗滌。e. 每孔加125I標(biāo)記的抗鼠lg抗體工作液100ul , 37C 1-2小時，同法洗滌。f. 用丫 -射線閃爍計數(shù)儀分別測定各孔放射性。通常要求樣品孔和陽性對照孔的放射性脈沖分 別超過本底 5倍和 10倍。若

50、以空白孔的放射性為基準(zhǔn)，凡樣品孔與陰性孔放射性之比大于 3 的樣品定為陽性。4、雜交瘤細(xì)胞的克隆化 從原始孔中得到的陽性雜交瘤細(xì)胞， 可能來源于二個或多個雜交瘤細(xì)胞， 因此它們所分泌的抗體 是不同質(zhì)的。為了得到完全同質(zhì)的單克隆抗體，必須對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化。另一方面，雜交瘤細(xì) 胞培養(yǎng)的初期是不穩(wěn)定的，有的細(xì)胞丟失部分染色體，可能喪失產(chǎn)生抗體的能力。為了除去這部分已不再分泌抗體的細(xì)胞，得到分泌抗體穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞系（又稱亞克?。?，也需要克隆化。另 外，長期液氮凍存的雜交瘤細(xì)胞，復(fù)蘇后其分泌抗體的功能仍有可能丟失，因此也應(yīng)作克隆化，以檢 測抗體分泌情況。 通常在得到針對預(yù)定抗原的雜交瘤以

51、后需連續(xù)進(jìn)行 2-3 次克隆化， 有時還需進(jìn)行多 次。所謂克隆化是指使單個細(xì)胞無性繁殖而獲得該細(xì)胞團(tuán)體的整個培養(yǎng)過程?？寺』姆椒ê芏?，如 有限稀釋法、 軟瓊脂法、 單細(xì)胞顯微操作法、 單克隆細(xì)胞集團(tuán)顯微操作法和熒光激活細(xì)胞分類儀（FACS）分離法。這里介紹最簡單也是使用最廣泛的前兩種方法。（1） 有限稀釋法材料：a. 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板等；b. HT 培 養(yǎng)基；c. 活力強(qiáng)的雜交瘤細(xì)胞；d. 小鼠腹腔細(xì)胞。方法：a. 制備小鼠腹腔細(xì)胞。同“細(xì)胞融合”一節(jié)中的方法。b. 制備待克隆的雜交瘤細(xì)胞懸液，用含20%血清的HT培養(yǎng)基稀釋至每毫升含 2.5、15和50個細(xì)胞 3 中不同的稀釋度。C.按每

52、毫升加入5X 104-1 X 105細(xì)胞的比例，在上述雜交瘤細(xì)胞懸液中分別加入腹腔巨噬細(xì)胞。d. 每種雜交瘤細(xì)胞分裝 96孔板一塊，每個稀釋度 32孔，每孔量為0.2ml，每孔的雜交瘤細(xì)胞 數(shù)分別為 0.5、 3和 10。e. 37C、7.5% CQ濕潤培養(yǎng)7-10天，出現(xiàn)肉眼可見的克隆即可檢測抗體；在倒置顯微鏡下觀 察，標(biāo)出只有單個克隆生長的孔，取上清作抗體檢測。f. 取抗體檢測陽性孔的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，并凍存。g. 本法中（b）、（c）、（d）也可簡化為將計數(shù)后的雜交瘤細(xì)胞準(zhǔn)確地進(jìn)行系列稀釋，直至每毫升含 10 個細(xì)胞，按每孔接種 0.1ml 細(xì)胞懸液，即每孔含 1 個細(xì)胞。（ 2） 軟瓊脂法

53、材料：a. HT培養(yǎng)基（雙倍濃度）。b. 用 0.15mol/L NaCl 配制的 2.0%瓊脂糖：稱取 2.0g 細(xì)胞培養(yǎng)用瓊脂糖，懸浮于 100ml0.15mol/L NaCl , 121C高壓滅菌15分鐘，分裝10ml小瓶，冷卻后 4C保存。c. 小鼠腹腔細(xì)胞。d. 滅菌平皿。e. 45 C水浴。f. 活力很好的雜交瘤細(xì)胞。方法：a. 在培養(yǎng)皿中制備飼養(yǎng)細(xì)胞（小鼠腹腔細(xì)胞）單層。b. 臨用前將2.0%瓊脂糖生理鹽水溶液與等量雙倍濃度的HT培養(yǎng)液混勻，配成1%瓊脂糖培養(yǎng)液，45 C水浴中溫育。c. 吸去平皿上層培養(yǎng)液，加入 1%瓊脂糖培養(yǎng)液3ml，室溫10分鐘。d. 取雜交瘤細(xì)胞懸液1ml

54、，加入1%瓊脂糖培養(yǎng)液1ml混勻，鋪于上層。e. 37 C、7.5%濕潤培養(yǎng)7-14天；克隆生長至 2mm時，用毛細(xì)吸管吸出克隆，直接轉(zhuǎn)種于含有 飼養(yǎng)細(xì)胞的 24 孔板，擴(kuò)大培養(yǎng)。f. 吸取上清，檢測抗體，陽性孔可繼續(xù)克隆化，或擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存。5、雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇（1）雜交瘤細(xì)胞的凍存 在建立雜交瘤細(xì)胞的過程中，有時一次融合產(chǎn)生很多“陽性”孔，來不及對所有的雜交瘤細(xì)胞作 進(jìn)一步的工作，需要把其中一部分細(xì)胞凍存起來；另一方面，為了防止實驗室可能發(fā)生的意外事故， 如停電、污染、培養(yǎng)箱的溫度或 CQ控制器失靈等給正在建立中的雜交瘤帶來災(zāi)難，通常盡可能早地 凍存一部分細(xì)胞作為種子，以免遭到不測。

55、在雜交瘤細(xì)胞建立以后，更需要凍存一大批，以備今后隨 時取用。細(xì)胞凍存的原理是細(xì)胞在加血清和二甲基亞砜的培養(yǎng)基中以一定的緩慢速度下降溫度（0 C -20 C,每分鐘下降1C； -20 C -40 C每分鐘下降2C）,可在-196 C液氮或液氮蒸氣中長期保存。 下面介紹我們實驗室的細(xì)胞凍存方法，經(jīng)幾年來對多種細(xì)胞的使用，細(xì)胞復(fù)蘇存活率均在80%以上。A、材料：a. 帶蓋吸管筒一只（鋁質(zhì)或洋鐵皮制） ，內(nèi)壁（包括筒底和蓋）襯 1-2 層石棉紙或石棉布。b. 含10-20%血清、5-10% DMSO勺HT培養(yǎng)基，冰浴降溫至 0C左右（用作凍存液）。c. 滅菌安瓶或帶蓋小瓶。d. -70 C冰箱。e.

56、液氮及液氮罐。f. 處于對數(shù)生長中期、健康而活力好的雜交瘤細(xì)胞。B、方法：a. 將雜交瘤細(xì)胞（或其他細(xì)胞）離心，重新懸浮于預(yù)冷的凍存液中，濃度為106-107左右/ml ,分裝安瓶，每瓶1ml，置冰浴上；安瓶上標(biāo)明細(xì)胞名稱、凍存日期、批號等。b. 安瓶封口后仍置冰浴上。c. 將安瓶放入一帶收口繩的小布袋內(nèi)， 布袋上標(biāo)明凍存號、 細(xì)胞名稱等，立即將布袋放入吸管 筒內(nèi)，置-70 C冰箱。d. 2-4小時后或過夜后從-70 C冰箱取出吸管筒，將盛有細(xì)胞的布袋移入液氮罐；在布袋的線 繩上作好標(biāo)記或代碼；最后在液氮凍存簿上作詳細(xì)記錄。e. 液氮罐應(yīng)定期補充液氮（最好是專人管理） ；補充液氮及存取細(xì)胞時應(yīng)帶保護(hù)眼鏡和手套，以免因液氮凍傷等。（2）雜交瘤細(xì)胞的復(fù)蘇雜交瘤細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞或其他細(xì)胞在液氮中保存，若無意外情況時，可保存數(shù)年至數(shù)十年。復(fù)蘇時融解細(xì)胞速度要快，使之迅速通過最易受損的-5 C 0C,以防細(xì)胞內(nèi)形成冰晶引起細(xì)胞死亡。通常情況下， 凍存時細(xì)胞數(shù)量多， 生長狀態(tài)好的雜交瘤細(xì)胞系以及其他細(xì)胞的復(fù)蘇可采用以下方法，這也是各個實驗室普遍采用的程序。即復(fù)蘇時，從液氮中取出安瓶，立即在37 C水浴融化，待最后一點冰塊快要融化時，從水浴中取出，置冰浴上。用5-10ml HT 培養(yǎng)基稀釋， 1000r/min 10 分鐘，棄上清，再懸浮于適量HT培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶或 24孔