尿液中囊泡的提取和鑒定概要

1、尿液中 exosome 的提取和鑒定exosome的提取一） 實驗準(zhǔn)備1. 試劑： Sigma P2714，三乙醇胺， NaOH ，蔗糖，去離子水 耗材：超速離心管 50mL ，15mL2. 配制 Isolation solution 50 mL1. 10 mM Triethanolamine (三乙醇胺) ( MW 185.7 )0.093 g2. 250 mM Sucrose(蔗糖)(MW 342.3 )4.28 g3. 加去離子水至45 mL4. 1 M NaOH 調(diào) pH 至 7.6 220 L5. 加去離子水至50mL6. 加 protease inhibitors day of i

2、solation3. 3. 5 SDS-Laemmli for Western Blot 50 mL1. SDS3.75g2. Glycerol15 mL3. 1 M Tris-HCl，pH 6.82.5 mL4. Bromophenol溴酚藍(lán)dab5. DTT60 mg/mL6. 去離子水至50 mL二) 實驗步驟 (Pisitkun 2004; Gonzales, Zhou et al. 2010)1. 將 80凍存的尿液取出解凍，渦旋，分裝在50mL離心管中。2. 從-20 中取出 Sigma P2714 蛋白酶抑制劑，加入 5mL二次水混勻。3. 每 50mL尿液中加入 625 L 溶

3、解后的蛋白酶抑制劑（ 12.5 L/mL Urine ）。4. 于 4， 17000 g 離心 15 min。（新鮮尿液 25離心） （超速離心機型號 Hitachi CP 80MX）5. 取上清液置于超速離心管中，裝 3 管，每管分裝 8mL， 4 200 000 g 離心 1 h 。（同 上新鮮尿液 25）6. 離心后棄上清，再取 17000 g 上清各 8mL分置 3 管中，同上述條件離心。7. 棄上清， 3 管中各加 50 L isolation solution ，渦旋混勻 30 s，轉(zhuǎn)移到一個 1.5 mL Eppendrof 離心管中。8. 加 1 mL 200 mg/mL DT

4、T 95 孵育 2 min 。9. 將上述溶液轉(zhuǎn)移至高速離心管中，并加入8 mL isolation solution 17000 g 超高速離心 10min 。10. 棄上清，加 50 L isolation solution溶解沉淀物，在 17 000 g 離心 15 min 。 取上清做 1D SDS/PAGE.11. Bradford 法測蛋白總濃度。12. 按 1:4 體積比加入 5 SDS-Laemmli 緩沖液(含 60 mg/mL DTT )，渦旋混勻。13.60 加熱 10 min ， -80 保存。( for western blot )朱墨桃?guī)熃闾崛?exosome 方法

5、 (Zhu, Li et al. 2012)1. 2,000 g for 10 min at 4C ，除去死細(xì)胞；2. 取上清， 4 C 10,000 g 離心 30 min ，除去細(xì)胞碎片；3. 取上清， 4 C 110,000 g 離心 70 min ，棄上清；4. PBS 清洗并重新分散， -80 C保存。5. microbicinchoninic acid assay (Applygen Technologies Inc, China)測定蛋白含量。負(fù)染電鏡分析（一）實驗準(zhǔn)備4%p araformaldehyde 多聚甲醛（in PBS，pH 7.4 ），1 %U ranyl acet

6、ate 乙酸雙氧鈾 in dd-H2O， 石蠟?zāi)ぃ?200 目鎳網(wǎng)（二）實驗步驟1. 將 20L exosomes 小體懸樣與 4% 多聚甲醛（ in PBS ，pH 7.4 ）1： 1混勻。2. 取 10L混合物滴于石蠟?zāi)ど希瑢?200 目鎳網(wǎng)置于液滴中懸浮 10min。3. 用毛邊濾紙從側(cè)面吸干多余液體。4. 在 20L PBS液滴中懸浮 5min，重復(fù)。5. 在 20 L 去離子水液滴中懸浮 5min，重復(fù)。6. 1% 乙酸雙氧鈾負(fù)染液負(fù)染 1 min ，用毛邊濾紙從側(cè)面吸干多余液體。7. 將鎳網(wǎng)正面朝上置于濾紙上，在有蓋的玻璃皿中干燥15min 。8. 樣品準(zhǔn)備完畢，進(jìn)行 EM分析。三

7、、 1D SDS-PAGE一）實驗準(zhǔn)備儲存液配制：1）2 M Tris-HCl2）100 g/L SDS 溶液3）75%（v/v ）甘油4）10 g/L 溴酚藍(lán)溶液 電泳工作液配制：1）Acr-Bis 液2）4分離膠緩沖液3）100 g/L 過硫酸銨溶液4）TEMED成 品液5）5樣品緩沖液6）10電泳緩沖液12% 電泳膠的配制考馬斯亮藍(lán)染色液和脫色液（二）實驗步驟1. 制膠 裝好灌膠器， 在分別在兩個潔凈小燒杯 （離心管也可） 內(nèi)配制分離膠和濃縮膠混 合液（注意灌膠時再加 AP 和 TEMED），配方見 SDS-PAGE溶液配制及具體流程 。以槍頭攪 拌約 10-20 sec ，灌膠分離膠。

8、在膠面上小心地鋪上幾毫米厚的水層，然后常溫凝固 30 min （膠面與水層間界面清晰說明膠已凝好） 。此時倒出水層，濃縮膠混合液加入AP和 TEMED，槍頭攪拌均勻，加入灌膠器，上覆水層，然后插入梳子，凝固2h。2. 上樣跑膠 打開固定玻璃板的塑料夾， 取出梳子， 取下膠板裝入電泳槽， 在電泳槽中加 入電泳緩沖液， 上槽灌滿，下槽電泳緩沖液的量根據(jù)電泳膠數(shù)目參照電泳槽上的刻度線確定。 根據(jù)蛋白定量結(jié)果，每條泳道上樣量在 15 g左右。 2樣品緩沖液與樣品 1：1混合，上 樣體積一般為 15-20 L，插入上樣梳上樣。電泳條件： step 1: 80V 5min,step 2: 150V 2h,

9、 注意觀察溴酚藍(lán)的位置，一般半小時左右完成。3. 染色及脫色 關(guān)閉電源，取出電泳后的膠板，用刮膠板小心撬開玻璃板將膠取下（不可 用蠻力，用二次水潤濕比較容易取下來） ，置于帶蓋的玻璃皿中，加入染色液（以剛沒過凝 膠即可），于微波爐加熱約 40-70 sec 至染色液微沸（注意蓋子不要蓋的太緊以防染色液爆 沸噴濺），然后于脫色搖床上繼續(xù)染色約 10 min。染色液請倒入專用的回收容器內(nèi)。淋洗凝 膠沖去剩余染料，然后倒入適量的脫色液，微波加熱至微沸后于搖床上脫色約 10 min ，重 新?lián)Q上脫色液室溫?fù)u床脫色至完全去除背景色。4. 掃描及后處理 脫色后的凝膠置于掃描儀上掃描凝膠圖像并保存， 不立即

10、酶解的凝膠在 二次水中 4冰箱保存。 （盡快處理，防止蛋白擴散和變質(zhì)）四、 1D SDS-PAGE蛋白質(zhì)條帶膠內(nèi)酶解一）實驗準(zhǔn)備脫色及脫水1. 25 mM NH 4HCO 3100 mg NH 4HCO3，50 mL dd H2O2. 25 mM NH 4HCO 3/50 % ACN100 mg NH 4HCO 3，25 mL ACN ，25 mL dd H2O3. Stock Solution ： 1 %甲酸990 L dd H2O，10 L甲酸4. 0.1 %甲酸100 L Stock solution ，900 L dd H2O還原和烷基化5. 10 mM DTT1.5 mg DTT/2

11、5 mM NH 4HCO 36. 55 mM 碘乙酰胺10 mg 碘乙酰胺 / 25 mM NH 4HCO 3胰酶消化7. Trypsin ( Promega V5113 )12.5 ng trypsin/25 mM NH 4HCO 3提取肽段8. 50 % ACN/0.5 甲酸500 L stock solution ，500 L ACN質(zhì)譜準(zhǔn)備9. Millipore ZipTip C18 Pipette Tips ?10. Stock solution ： 1% 甲酸11. Equilibration and washing ： 0.1 % 甲酸12. Wetting and eluti

12、on ：50 % ACN/0.1 % 甲酸 100 L stock solution ，500 L ACN, 400 L dd H2O二）實驗步驟1. 將膠條用手術(shù)刀片或保險刀片按順序切下，每條帶約 1.5 mm3 大小， 7 cm 膠條約切 12 15 條；2. 將膠條切成 1-2 mm2的小塊，置于 1.5 mL EP 管中，記錄條帶號及相應(yīng)的位置；3. 用 200 L MilliQ 超純水振蕩清洗 5 min ，重復(fù)一次；4. 脫色（1）加入 100 L 25 mM NH 4HCO 3/50 % ACN，渦旋并孵育 10 min, 吸干上清；（2）重復(fù)（ 1）至藍(lán)色褪去，膠粒萎縮變白；（

13、3）真空干燥膠粒至全干（ 20min ）。5. 還原烷基化（1）向干膠粒中加入 50 L 10 mM DTT/25 mM NH 4HCO 3，渦旋。 56還原反 應(yīng) 1 h ，冷至室溫；（2）棄掉上清，立即加入 50 L 55 mM碘乙酰胺，渦旋后避光室溫反應(yīng) 45 min；（3）棄掉上清，加入 100 L 25 mM NH 4HCO 3 渦旋并孵育 10 min 清洗膠粒；（4）棄掉上清， 100 L 25 mM NH 4HCO 3/50 % ACN 渦旋并孵育 10 min 以脫去 膠粒中的水分，重復(fù) 1 次；（5）真空干燥膠粒至全干（ 20min ）。6. 膠內(nèi)酶解（1）加入 3 倍于膠

14、粒的酶解液冰浴 30 min（ 或放 4冰箱 ） ，使膠粒復(fù)水；（2）除去過量的 Trypsin 溶液后，用 50 L 25 mM NH 4HCO3清洗膠粒幾次， 最后用 50 L 25 mM NH 4HCO 3覆蓋膠粒；（3）渦旋， 37反應(yīng)過夜。7. 提取肽段（1）將酶解后上清液轉(zhuǎn)移至 1.5 mL 離心管中；（2）向膠粒中加入 30 L 50 % 乙腈/0.1 %甲酸，渦旋孵育 30min，并超聲 5 min；（3）吸取上清與第一次的上清合并；（4）重復(fù)步驟（ 2）（ 3）；（5）渦旋后冷凍濃縮至 5-10 L（30min）。加入 0.1 %甲酸 15 L，渦旋。五、 質(zhì)譜鑒定1. Zi

15、pTip Protocol？（1）將 50L 樣品加入到96 孔板，每個樣品一個孔；（2）將 20 L elution solution加入到干凈的離心管中，每個樣品一個；（3）Wetting ZipTip ：吸10 L wetting solution 入針尖，打出，重復(fù)操作；（4）Equilibrate ZipTip：吸10 L 平衡液 ，打出，重復(fù)操作；（ 5） Binding ：來回吸、打樣品 10 次；（ 6） Washing：吸 washing solution ，打掉；重復(fù) 2 次；2. Elution ：將離心管中 20 L elution solution吸打 10 次，不要

16、引入空氣；3. 將樣品濃縮至 5 L加入 15 L 0.1 % 甲酸，混勻后進(jìn)樣；4. 根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果搜庫。六、 IEF/SDS-PAGE雙向電泳一）第一向等電聚焦（ 7cm膠條， pH 3-10）1. 從冰箱中取 -20 冷凍保存的水化上樣緩沖液 （I （）不含 DTT，不含 Bio-Lyte ）一小管（ 1mL/ 管），置室溫溶解。2. 在小管中加入 0.01g DTT ， Bio-Lyte 4/6 、5/7 各 2.5 L，充分混勻。3. 從小管中取出 200L水化上樣緩沖液，加入 50L 樣品，充分混勻。4. 從冰箱取 -20 冷凍保存的 IPG預(yù)制膠條（ 7cm pH 3-10 ），于

17、室溫放置 10 分鐘。5. 沿著聚焦盤或水化盤中槽的邊緣至左而右線性加入樣品 （7cm 膠條一般加 125-250 L，10-100 g） 。在槽兩端各 1cm左右不要加樣，中間的樣品液一定要連貫。注意：不要產(chǎn)生氣泡。否則影響到膠條中蛋白質(zhì)的分布。6. 當(dāng)所有的蛋白質(zhì)樣品都已經(jīng)加入到聚焦盤或水化盤中后，用鑷子輕輕的去除預(yù)制 IPG 膠 條上的保護層。7. 分清膠條的正負(fù)極，輕輕地將 IPG 膠條膠面朝下置于聚焦盤或水化盤中樣品溶液上，使 得膠條的正極（標(biāo)有 +）對應(yīng)于聚焦盤的正極。確保膠條與電極緊密接觸。不要使樣品溶液 弄到膠條背面的塑料支撐膜上， 因為這些溶液不會被膠條吸收。 同樣還要注意不

18、使膠條下面 的溶液產(chǎn)生氣泡。如果已經(jīng)產(chǎn)生氣泡，用鑷子輕輕地提起膠條的一端， 上下移動膠條， 直到 氣泡被趕到膠條以外。8. 在每根膠條上覆蓋 1.5 mL礦物油，防止膠條水化過程中液體的蒸發(fā)。需緩慢的加入礦物 油，沿著膠條，使礦物油一滴一滴慢慢加在塑料支撐膜上。9. 對好正、負(fù)極，蓋上蓋子。設(shè)置等電聚焦程序。7cm膠條水化12 小時（ 18）主動水化（ 50V）或被動水化S050V rapid12h水化（若被動水化，此步省卻）S1250Vlinear30min除鹽S2500Vrapid30min除鹽S34000Vlinear3h升壓S44000Vrapid20,000Vhr聚焦S5500Vra

19、pid99h保持10. 聚焦結(jié)束的膠條應(yīng)立即進(jìn)行平衡、第二向 SDS-PAGE電泳，否則將膠條置于樣品水化盤中，-20 冰箱保存。（二）第二向 SDS-PAGE 電泳1. 配制 12%的丙烯酰胺凝膠兩塊。配 12mL 凝膠溶液，每塊凝膠 6mL，將溶液分別注入玻璃 板夾層中，上部留 1cm 的空間，用 MilliQ 水封面，保持膠面平整。聚合 30 分鐘。一般凝膠與上方液體分層后，表明凝膠已基本聚合。2. 待凝膠凝固后，倒去分離膠表面的 MilliQ 水，用 MilliQ 水沖洗。3. 從-20 冰箱中取出的膠條，先于室溫放置 10分鐘，使其溶解。4. 配制膠條平衡緩沖液 I 。5在桌上先放置

20、干的厚濾紙，聚焦好的膠條膠面朝上放在干的厚濾紙上。將另一份厚濾紙 用 MilliQ 水浸濕，擠去多余水分，然后直接置于膠條上，輕輕吸干膠條上的礦物油及多余 樣品。這可以減少凝膠染色時出現(xiàn)的縱條紋。2.5mL 膠條平衡緩沖液I 。并用濾紙吸取6. 將膠條轉(zhuǎn)移至溶漲盤中，每個槽一根膠條，在有膠條的槽中加入I 。將樣品水化盤放在水平搖床上緩慢搖晃15 分鐘。7. 配制膠條平衡緩沖液 II 。8. 第一次平衡結(jié)束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液 多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面） 。再加入膠條平衡緩沖 液 II ，繼續(xù)在水平搖床上緩慢搖晃 15 分鐘。9. 用濾

21、紙吸去 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠上方玻璃板間多余的液體。 將處理好的第二向凝膠 放在桌面上，長玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝膠的頂部對著自己。10. 將瓊脂糖封膠液進(jìn)行加熱溶解。11. 將 10電泳緩沖液，用量筒稀釋 10倍，成 1電泳緩沖液。趕去緩沖液表面的氣泡。12. 第二次平衡結(jié)束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液II 。并用濾紙吸取多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面） 。13. 將 IPG 膠條從樣品水化盤中移出，用鑷子夾住膠條的一端使膠面完全浸末在1電泳緩沖液中。然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長玻璃板上。其余膠條同樣操作。14. 將放有膠條的 S

22、DS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上， 短玻璃板一面對著自己。 在凝膠的上方加 入低熔點瓊脂糖封膠液。15. 用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完 全接觸。注意不要在膠條下方產(chǎn)生任何氣泡。 在用鑷子、 壓舌板或平頭針頭推膠條時， 要注 意是推動凝膠背面的支撐膜，不要碰到膠面。16. 放置 5分鐘，使低熔點瓊脂糖封膠液徹底凝固。17. 在低熔點瓊脂糖封膠液完全凝固后。將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中。18. 在電泳槽加入電泳緩沖液后， 接通電源，起始時用的低電流 （ 5mA/gel/17cm ）或低電壓， 待樣品在完全走出 IPG膠條，濃縮成一條線后， 再加大電流 （或電

23、壓）（20-30mA/gel/17cm ）， 待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時即可停止電泳。19. 電泳結(jié)束后， 輕輕撬開兩層玻璃， 取出凝膠， 并切角以作記號 （戴手套， 防止污染膠面） 。20. 進(jìn)行染色（按照伯樂染色試劑盒上的操作步驟）Bradford 法測蛋白總濃度檢測原理 : Bradford 與蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu) , 特殊氨基酸結(jié)合 , 由棕色變成藍(lán)色 ,595nm 檢測。該 方法用于大多數(shù)蛋白質(zhì)的定量是比較精確的 , 但不使用于小分子堿性多肽的定量 , 如核糖核 酸酶或溶菌酶 , 去污劑的濃度超過 0.2%影響測定結(jié)果 , 如 TritonX-100,SDS,NP-40 等 Bradford 法濃染液的配制 : 將 100mg考馬斯亮藍(lán) G-250溶于 50m