免疫組化試驗(yàn)步驟

1、免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟 Revised final draft November 26, 2020 石蠟切片免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟 石蠟切片步驟按照曉峰整理的步驟進(jìn)行（From徐曉峰、朱老師的“石蠟切片”方 案）： 1）材料的準(zhǔn)備 在本實(shí)驗(yàn)室條件下推薦使用FAA （50%ethanol, 5%aceticacid, 3. 7%甲醛）固定 材料。 FAA固定液（100ml）,室溫保存： 無(wú)水乙醇50ml 冰醋酸5ml 37% 甲醛 10ml 水 35ml 第一天：組織固定 用FAA固定，詳見(jiàn)“石蠟切片” protocol。 第二天：脫水 Solution time numberofchanges 50%et

2、hanol? 60minutes one 60%ethanol? 60minutes one *70%ethanol? 60minutes one 以上所有步驟中每換好一步乙醇均置于4C冰箱等待，并不時(shí)輕搖。 *組織可在70%ethanol4C可存放幾個(gè)月 第三天：進(jìn)一步脫水和浸蠟 以下所有步驟在4C進(jìn)行并不時(shí)輕搖 Solution time numberof change s 85%ethanol 60minutes one 95%ethanol 60minutes one 以下所有步驟在室溫進(jìn)行并不時(shí)輕搖 Solution time numberofchanges 100%ethanol?

3、 30minutes two 100%ethanol? 60minutes two 25%二甲苯,75%ethanol? 30minutes one 50%二甲苯，50%ethanol? 30minutes one 75%二甲苯，25%ethanol+番紅 30minutes one 100%二甲苯 60minutes two 100%二甲苯 +1/4volumeParaplastPlus(paraffin)chips overnight (不要搖動(dòng)) 準(zhǔn)備工作：60C預(yù)熱plus蠟片(ParaplastPlus)石蠟可反復(fù)融凝而去氣泡 第四天：浸蠟2 將材料置于42C直至蠟塊完全熔化。再加1

4、/4體積的蠟塊至完全熔化后移至 60Co幾個(gè)小時(shí)后換上新鮮熔好的蠟液，過(guò)夜。 第五天：浸蠟3 換蠟兩次(Parap las tPl us ) 第六天：浸蠟4 換蠟兩次(Parap las tPl us ) 第七天：浸蠟5 換蠟兩次(ParaplastPlus) 準(zhǔn)備工作：60C預(yù)熱 Regular 蠟片(ParaplastRegular) 第八天：包埋（包埋塊可長(zhǎng)久保存） 第九天及之后： 開(kāi)始切片，切片應(yīng)包括自己的片子及正負(fù)對(duì)照等。事先打開(kāi)烘片機(jī)至37度，在涂 有多聚賴氨酸的玻片上加廣2ml的蒸鐳水。切好的片子輕至于加水的玻片上。待所 有片子準(zhǔn)備完之后蓋上蓋子，烘片過(guò)夜。 用自來(lái)水及雙蒸水清洗

5、免疫組化專用塑料，放在烘箱烘干待用。 第二天：開(kāi)始脫蠟（From徐曉峰、朱老師整理的“石蠟切片” protocol） Solution time numberofchanges 100%二甲苯 lOminutes two 100%ethanol l-2minutes two 95%ethanol l-2minutes one 90%ethanol l-2minutes one 80%ethanol l-2minutes one 60%ethanol l-2minutes one 30%ethanol l-2minutes one water l-2minutes one PBS (PH=7.

6、4) Sminutes one PBS (PH=7. 4) Sminutes one （用新買(mǎi)來(lái)的免疫組化塑料小盒，每一步只需加入試劑220250毫升） 抗原修復(fù)： 在切片還浸入酒精時(shí)，可以事先將煮鍋清洗干凈，用蒸飾水洗廣2遍，最后加入 0.01M檸檬酸鈉緩沖液（PH二6.0）,煮沸（保持在95度左右），將過(guò)完P(guān)BS的片子讓入 煮沸的鍋中，煮片1015mino然后將電磁爐關(guān)閉，自然冷卻鍋中切片（千萬(wàn)不要把 片子拿出來(lái)，放在緩沖液中一起自然冷卻至室溫！ ！ ?。?將片子浸入 PBS (PH=7. 4) 5mino 重復(fù)一遍。 封閉： 在抗原修復(fù)時(shí)可以事先配制封閉液，用PBS (PH=7.4)配制

7、3%BSA的封閉液。 將PBS中的切片放入封閉液中，室溫放置30分鐘、1小時(shí)。 雜一抗： 在封閉時(shí)可先剪好與切片大小相當(dāng)?shù)姆饪谀ぃ?zhǔn)備加有少量水的塑料大盒，用衛(wèi) 生紙墊在塑料大盒中附帶的塑料板上。用封閉液稀釋一抗(GFP兔多抗以1:100稀 釋，其它一抗需要另外嘗試)。將稀釋完的一抗加在片子上，每張片子保證不少于 lOOul,用封口膜封上，檢查是否有汽泡，輕輕趕走氣泡。將片子放在塑料大盒 中，蓋上塑料蓋子，放入冰庫(kù)過(guò)夜。 雜二抗： 事先配制好TBS(PH=7. 4)緩沖液，用TBS (PH=7.4)緩沖液稀釋帶有堿性磷酸酶(AP) 標(biāo)記的抗兔二抗，比例為l：200o將塑料大盒從冰庫(kù)中拿出，浸

8、入TBS (PH二7.4) 緩沖液中洗一抗，5min,重復(fù)3次，在洗一抗的過(guò)程中準(zhǔn)備封口膜。將片子上的殘 余緩沖液倒去(但片子必須保持濕潤(rùn)！ ！)每張片子加不少于lOOul的二抗稀釋 液，蓋上封口膜，放入塑料大盒中，室溫放置ri.s小時(shí)。 洗二抗并顯色 用TBS (PH=7. 4)緩沖液洗二抗，5min,重復(fù)3次。同時(shí)在暗處配制顯色液(40ul溶 液A+40U1溶液B+720U1水，可根據(jù)實(shí)際切片數(shù)量按比例配制顯色液)，剪切封口 膜。 將片子至于暗處，倒去緩沖液，每張片子加不少于lOOul的顯色液，輕輕蓋上封 口膜，放于暗處進(jìn)行顯色。每隔15分鐘左右看一下片子是否開(kāi)始顯色(根據(jù)經(jīng)驗(yàn)， 加入顯色液30minl小時(shí)會(huì)開(kāi)始顯色,但是需要根據(jù)不同蛋白表達(dá)強(qiáng)弱，把握顯色 時(shí)間)。發(fā)現(xiàn)顯色之后需加蒸鐳水終止反應(yīng)，再蓋上蓋玻片進(jìn)行觀察并拍照。 試劑: 1. 0. 01MPBS （PH二7. 4）: 購(gòu)買(mǎi)的小包裝粉末，溶于1L水中，待粉末溶解后調(diào)PH值至7. 4。 2. TBS: 2. 4gTris, 8. SgXaCl