激活素A和卵泡抑素對凍融人胎兒卵巢雌二醇分泌的影響匯總

1、激活素 A 和卵泡抑素對凍融人胎兒卵巢雌二醇分泌 的影響【關(guān)鍵詞】激活素A;卵泡抑素；胎兒；卵巢；雌二醇Abstract:Objective:To investigate the effect of Activin A-follistatin on steroidogenesis of frozen-thawed human fetal ovary in vitro. Methods: The frozen-thawed fetal ovarian tissue was cultured individually in minimal essential medium (MEM) for 8

2、days. Under the experimental conditions, the medium was supplemented with either Activin-A (Act A group) or follistatin (FS group) or the combinations of Activin-A and follistatin (A+F group). The concentration of E2 in cultured medium was detected with immunoluminescence method. Results: The levels

3、 of E2 at 4th day, 6th day and 8th day were higher than that at 2nd day (P0.05), The secretion of E2 increased at first, then decreased with the highest level at 6th day. The level of E2 of Act A group was significantly greater than that of the control group, FS group and A+F group (P0.01). Conclusi

4、on: Frozen-thawed human fetal ovary can excrete estrodiol under the condition of tissue culture. Act A can increase the excretion of estrodiol in cultivated ovarian tissue, and the effection of Act A can be suppressed by FS.Key words:activin A; follistatin; fetal; ovarian tissue;estrodiol近年來發(fā)現(xiàn)的一組性腺起

5、源的細(xì)胞因子 - 激活素 (Activins) ，對卵泡發(fā) 育有著重要的局部調(diào)節(jié)作用，尤其是激活素 A(Activin A ，Act A) 。盡管有較 多的研究表明了激活素對不同動物卵泡發(fā)育的影響 1-3 ，但對人胎兒卵巢內(nèi)卵 泡發(fā)育的影響尚未見報(bào)道。本研究以胎兒卵巢為研究對象，比較 Act A 和卵泡 抑素(FS)在體外組織培養(yǎng)條件下對凍融人胎兒卵巢E2分泌的影響，探討其在人卵泡發(fā)生過程中可能的調(diào)節(jié)作用。1 材料和方法1.1 標(biāo)本 卵巢組織取自因計(jì)劃生育或醫(yī)療原因需行藥物引產(chǎn)(利 凡諾米菲司酮)的 32 周胎兒(溫州醫(yī)學(xué)院教學(xué)醫(yī)院分娩室提供)共 3 例，于 引產(chǎn)后 2 h 內(nèi)無菌條件下取材，

6、置于預(yù)冷的 Leiboviz-15(L-15 ，美國 sigma 公 司產(chǎn)品)基礎(chǔ)培養(yǎng)液中待用。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)。1.2 試劑和儀器 基礎(chǔ)培養(yǎng)液為MEM培養(yǎng)液(購自GIBCO公司)，含5%小牛血清， 100 U/ml 的 FSH, 100 IU/ml 青霉素和 100 IU/ml 鏈霉素， 1/100 ITS(胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒，insulin-transferrin-selenium), pH 7.0 7.2。Act A、FSH FS均為Sigma公司產(chǎn)品。E2測定采用美國貝克曼庫而特公司 BXI800 儀器及試劑。1.2 實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 冷凍及復(fù)蘇 : 將胎兒卵巢組織去除髓

7、質(zhì)及周圍結(jié)締組織后，切 成5 mnrK5 mnrK 1 mm大小，放入裝有冷凍保護(hù)劑 1.5 mol/L 丙二醇（PROH的 冷凍管中，按照 Oktay4 提出的慢凍速融法處理。1.2.2 體外培養(yǎng)及分組：凍融卵巢皮質(zhì)塊切成2 mnrK 2 mnrK 1 mm大 小，隨機(jī)放入加有0.8 ml培養(yǎng)液的24孔培養(yǎng)板內(nèi)，37 C、5%CO培養(yǎng)箱內(nèi)培 養(yǎng)，隔天半量換液，共培養(yǎng) 8 d。實(shí)驗(yàn)共分四組：MEMfi（ Minimum Essential Medium 基礎(chǔ)培養(yǎng)液）即對照組、 Act A組（基礎(chǔ)培養(yǎng)液+100 ng/ml ActA）、FS組（基礎(chǔ)培養(yǎng)液+100 ng/ml FS ）和A+F組（

8、基礎(chǔ)培養(yǎng)液+100 ng/ml Act A+100 ng/ml FS ）；每組 4 塊組織。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。1.2.3 E2 的測定： 收集培養(yǎng) 2 d、 4 d、 6 d、 8 d 的培養(yǎng)液，采用免 疫發(fā)光法，按美國貝克曼庫而特公司 BXI800儀器及試劑說明測定E2的含量。 質(zhì)控符合要求,批內(nèi)變異系數(shù)10%，批間變異系數(shù) 15%。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用重復(fù)測量資料方差分析進(jìn)行比較，采用 Dunnet 進(jìn)行兩兩比較。2 結(jié)果所有培養(yǎng)組的卵巢組織，培養(yǎng)4 d、6 d、8 d分泌的E2值均高于2 d 值，差異有顯著性（均Pv 0.05），總體呈先增加后減少改變，在培養(yǎng)后 6 d 可達(dá)

9、較高水平；Act A組E2分泌量明顯高于對照組、FS組和A+F組，差異有顯 著性（均 Pv0.01 ），詳見表 1。3 討論3.1 胎兒卵巢組織體外培養(yǎng)條件下能分泌 E2 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胎 兒卵巢組織在體外培養(yǎng)條件下能產(chǎn)生 E2。目前，國內(nèi)外對卵巢組織體外培養(yǎng)的 最佳時(shí)間尚無定論，除鼠卵巢組織外，其他哺乳動物的卵巢組織即使體外培養(yǎng) 20 d，組織內(nèi)的初級卵泡也不能發(fā)育到次級卵泡階段5。本研究中E2分泌量隨培養(yǎng)時(shí)間延長先增加后減少，在培養(yǎng)后 6 d 可達(dá)較高水平，這是否提示人胎 兒卵巢組織的體外最佳培養(yǎng)時(shí)間為 6 d 尚有待進(jìn)一步研究。3.2 Act A和FS對卵巢組織E2分泌的影響 Act

10、A是最早在性腺發(fā)現(xiàn)的糖 蛋白激素，屬于轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor ，TGF）B超家族 成員。 1986年首次從豬的卵泡液中分離、純化，根據(jù)其具有特異性地促進(jìn)垂體 細(xì)胞分泌、合成卵泡刺激素（Follicle stimulating Hormone，F(xiàn)SH的生物學(xué)活性而得名 6 ，主要以旁分泌和自分泌途徑發(fā)揮生物活性。目前的研究認(rèn)為， Act A 是一種調(diào)節(jié)組織細(xì)胞功能的基本介質(zhì)，具有廣泛的生物學(xué)活性，參與調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的增殖和分化、類固醇激素的產(chǎn)生 7 ，支持卵泡生長并抑制卵泡閉 鎖 8 。近年來， 在人卵泡顆粒細(xì)胞上也發(fā)現(xiàn)了 Act A 的受體 9 。本研

11、究結(jié) 果顯示， Act A 對卵巢組織類固醇激素的分泌有促進(jìn)作用， Act A 處理組的 E2 分泌量較對照組明顯增加。其促進(jìn) E2分泌的機(jī)制可能為，Act A誘導(dǎo)卵泡顆粒 細(xì)胞形態(tài)變化，并通過增加顆粒細(xì)胞上 FSH的受體水平及結(jié)合位點(diǎn)，使 FSH的 生理作用增強(qiáng)10，后者能刺激芳香化酶活性，增加 E2的生成。FS是一種主要由多種垂體細(xì)胞和卵巢顆粒細(xì)胞分泌的單聚體糖蛋白，1987年首次從牛卵泡液中提取出來，能抑制 FSH分泌。在本實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)S組與對 照組相比，E2分泌量無明顯差異，說明FS單獨(dú)使用未對卵巢E2的分泌產(chǎn)生影 響。FS在結(jié)構(gòu)上與Act A無關(guān)聯(lián)，但可通過與 Act A的不可逆結(jié)合，

12、間接 抑制顆粒細(xì)胞芳香化酶的活性、抑制垂體FSH分泌并下調(diào)未分化顆粒細(xì)胞FSH受體的表達(dá)，拮抗Act A對卵泡的作用11。在對羊FS表達(dá)的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)S 蛋白存在于羊原始卵泡的卵母細(xì)胞和初級、次級卵泡的卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞 中，但mRN敘在次級卵泡的顆粒細(xì)胞中檢測到，因?yàn)镕s結(jié)合并中和了Act12，這說明在早期卵泡發(fā)育中，F(xiàn)S可能調(diào)控了 Act A的生物活性。本實(shí) 驗(yàn)結(jié)果顯示，A+F組E2分泌量明顯低于Act A組，提示FS可能拮抗了 Act A 對卵巢E2分泌的促進(jìn)作用。朱輝等13在對離體大鼠卵泡體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，也 觀察到相同的效應(yīng)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 Vanderhyden BC, Macdo

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